專(zhuān)利名稱：一種啟動(dòng)子BgIosP526及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因調(diào)控領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子，具體是水稻的啟動(dòng) 子BgIosP526，以及所述啟動(dòng)子的制備方法。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物或 雙子葉植物中目的基因表達(dá)的用途。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、 結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效 率表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類(lèi)組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng) 子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子。另一種高效的組成型啟動(dòng)子CsVMV是從木薯 葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV 35S啟動(dòng)子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV 35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也 取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。單子葉植物基因中常見(jiàn)的啟動(dòng)子有山bi啟動(dòng)子(Plant ubiquitin promoter)、 Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 啟動(dòng)子(Maize alcohol dehydrogenase lpromoter)。Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目 前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的WDi-I啟動(dòng)子、水稻 泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素WdBI啟動(dòng)子、煙草泛素Ubi. U4啟動(dòng)子、 馬鈴薯泛素證丨7啟動(dòng)子、番茄泛素W^il-I啟動(dòng)子，大麥泛素Mubl啟動(dòng)子。玉米泛素W^i-I 啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻 和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強(qiáng)組成 型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過(guò)其他單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉 植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。Adh-I啟動(dòng)子調(diào)控乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)基因，對(duì)植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-I啟動(dòng)子對(duì)單子葉植物特別是谷類(lèi)植物如水稻、燕麥 和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子 提高10-50倍。Adh-I啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對(duì)絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào) 控效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類(lèi)群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強(qiáng)效啟動(dòng)子，能夠調(diào)控植物高效率表達(dá) 具有特殊性狀的外源基因，對(duì)優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強(qiáng)效啟動(dòng)子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了許多單子葉植物的啟動(dòng)子。此外，雙子 葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng) 子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作用。盡管已經(jīng)有上述已知的單子葉植物的啟動(dòng)子，本發(fā)明人通過(guò)對(duì)水稻基因組的深入 研究，提供了一種新的單子葉植物啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物和雙子葉 植物中目的基因表達(dá)，同時(shí)為研究單子葉植物和雙子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新 的工具和選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面中，本發(fā)明提供了一個(gè)具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子基因BgIosP526。所述 啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。GGTGCGTAGGGAACACGCATGATTTTTGAATTGCTGGCACATAATTTTATCATTAGAAACTGGAATGCA ACATGTACCCTTTGTCATGGTTTCTTTCCGAGACATTGCACTGTTTTTTTTAATCCTATCATTATCATAATGCCAAG AACTGGTCACCAACCAGCAATTTGCATCATGGTTAGTTGAGCTGTCCCCATGTATCAATAGGTGCATTGTATTGGTC CGAAATATAAATGCAGTGGATGCAAACCTATCTCATGGCCGTCAACAAAAGAAATCAAAAGGGAAATGCACCATCTT ATATCTCCAGTTTATATGAACAGATTGGATAAGATCATAAGATCAAGTGGTTTATATTATTTTGAGGAATATAACAT GGATTCATCCTAATCACTCGTCTAGGCAGTATGTGTATTCATGATGGATATGGTACTATACTACGGAGTTTTTTCTT CACAAAATAACCTGTTATTTTGACCTCCAACCAAACACGAATTATACCAAAAATTGGGTTATTTCATCTATAGTACA ACTCTATTATAAACATGCAGTAAATTATCCTACACATATACCAAAATTCAAGTGTAATAATCCTAATACACAGACTT AAAAAACAAACTATTTCCTTTTTAAGAAAAGGAAAACCATTTTTTTAACGGAAGGAAAACAAATTCGGGTCAAGGCG GAAGCCAGCGCGCCACCCCACGTCAGCAAATACGGAGGCGCGGGGTTGACGGCGTCACCCGGTCCTAACGGCGACCA ACAAACCAGCCAGAAGAAATTACAGTAAAAAAAAAGTAAATTGCACTTTGATCCACCTTTTATTACCTAAGTCTCAA TTTGGATCACCCTTAAACCTATCTTTTCAATTTGGGCCGGGTTGTGGTTTGGACTACCATGAACAACTTTTCGTCAT GTCTAACTTCCCTTTCAGCAAACATATGAACCATATATAGAGGAGATCGGCCGTATACTAGAGCTGATGTGTTTAAG GTCGTTGATTGCACGAGAAAAAAAAATCCAAATCGCAACAATAGCAAATTTATCTGGTTCAAAGTGAAAAGATATGT TTAAAGGTAGTCCAAAGTAAAACTTATAGATAATAAAATGTGGTCCAAAGCGTAATTCACTCAAAAAAAATCAACGA GACGTGTACCAAACGGAGACAAACGGCATCTTCTCGAAATTTCCCAACCGCTCGCTCGCCCGCCTCGTCTTCCCGGA AACCGCGGTGGTTTCAGCGTGGCGGATTCTCCAAGCAGACGGAGACGTCACGGCACGGGACTCCTCCCACCACCCAA CCGCCATAAATACCAGCCCCCTCATCTCCTCTCCTCGCATCAGCTCCACCCCCGAAAAATTTCTCCCCAATCTCGCG AGGCTCTCGTCGTCGAATCGAATCCTCTCGCGTCCTCAAGGTACGCTGCTTCTCCTCTCCTCGCTTCGTTTCGATTC GATTTCGGACGGGTGAGGTTGTTTTGTTGCTAGATCCGATTGGTGGTTAGGGTTGTCGATGTGATTATCGTGAGATG TTTAGGGGTTGTAGATCTGATGGTTGTGATTTGGGCACGGTTGGTTCGATAGGTGGAATCGTGGTTAGGTTTTGGGA
