專利名稱：抗ckm單克隆抗體與產(chǎn)生其的雜交瘤細(xì)胞株以及其的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗人肌酸激酶M型亞基(Creatine Kinase M Type, CKM)的單克隆抗體和產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以及該單克隆抗體在CKMB試劑盒中的應(yīng)用。 特別是涉及一種能特異性結(jié)合并抑制CKM亞基活性的單克隆抗體和產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以及該單克隆抗體在CKMB試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)。肌酸激酶活性測(cè)定對(duì)骨骼肌損傷和心肌損傷，特別是急性心肌梗塞的診斷具有非常重要的意義。肌酸激酶已知有兩個(gè)亞基M型(肌型)和B型(腦型)，兩兩組合而成 CK-BB、CK-MM和CK-MB三種同工酶。CK-BB主要存在于腦或腎等內(nèi)臟器官中，CK-MM主要存在于骨骼肌及心肌等肌肉中，而CK-MB主要分布于心肌中。作為肌酸激酶同工酶之一的CKMB，由于在心肌中特異性地存在，因此，CKMB的測(cè)定在心肌梗塞的診斷中為特別有用的標(biāo)記。已知在患急性心肌梗塞后3小時(shí)就可以發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)的CKMB升高，36小時(shí)后升高為100%。在臨床領(lǐng)域中，CKMB活性增高是心肌損傷的特異指標(biāo)，對(duì)心肌梗塞早期診斷很有價(jià)值。對(duì)于CKMB活性的測(cè)定以往就提出了很多方法，目前廣泛采用的是免疫抑制法。這類方法是通過用抗體來抑制酶的部分酶活或部分同工酶的酶活，從而測(cè)得CKMB的活性。作為一般的測(cè)定方法，通常是將抑制CKM的抗體加入到雙試劑試劑盒中的試劑1中，該抗體可以完全抑制CKM亞基的活性而不影響CKB亞基的活性 (CKBB亞基的活性忽略不計(jì))，將測(cè)得的CKB亞基的活性乘以2即為CKMB的活性。因此，基于免疫抑制法的原理，CK-MB檢測(cè)試劑盒中的抗體需要具有較好的特異性。非專利文獻(xiàn)1中公開了一種抗CKM單克隆抗體的制備方法，該方法用CKMB全酶作為免疫小鼠與陽性細(xì)胞株檢測(cè)的抗原，然后根據(jù)酶活抑制情況進(jìn)一步篩選(參見非專利文獻(xiàn)1) O專利文獻(xiàn)1中也提出了一種抗CKM的單克隆抗體及其制造方法。該抗CKM的單克隆抗體為與肌酸激酶反應(yīng)，阻礙CKMB活性的抗體。(參見專利文獻(xiàn)1)。非專利文獻(xiàn)1 一種骨骼肌肌酸激酶單克隆抗體(A monoclonal antibody against the skeletal muscle enzyme, creatine kinase)，，，Glenn E. Morris 與 Linda P. Head，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)簡(jiǎn)訊(FEBS LETTERS)，第145卷，第1期，第163-168頁， 1982年8月。專利文獻(xiàn)1 日本公開昭63-49095

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題
但是，由非專利文獻(xiàn)1中公開的抗CKM單克隆抗體的制備方法而得到的抗體中，很多都不具備酶活抑制特性，造成篩選的工作量大，效率低。 而專利文獻(xiàn)1中的抗CKM的單克隆抗體特異性雖然得到了提高，但是對(duì)CKMB酶活的抑制率很難接近50%。 因此，目前的抗CKM的單克隆抗體特異性還不能滿足要求，需要一種特異性好，且對(duì)CKMB酶活抑制率在50%左右的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明是針對(duì)上述課題，進(jìn)行大量研究而完成的，其目的在于提供一種特異性結(jié)合并抑制CKM亞基活性、且能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以及由該雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體，進(jìn)一步提供一種應(yīng)用該單克隆抗體為主要原料的CKMB檢測(cè)試劑盒。解決問題的手段本發(fā)明者們從CKM和CKB亞基序列中差異較大的片段中選取3段CKM特有的片段作為篩選抗原，采用間接ELISA法進(jìn)行CKM亞基特異性單克隆抗體的篩選，最終獲得了 1株能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合CKM、且酶活抑制率接近50%的雜交瘤(2C3)作為目標(biāo)細(xì)胞株，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供一種特異性結(jié)合CKM