4TTGGATGTTGGTTCTGATGATTGGGGGGAATTTTTACGGTTAGATGAATTGTTGGATGATTCGATTGGGGAAATCGG TGTAGATCTGTTGGGGAATTGTGGAACTAGTCATGCCTGAGTGATTGGTGCGATTTGTAGCGTGTTCCATCTTGTAG GCCTTGTTGCGAGCATGTTCAGATCTACTGTTCCGCTCTTGATTGAGTTATTGGTGCCATGGGTTGGTGCAAACACA GGCTTTAATATGTTATATCTGTTTTGTGTTTGATGTAGATCTGTAGGGTAGTTCTTCTTAGACATGGTTCAATTATG TAGCTTGTGCGTTTCGATTTGATTTCATATGTTCACAGATTAGATAATGATGAACTCTTTTAATTAATTGTCAATGG TAAATAGGAAGTCTTGTCGCTATATCTGTCATAATGATCTCATGTTACTATCTGCCAGTAATTTATGCTAAGAACTA TATTAGAATATCATGTTACAATCTGTAGTAATATCATGTTACAATCTGTAGTT CATCTATATAATCTATTGTGGTA ATTTCTTTTTACTATCTGTGTGAAGATTATTGCCACTAGTTCATTCTACTTATTTCTGAAGTTCAGGATACGTGTGC TGTTACTACCTATCTGAATACATGTGTGATGTGCCTGTTACTATCTTTTTGAATACATGTATGTTCTGTTGGAATAT GTTTGCTGTTTGATCCGTTGTTGTGTCCTTAATCTTGTGCTAGTTCTTACCCTATCTGTTTGGTGATTATTTCTTGC AGATGCAGATC(SEQ ID NO :1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷 酸序列的啟動(dòng)子a、SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ ID NO 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；以及e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在第二方面中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟 動(dòng)子以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來(lái)源相同或者 不同。在第三方面中，本發(fā)明提供了一種載體，所述載體包含本發(fā)明的啟動(dòng)子或核酸構(gòu) 建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒是PMD18-T質(zhì)?；騪8質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體序列位于KpnI酶切位點(diǎn)和SbfI酶切位點(diǎn)之間。在第四方面中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體或載體的重 組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述菌株是根癌農(nóng)桿菌EHA105-P526。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物愈傷組織是水稻愈傷組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物 是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或 煙草NC89。在第五方面中，本發(fā)明提供了一種制備SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列的方法，包 括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物是SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 擴(kuò)增引物5’端還連接一段限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基。例如，所述擴(kuò)增引物是SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，其中SEQ ID NO 4和SEQID NO 5的5，端分別含有KpnI酶切位點(diǎn) 和SbfI酶切位點(diǎn)。
在第六方面中，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO 1所示的序列用作啟動(dòng)子的用途。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述用途是調(diào)控植物中目的基因表達(dá)的用途，所述目的基因優(yōu)選是GUS。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻 或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第七方面中，本發(fā)明提供了一種調(diào)控基因表達(dá)方法，所述方法包括步驟將本發(fā) 明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化至植物，優(yōu)選轉(zhuǎn)化至植物愈傷組織，使所述 啟動(dòng)子位于所述基因的5’端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述的啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多拷 貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。在第八方面中，本發(fā)明提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物 的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細(xì)胞、植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物是單子葉植 物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第九方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、植 物愈傷組織、植物外植體或植物用于調(diào)控植物目的基因表達(dá)和育種的用途，所述植物是單 子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草 NC89。保藏信息培養(yǎng)物名稱煙草NC89種子。保藏日期2010年11月12日。保藏單位湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心(CCTCC)。保藏編號(hào)CCTCCNO :P201017。


圖1示出質(zhì)粒pCAMBIA-1301的圖譜。圖2示出含有需要構(gòu)建的多克隆位點(diǎn)及GUS序列的p8質(zhì)粒的圖譜。圖3示出水稻愈傷組織gus染色的照片。以含有啟動(dòng)子的p8+P5^重組載體的重 組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。作為對(duì)照，經(jīng)不含啟動(dòng)子 的P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化(左)。圖4示出水稻轉(zhuǎn)基因苗的根gus染色的照片。以含有啟動(dòng)子的p8+P5^5重組載體 的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。作為對(duì)照，經(jīng)不含啟動(dòng) 子的P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化(左)。圖5示出水稻轉(zhuǎn)基因苗葉gus染色照片。以含有啟動(dòng)子的p8+P5^重組載體的重 組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。作為對(duì)照，經(jīng)不含啟動(dòng)子的 P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉經(jīng)GUS染色后顏色未發(fā)生變化(左)。圖6示出轉(zhuǎn)基因煙草的葉gus染色的顯微照片(光學(xué)顯微鏡，X 3)。以重組根癌 農(nóng)桿菌EHA105-P5^轉(zhuǎn)化的煙草的葉經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。對(duì)照煙草的葉經(jīng)⑶S染色 后顏色未發(fā)生變化(左)。
圖7示出轉(zhuǎn)基因煙草根gus染色的顯微照片(光學(xué)顯微鏡，Χ； )。以重組根癌農(nóng) 桿菌EHA105-P5^介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的煙草的根經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色(右)。對(duì)照煙草的根經(jīng)⑶S染 色后顏色未發(fā)生變化(左)。
具體實(shí)施例方式在第一方面中，本發(fā)明提供了一個(gè)具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子基因BgIosP526。在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列的啟動(dòng) 子a、SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ ID NO 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明中，所述的啟動(dòng)子來(lái)源于單子葉植物。具體而言，所述單子葉植物為水 稻，例如所述水稻為日本晴(Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare)。本發(fā)明的啟 動(dòng)子可以調(diào)控基因在植物、特別是單子葉植物中的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述 單子葉植物為稻屬。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述稻屬是水稻。在本發(fā)明的又一實(shí)施 方案中，所述為水稻日本晴。本發(fā)明的啟動(dòng)子還可以控制基因在雙子葉植物，所述雙子葉植物有例如煙草，大 豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花生等。煙草是典型的基因工程模式植物。在實(shí)施例中選擇煙草進(jìn) 行轉(zhuǎn)基因研究，以驗(yàn)證本發(fā)明的啟動(dòng)子在雙子葉植物中的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該啟動(dòng)子能 在轉(zhuǎn)基因煙草中起作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知獲得一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)序列的方法。而且，為了實(shí)現(xiàn)啟 動(dòng)子對(duì)基因的調(diào)控，可以將所述基因的互補(bǔ)序列連接至所述啟動(dòng)子的互補(bǔ)序列的5’形成核 酸構(gòu)建體，然后獲得所述核酸構(gòu)建體的互補(bǔ)序列，從而可以利用所述核酸構(gòu)建體的互補(bǔ)序 列實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子對(duì)一個(gè)基因的調(diào)控。利用核苷酸雜交進(jìn)行核苷酸的鑒定和篩查是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。典型地，“雜 交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來(lái)分類(lèi)。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié) 合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5°C (低 于探針Tm 5°C )；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以 下約10-20°C ；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25°C。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件 可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極 低嚴(yán)緊性；3XSSC =低至中等嚴(yán)緊性；IXSSC =中等嚴(yán)緊性；0. 5XSSC =高等嚴(yán)緊性。從 功能上說(shuō)，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列； 而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來(lái)形成雜交體，例如， 選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。為便于說(shuō)明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預(yù)洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 雜交過(guò)夜；隨后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過(guò)2-45個(gè)，或者不超過(guò)2-30個(gè)，或者不超過(guò)3-20個(gè)，或者不超 過(guò)4-15個(gè)，或者不超過(guò)5-10個(gè)，或者不超過(guò)6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的置 換、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基 的置換、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的 啟動(dòng)子活性。通過(guò)一種多核苷酸進(jìn)行說(shuō)明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO=I的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO :1的參考核苷酸序列之每100個(gè) 核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核 苷酸序列與參考序列相同。換句話說(shuō)，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些 核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核 苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5%。參 考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5或3末端位置，或在這些末端位置之間的 任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考 序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可 以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開(kāi)序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本 文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
在第二方面中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟 動(dòng)子以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來(lái)源相同或者 不同。在本文中，所述核酸構(gòu)建體可以包含SEQ ID NO 1所示的啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序 列的核苷酸序列。所述核酸構(gòu)建體可以通過(guò)將SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序 列與所需的其他序列可操作地連接進(jìn)行制備。或者，所述核酸構(gòu)建體可以通過(guò)直接合成制備。在第三方面中，本發(fā)明提供了一種載體，所述載體包含本發(fā)明的啟動(dòng)子或核酸構(gòu) 建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒是PMD18-T質(zhì)?；騪8質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體序列位于KpnI酶切位點(diǎn)和SbfI酶切位點(diǎn)之間。構(gòu)建質(zhì)粒的方法是本 領(lǐng)域中已知。例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中構(gòu)建了 PMD18-T質(zhì)粒和p8質(zhì)粒。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T SimpleVecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達(dá)載體包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在第四方面中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體或載體的重 組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。將質(zhì) 粒導(dǎo)入細(xì)菌的方法是本領(lǐng)域中已知的。例如，所述重組細(xì)胞可以通過(guò)將含有本發(fā)明啟動(dòng)子 的所述重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞而得到。在本發(fā)明的實(shí)施例中，質(zhì)粒被導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)，具體是根癌農(nóng)桿菌 EHA105-P526。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞 LBA4404、EHA105、GV3101 等在第五方面中，本發(fā)明提供了一種制備SEQ ID NO :1所示的啟動(dòng)子序列的方法，包 括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增?？梢允褂帽景l(fā)明中公知的方法制備SEQ ID NO 1所示的啟動(dòng)子，例如化學(xué)合成法 直接從頭合成或者從基因組中擴(kuò)增所述啟動(dòng)子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物根 據(jù)SEQ ID NO :1在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 根據(jù)待擴(kuò)增的目的核苷酸序列按照堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物對(duì)。例如，本發(fā)明 的弓丨物可以是 GGTGCGTAGGGAACACGCATG (SEQID NO 2)和 GATCTGCATCTGCAAGAAATAATCA (SEQ ID NO :3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增引物5’端還連接一段限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù) 堿基。例如，在實(shí)施例中使用的擴(kuò)增引物是SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，其中SEQ ID NO: 4和SEQID NO 5的5，端分別含有KpnI酶切位點(diǎn)和SbfI酶切位點(diǎn)。在擴(kuò)增引物5，端連 接一段限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基是基因擴(kuò)增中常用的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通 過(guò)常規(guī)的方法實(shí)現(xiàn)。在第六方面中，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO 1所示的序列用作啟動(dòng)子的用途。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述用途是調(diào)控植物中目的基因表達(dá)的用途，所述目的基因優(yōu)選是GUS。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻 或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第七方面中，本發(fā)明提供了一種調(diào)控基因表達(dá)方法，所述方法包括步驟將本發(fā) 明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化至植物，優(yōu)選轉(zhuǎn)化至植物愈傷組織，使所述啟動(dòng)子位于所述基因的5’端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物， 優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。將核苷酸序列、構(gòu)建核酸構(gòu)建體、質(zhì)?；蚣?xì)菌導(dǎo)入植物可以使用本領(lǐng)域中常用的 方法。例如，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn) 化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本 發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當(dāng)然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另一種方法是粒 子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開(kāi)發(fā)。另外，還可以采用的 轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來(lái)篩選和再生整合 有表達(dá)單元的植株。為實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達(dá)的目的，本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以以單拷貝和/或多 拷貝的形式應(yīng)用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動(dòng)子聯(lián)用。在第八方面中，本發(fā)明提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物 的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細(xì)胞、植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物是單子葉植 物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。在第九方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、植物 愈傷組織或植物用于調(diào)控植物目的基因表達(dá)和育種的用途。本發(fā)明的啟動(dòng)子可成為一種新 的啟動(dòng)子作為單子葉植物、尤其是水稻轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子，為開(kāi)展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩 選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而極大的縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。本發(fā) 明的啟動(dòng)子可廣泛用于培育水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等單子葉植物。例如， 可使用本領(lǐng)域中常用的基因重組方法，將本發(fā)明的啟動(dòng)子導(dǎo)入植物基因組中希望表達(dá)量增 加的目標(biāo)基因5’端，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的表達(dá)增加。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“單子葉植物”，具體地，可以為禾本科植物，更具體地，可以為稻 屬植物例如水稻，包括但不限于，例如包括但不限于水稻、小麥、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麥等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“水稻”包括但不限于，日本晴，中花9、中花10、中花11、臺(tái)北 309、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、豐優(yōu)22，黔優(yōu)88、II優(yōu)416、II優(yōu)107、II優(yōu) 128,11優(yōu)718、準(zhǔn)兩優(yōu)527、川農(nóng)1號(hào)、雜0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品種均可購(gòu)自安徽徽商農(nóng)家福有限公 司)等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雙子葉植物”，具體地，可以為茄科植物，更具體地，可以為煙 草屬植物(煙草)，包括但不限于 K326、K346, K394、NC82、NC89、G140、G28, G80、中煙 90、 Coker 176, CV87 等等實(shí)施例下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明 具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
10所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 :P526啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和dMD18_T+P526重組載體的構(gòu)津PCR擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄 號(hào)DP320-(^)提取水稻日本晴(已在申請(qǐng)?zhí)枮?00910238992.0、發(fā)明名稱為“一種啟動(dòng)子 BgIosP587、其制備方法及用途”的發(fā)明申請(qǐng)中保藏，并于2010年9月22日公開(kāi)，保藏編號(hào) 為CCTCC P200910)的基因組DNA，根據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾 設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)KpnI和保護(hù)堿基，下游引 物R1，加限制性酶切位點(diǎn)SbfI和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使 用高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。
表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
組成體積(μ )基因組DNA0.2dNTPs ( 2.5 mM )2IOx Ex Buffer (含鎂離子)2.5引物 Fl ( 50 μΜ )1引物 Rl ( 50 μΜ )1Ex taq0.2ddH20 (雙蒸水)補(bǔ)足至總體積25 μ PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，然后以94°C變性45秒，55 °C退火50秒，72 °C 延伸90秒，進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。其中，上游引物Fl :GGGGTACCGGTGCGTAGGGAACACGCATG,其中下劃線代表KpnI酶切 位點(diǎn)，(SEQ ID NO 4)。下游引物Rl :GCCCTGCAGGATCTGCATCTGCAAGAAATAATCA,其中下劃線代表 SbfI 酶切 位點(diǎn)，(SEQ ID NO :5)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小為2380bp左右的條帶，使用 TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209_03)進(jìn)行純化回收。pMD18-T+P526重組載體的構(gòu)建將如上述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序，與SEQ ID NO :1所示序列比較，證明其是準(zhǔn)確的。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12*solution I 5μ 1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(回收插入片段)IOng 20ng，根據(jù)其濃度定ddH20 補(bǔ)足至 10 μ 1在16°C下，在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8小時(shí)以上，得到 PMD18-T+P526重組載體。將經(jīng)過(guò)上述連接后的產(chǎn)物按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯化 鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞100μ 1 DH5a (中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可購(gòu)自例如上海生工)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的連接產(chǎn)物，即pMD18-T+P5^重組載體， 輕輕攪勻，冰浴30分鐘，42°C熱激60秒，冰浴5分鐘，加入600 μ 1在4°C下預(yù)冷的SOC培 養(yǎng)基(具體配方詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，在37°C下于220rpm復(fù)蘇 45分鐘，8000rpm離心30秒，去上清，留取150μ 1，用剩下的150μ 1上清重懸沉淀后的混合 物，輕輕吹勻，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具體配方詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三 版，科學(xué)出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16小時(shí) M小時(shí)。獲得含有pMD18-T+P5^克隆載體的重 組大腸桿菌，命名為DH5 α -Ρ526。深圳華大基因科技有限公司對(duì)pMD18_T+P5^克隆載體中 的進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，獲得的pMD18_T+P5^克隆載體中啟動(dòng)子序列與SEQ IDNO 1 相同正確。實(shí)施例2 載體-D8+P526重組載體的構(gòu)建按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號(hào)DP103_03)的操作手冊(cè)，從實(shí)施例1 構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有啟動(dòng)子的大腸桿菌DH5 α -Ρ526中提取帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的 克隆載體PMD18-T+P526 ；純化后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶KpnI和SbfI進(jìn)行酶切，回收相應(yīng) 的啟動(dòng)子插入片段，并分別與Ρ8質(zhì)粒用相同的限制性內(nèi)切酶酶切后回收的載體大片段進(jìn) 行連接。將所得連接產(chǎn)物ρ8+Ρ5^5重組載體轉(zhuǎn)化按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué) 出版社)所示氯化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，在37°C下倒置培養(yǎng)16 M小時(shí)，待轉(zhuǎn)化 子長(zhǎng)出菌落后，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切鑒定。p8質(zhì)粒構(gòu)建本發(fā)明中所使用的p8質(zhì)粒是由pCAMBIA-1301質(zhì)粒(中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 董楊提供；或者可從例如上海國(guó)瑞基因科技有限公司購(gòu)得，該公司的pCAMBIA-1301質(zhì)粒的 原始來(lái)源是 CAMBIA Bios (biological open source) Licensee, Australia)按照如下方式 改造并構(gòu)建的，具體說(shuō)明如下用Kpn I/Nco I (NEB)雙酶切質(zhì)粒pCAMBIA-1301 (參見(jiàn)圖1)，回收大片段。根據(jù)所 采用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)合成如下序列GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG(SEQ IDNO 6)(包 含的酶切位點(diǎn)是 Kpn I/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I)，用 Kpn I/Nco I雙酶切后回收，與上述所回收的大片段連接后轉(zhuǎn)化toplO細(xì)胞(中國(guó)科 學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可購(gòu)自例如北京索萊寶科技有限公司)。用引物 GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO 7)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQ ID NO :8)篩選轉(zhuǎn)化子， 通過(guò)PCR檢測(cè)方法，帶有擴(kuò)增片段為350bp的轉(zhuǎn)化子即為含有需要構(gòu)建的多克隆位點(diǎn)及GUS 序列的P8質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子(參見(jiàn)圖2)。所述p8質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)和⑶S序列的長(zhǎng)度2353堿基，如SEQ ID N0:9所示GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAG GCACCCCAGGCTTTACcacaggaaacagctatgaccatgattac1gaattc1gagctc1ggtacc^agctt|ac1
lTAGTlC^TGCAG|G|TCTAGA|GGATCC'r.TCr.AC|C. 1 TCClTAGATCTG. i(/(iGTA. Ι. 'ΠΤ 7' J(777777r7r( r/C.r/77丁(77(/(廠廠廠Κ, /.ΙΓ (^7777(..71(:77777)17777:/77(.^(./(777(; AUlTTl '777 I. unaATi ΛΤΤ ΤΠ \Λ (； 1 Tl C;G TA7Xi(；TC,ΤΛΛΛΤΛ Μ'AT UiCTT ΤΑΑΓ/'(λΛΤΛΑ7( (^ΙΤΛ Τ^^
cga cga ctcgtccgtcctgta gaaa ccccaa cccgtgaaa tcaaaaaa ctcga cggc ctgtgggca ttca gtctggatcgcgaaaa c tgtgga attgatca gcgttggtgggaa a gcgcgttacaa gaaa gccgggcaattgctgtgcca ggca gttttaa cgatcagttc gccgatgcagatattcgtaattatgcgggcaacgtctggtatcagcgcgaagtcttta taccgaaaggttgggcaggccagcgtatcgtgctgcgtttcgatgcggtcactcatt acggcaaagtgtgggtcaataatcaggaagtgatggagcatcagggcggctatacgc catttgaagccgatgtcacgccgtatgttattgccgggaaaagtgtacgtatcaccgt ttgtgtgaa caa cgaa ctgaa ctggca ga ctatcccgccgggaa tggtga ttaccga cgaaaa cggcaa gaaaaa gca gtctta cttccatga tttctttaa cta tgccggaa tcc atcgcagcgtaatgctctacaccacgccgaacacctgggtggacgatatcaccgtgg tga cgcatgtcgcgcaa ga ctgtaa cca cgcgtctgttga ctggca ggtggtggcc aatggtgatgtcagcgttgaactgcgtgatgcggatcaacaggtggttgcaactgga caa ggcacta gcggga ctttgcaagtggtgaatccgca cctctggcaa ccgggtga aggttatctctatgaactcgaagtcacagccaaaagccagacagagtctgatatctac ccgcttcgcgtcggcatccggtcagtggcagtgaagggccaacagttcctgattaa cca caaa ccgttcta cttta ctggctttggtcgtcatgaa ga tgcgga ctta cgtggc aaaggattcga taa cgtgctga tggtgca cga cca cgca ttaatgga ctggattggg gccaa ctccta ccgta cctcgca tta ccctta cgctgaa ga ga tgctcga ctgggca gatgaacatggcatcgtggtgattgatgaaactgctgctgtcggctttcagctgtctt ta ggcattggtttcgaa gcgggcaacaa gccgaaa gaa ctgta ca gcgaa ga ggca gtcaa cggggaaactca gcaa gcgca ctta ca ggcga ttaaa ga gctga ta gcgcgt ga caaaaacca cccaagcgtggtgatgtgga gtattgccaa cgaa ccggata cccgt ccgcaa ggtgca cgggaa ta tttcgcgccactggcggaa gcaa cgcgtaaa ctcga cccga cgcgtccga tca cctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctca ca ccga ta c
catcagcgatctctttgatgtgctgtgcctgaaccgttattacggatggtatgtccaa a gcggcga tttggaaa cggca ga gaa ggta ctggaaaaa gaacttctggcctggca ggagaaactgcatcagccgattatcatcaccgaatacggcgtggatacgttagccgg gctgca ctcaatgta ca ccga catgtggagtgaa ga gtatca gtgtgcatggctgga tatgtatcaccgcgtctttgatcgcgtcagcgccgtcgtcggtgaacaggtatggaa tttcgccga ttttgcga cctcgcaa ggca ta ttgcgcgttggcggtaa caa gaaa gg ga tcttca ctcgcga ccgcaaa ccgaagtcggcggcttttctgctgcaaaaa cgctg gactggcatgaacttcggtgaaaaaccgcagcagggaggcaaacaagctagccaccaccaccaccaccacgtgtga (SEQ ID NO :9)。如上序列所示本發(fā)明中所構(gòu)建的p8質(zhì)粒，其多克隆位點(diǎn)中的EcoR I/Sac I/ Kpn I/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/Sal I/Nco I 限制性酶切位點(diǎn)分別 用加框和下劃線表示，篩選轉(zhuǎn)化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT (SEQ ID NO -j)/ GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQID NO 8)用雙下劃線表示，⑶S序列用斜體表示，其內(nèi)含子序列 分別用斜體加底紋示出。重組載體D8+P526的構(gòu)建根據(jù)限制性內(nèi)切酶KpnI和SbfI操作說(shuō)明，按照如下條件處理實(shí)施例1中所得到
13的克隆載體PMD18-T+P526，以及如上所述構(gòu)建的p8質(zhì)粒。其中，克隆載體pMD18_T+P526及p8質(zhì)粒的酶切條件如下酶切體系50 μ 1無(wú)菌蒸餾水34. 8μ1IOXbuffer H5μ 1KpnI0.1 μl(10U)SbfI0.1 μl(10U)克隆載體pMD18-T+P526 或 ρ8 質(zhì)粒 10 μl ( < 1000ng)使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209_03)分別回收經(jīng)酶切 的P8質(zhì)粒，以及啟動(dòng)子插入片段，根據(jù)T4連接酶(TaKaRa，D2011A)操作說(shuō)明，按照如 下條件進(jìn)行連接連接體系10 μ 1IOXiM 緩沖液1μl酶切后的ρ8質(zhì)粒1μl (20ng)回收的啟動(dòng)子插入片段 10 20ng，根據(jù)其濃度確定無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)足至9. 5 μlΤ4 連接酶(TaKaRa，D2011A)0. 5 μ 1Τ4緩沖液冰上融化，酶切后的ρ8質(zhì)粒載體加入量約20ng，本發(fā)明中的片段 加10ng。于16°C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8小時(shí)以上。將100 μ 1氯化鈣法制得的感受態(tài)細(xì)胞DH5 α從超低溫冰箱取出，冰上融化后，加 入10 μ 1上面的連接產(chǎn)物，輕輕攪勻，冰浴30分鐘，42 V熱激60秒，冰浴5分鐘，加入600 μ 1 4°C預(yù)冷的S0C,在37°C下以220rpm復(fù)蘇45分鐘，8000rpm離心30秒，去上清，留取150 μ 1， 輕輕吹勻，玻璃珠涂布LB (kan)，37°C倒置培養(yǎng)16 M小時(shí)。得到重組載體p8+P526。分別以Fl (即SEQ ID NO 4)和Rl (即SEQ ID NO 5)為引物對(duì)所得重組載體 P8+P526進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確證所得重組載體p8+P526中含有所需啟動(dòng)子P5^。通過(guò)KpnI 和SbfI酶切篩選含有重組載體p8+P5^轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例3重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P526細(xì)胞的制備將如實(shí)施例2所述方法構(gòu)建的p8+P5^重組載體和作為對(duì)照的p8質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)中所述氯化鈣方法制備的根癌農(nóng)桿菌 EHA105(已在申請(qǐng)?zhí)枮?00910238992. 0、發(fā)明名稱為“一種啟動(dòng)子BgIosP587、其制備方法 及用途”的發(fā)明申請(qǐng)中保藏，并于2010年9月22日公開(kāi)，保藏編號(hào)為CCTCC M 209315)的 感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下將根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105于超低溫冰箱中取出，置于冰上解凍。融化后， 分別加入5 μ 1的ρ8+Ρ5^重組載體和ρ8質(zhì)粒以及作為對(duì)照的ρ8空載體，輕輕混勻，冰浴 10分鐘，放入液氮中冷凍5分鐘，37°C解凍5分鐘，加入800 μ 1常溫的LB液體培養(yǎng)基，在
下以160rpm搖晃復(fù)蘇3小時(shí)，以8000rpm離心30秒，吸去上清，留下200 μ 1吹吸均勻， 涂布于加有卡那霉素和利福平(50mg/l Kan, 10mg/lRif)的YM固體培養(yǎng)基平板上(具體配 方參見(jiàn)表幻。倒置培養(yǎng)2-3天。以Fl (即SEQ ID NO 4)和Rl (即SEQ ID NO 5)為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)和通過(guò)KpnI/Sbfl酶切篩選轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)增出約2380bp左右條帶和酶切出約2380bp左右條帶的為重組載體 P8+P526的重組根癌農(nóng)桿菌。本發(fā)明中，按照如上述方法得到的帶有重組載體P8+P526的重組農(nóng)桿菌，命名為 重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P526。按照本發(fā)明所述方法，得到的帶有p8質(zhì)粒的對(duì)照重組農(nóng)桿菌，命名為重組根癌農(nóng) 桿菌 EHA105-p8。實(shí)施例4 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化按照如下步驟誘導(dǎo)水稻愈傷組織，并分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105_P5^和重組 根癌農(nóng)桿菌EHA105-p8轉(zhuǎn)化所述愈傷組織。1)將水稻日本晴種子去殼，70%乙醇表面消毒30秒，然后用有效氯1.5%的次氯 酸鈉消毒30分鐘，期間劇烈搖動(dòng)，消毒后用滅菌水清洗5次；將消毒后的種子置于N6D培養(yǎng) 基(具體配方參見(jiàn)表3)上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培養(yǎng)3 4周；2)選取活躍生長(zhǎng)的愈傷組織(黃白色，干燥，直徑1 3mm)，在新N6D培養(yǎng)基上 四.5°C光照培養(yǎng)3天；3)分別挑取如實(shí)施例3所構(gòu)建的重組根癌農(nóng)桿菌單菌落(重組根癌農(nóng)桿菌 EHA105-P526或重組根癌農(nóng)桿菌EHA105_p8)，于添加卡那霉素和利福平(50mg/lKan，IOmg/ 1 Rif)的YM固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度分別刮取上述重組根癌農(nóng)桿菌置 于添加了 30μ1 IOOmM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30mlAAM培養(yǎng)基(具體配方 參見(jiàn)表4)中，溫和重懸所述重組根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P5^或重組根 癌農(nóng)桿菌EHA105-p8)；4)將繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于滅菌培養(yǎng)皿中；將如步驟3制備的重組根癌農(nóng)桿菌 懸液倒入培養(yǎng)皿中，將愈傷組織浸入其中15分鐘；5)倒掉重組根癌農(nóng)桿菌懸液，將愈傷組織用滅菌吸水紙吸掉多余的液體；于 N6-AS培養(yǎng)基(具體配方參見(jiàn)表5)上放一張滅菌濾紙，加Iml如上述含AS的AAM培養(yǎng)基， 將愈傷組織轉(zhuǎn)移至濾紙上；密封培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)48 60小時(shí)；6)將受感染的愈傷組織置于50ml滅菌管中，用滅菌水搖動(dòng)清洗，直至上清液變澄 清；將愈傷組織浸泡于含500mg/l羧芐青霉素(Carb)的無(wú)菌蒸餾水中以殺死重組根癌農(nóng)桿 菌；用滅菌吸水紙除去愈傷組織上多余的水分，然后將其轉(zhuǎn)移至含lmg/1潮霉素B(HmB)和 50mg/l Carb的N6-AS培養(yǎng)基上；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3 4周。實(shí)施例5 水稻愈傷組織中的GUS的表達(dá)為檢測(cè)經(jīng)過(guò)實(shí)施例4所述轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織中目的基因⑶S的表達(dá)情況，按照 Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (6) :742-751 所述的方 法，對(duì)分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-P5^或重組農(nóng)桿菌EHA105-p8轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織 進(jìn)行染色。GUS 染色液的配方(Iml) :610 μ 1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(pH = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2MNaH2P04 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc。將分別用重組根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105_Ρ5^或重組根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105_ρ8轉(zhuǎn)化的水稻 愈傷組織浸泡在GUS染色液中，37°C保溫至出現(xiàn)藍(lán)色，拍照，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)含有啟動(dòng)子的p8+P5^重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(圖3右)經(jīng)染色后呈現(xiàn) 藍(lán)色，經(jīng)不含有啟動(dòng)子的P8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(作為對(duì)照，圖 3左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。結(jié)果顯示，本發(fā)明的啟動(dòng)子對(duì)⑶S基因表達(dá)具 有調(diào)控作用。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)基因水稻苗中⑶S的表汰將實(shí)施例4中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含50mg/l潮霉素B (HmB)的MS-R分化培養(yǎng) 基(具體配方見(jiàn)表6)分化苗；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3-4周；待幼苗長(zhǎng)至 3-4cm時(shí)轉(zhuǎn)移到含50mg/l潮霉素B (HmB)的1/2MS生根培養(yǎng)基(具體配方參見(jiàn)表7)進(jìn)行生 根篩選。轉(zhuǎn)基因水稻苗的GUS染色過(guò)程同實(shí)施例5中愈傷組織的染色過(guò)程。結(jié)果如圖4、5 所示，經(jīng)含有啟動(dòng)子的p8+P5^5重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根、葉(圖 4、5右)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，經(jīng)不含啟動(dòng)子的p8質(zhì)粒重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的 根、葉(作為對(duì)照，圖4、5左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。結(jié)果顯示，本發(fā)明的啟 動(dòng)子對(duì)⑶S基因表達(dá)具有調(diào)控作用。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因煙草苗中⑶S表達(dá)1.煙草無(wú)菌苗獲得 將煙草NC89種子(2010年11月12日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 保藏編號(hào)為CCTCC N0:P201017，保藏單位地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072)浸 泡將煙草種子裝入1. 5ml的離心管中(< 50粒/管)，加入Iml無(wú)菌蒸餾水，用移液器吸 打幾次，更換無(wú)菌蒸餾水后，在常溫下浸泡M小時(shí)； 煙草種子消毒用移液器吸出浸泡種子的水，加入Iml 75%的酒精浸泡30秒， 用移液器吸出酒精；加入Iml 10% H2O2浸泡10分鐘后，用移液器吸出H2A ； 洗滌用無(wú)菌蒸餾水清洗五次，每次加入Iml無(wú)菌蒸餾水搖動(dòng)1分鐘； 接種無(wú)菌濾紙吸干種子表面的水分，再用吸頭或無(wú)菌牙簽接種于MS固體培養(yǎng) 基(具體配方見(jiàn)表8)上萌發(fā)，每皿約10粒，置于光照培養(yǎng)室(16小時(shí)光/8小時(shí)暗) 培養(yǎng)一周，光照強(qiáng)度為20001χ(本實(shí)驗(yàn)所有的光照培養(yǎng)材料均在此光照強(qiáng)度下培養(yǎng))； 轉(zhuǎn)接待長(zhǎng)出幼苗后，轉(zhuǎn)入新鮮MS固體培養(yǎng)基，每瓶(Φ 6cm，30ml培養(yǎng)基/瓶)3 株煙草小苗，28°C光照培養(yǎng)室(16小時(shí)光/8小時(shí)暗)培養(yǎng)約5周，獲得煙草無(wú)菌苗。2.煙草無(wú)菌苗的繼代和擴(kuò)繁 剪去煙草無(wú)菌苗的葉片和根，將莖桿剪成帶有腋芽的莖段Ocm-3cm)，然后將其 形態(tài)學(xué)下端垂直插入到新鮮MS固體培養(yǎng)基(腋芽不能插入培養(yǎng)基里)； 每瓶接種一個(gè)帶有腋芽的莖段外植體，置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)約5周，作為 待轉(zhuǎn)化材料使用。3.侵染前菌液的制備 挑取實(shí)施例3所得的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105_P5^單菌落，接種到IOml YM液體 培養(yǎng)基(含Kan 50mg/L, Rif30mg/L)(具體配方參見(jiàn)表9)，在下以250rpm振蕩過(guò)夜， 待菌液混濁，還未出現(xiàn)沉淀時(shí)，將此菌液置4°C保存； 取保存于4°C的菌液20μ 1，接種于IOml YM液體培養(yǎng)基(含Kan 50mg/L, Rif30mg/L)于50ml離心管中，250rpm振蕩過(guò)夜，待菌液混濁，還未出現(xiàn)沉淀時(shí)，停止培養(yǎng)； 取上述菌液3ml加入到50ml YM液體培養(yǎng)基(具體配方參見(jiàn)表9)于三角瓶中 ^°C，250rpm搖床震蕩培養(yǎng)約2小時(shí)，OD600 = 0 . 5左右時(shí)，作為侵染菌液使用。4.侵染 從培養(yǎng)5周的煙草無(wú)菌苗上剪取較大的葉片，保存在一個(gè)裝有YM液體培養(yǎng)基的 培養(yǎng)皿中； 用直徑6mm的打孔機(jī)將煙草葉片打成葉圓盤(pán)，保存在另一個(gè)裝有YM液體培養(yǎng)基 的培養(yǎng)皿中； 將煙草葉圓盤(pán)轉(zhuǎn)移到裝有侵染菌液的培養(yǎng)皿中； 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確保農(nóng)桿菌接觸到葉盤(pán)邊緣，浸泡10分鐘； 將已侵染的煙草葉盤(pán)從農(nóng)桿菌懸浮液中轉(zhuǎn)移至干燥的無(wú)菌濾紙上，吸干菌液直 至煙草葉盤(pán)不滴菌液為止； 將煙草葉盤(pán)接種到RMOP固體培養(yǎng)基(具體配方見(jiàn)表10)上，葉面朝上，每皿約 10塊； 倒置培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)3天。5.篩選 將步驟4的葉圓盤(pán)轉(zhuǎn)移到RMOP-TCH培養(yǎng)基(10mg/L Hyg)(具體配方見(jiàn)表11) 上，每皿10塊，葉面朝上，光照培養(yǎng)2周； 每2周繼代一次，大約4周出現(xiàn)叢生芽。6.生根 當(dāng)再生芽長(zhǎng)至約l-2cm時(shí)，切下芽接種到MST-TCH培養(yǎng)基(10mg/L Hyg)(具體 配方見(jiàn)表12)，每瓶1株煙草苗；· 光照培養(yǎng)室培養(yǎng)2周；除去幼苗基部的小葉子，轉(zhuǎn)移到新鮮的MST-TCH培養(yǎng)基(10mg/L Hyg)，每瓶1株 煙草苗，培養(yǎng)2周。之后分別取葉片和根進(jìn)行GUS染色實(shí)驗(yàn)，GUS染色液的配方和方法同水稻。GUS 染色液的配方(Iml) :610 μ 1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(pH = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2Μ NaH2PO4 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc。 將轉(zhuǎn)基因煙草的根、葉和對(duì)照煙草(沒(méi)有轉(zhuǎn)入目的基因的空載體)的根、葉分別 浸泡在⑶S染色液中，37°C保溫至出現(xiàn)藍(lán)色，(圖6和7)。結(jié)果如圖6、7所示，以重組根癌 農(nóng)桿菌EHA105-P5^介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的煙草的根、葉(圖6、7右)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，對(duì)照煙草的 根、葉(作為對(duì)照，圖6、7左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。 本發(fā)明實(shí)施例中所使用的相關(guān)培養(yǎng)基如下用雙蒸水配制以下培養(yǎng)基，其中所稱的“常規(guī)滅菌”是指如下條件的滅菌121°C下 蒸氣滅菌20分鐘；用IN氫氧化鉀或IN鹽酸調(diào)節(jié)pH值。表2-YM 固體培養(yǎng)基(含有 50mg/L Kan，10mg/L Rif)(每 L)YM Broth 干粉 瓊脂粉(Agar) 常規(guī)滅菌，冷卻至室溫后加入 卡那霉素(Kan ) ( 50 mg/ml)
權(quán)利要求
1.一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列a、SEQID NO 1所示的核苷酸序列；b、與SEQID NO 1互補(bǔ)的核苷酸序列；C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核苷酸 序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。
2.—種核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因 序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來(lái)源相同或者不同。
3.一種載體，含有權(quán)利要求1的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體，例如含有權(quán)利要求 1的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體的pMDIS-T質(zhì)?；騪8質(zhì)粒。
4.一種重組細(xì)胞，含有權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3的 載體，所述重組細(xì)胞例如為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
5.一種含有權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3的載體或權(quán)利 要求4的重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植物，所述植物可以為單子葉植物或雙 子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
6.一組引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述 引物對(duì)的兩條引物分別含有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的序列，優(yōu)選地，所述引物對(duì) 的兩條引物在5’端還分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，更優(yōu)選地，所述引物對(duì) 的兩條引物分別具有SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示的序列。
7.制備SEQID NO :1所示的啟動(dòng)子的方法，包括以水稻日本晴基因組DNA為模板，使 用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID N0:1在水稻日本晴gDNA中的序列分 別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)，優(yōu)選是權(quán)利要求6所述的引物對(duì)。
8.一種調(diào)控基因表達(dá)方法，所述方法包括步驟將權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3的載體或權(quán)利要求4的 重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化至植物(優(yōu)選植物愈傷組織或植物外植體)，使所述核苷酸序列位于所述基 因的5’端，所述植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙 草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4的重組 細(xì)胞或權(quán)利要求5的植物愈傷組織、植物外植體或植物。所述植物可以為單子葉植物或雙 子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu)選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
10.權(quán)利要求1的啟動(dòng)子、權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3的載體、權(quán)利要求4的 重組細(xì)胞或者權(quán)利要求5的植物愈傷組織、植物外植體或植物者用于調(diào)控植物目的基因表 達(dá)和植物育種的用途，所述植物可以為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選稻屬或煙草屬，更優(yōu) 選水稻或煙草，最優(yōu)選水稻日本晴或煙草NC89。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子BgIosP526及其制備方法和用途，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列a、SED ID NO1所示的核苷酸序列；b、與SED ID NO1互補(bǔ)的核苷酸序列；c、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、缺失、添加修飾的核苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及所述啟動(dòng)子在調(diào)控單子葉植物或雙子葉植物中目的基因表達(dá)以及育種的用途。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102146410SQ20101062318
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者倪雪梅, 孫紅正, 張耕耘, 李寧 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司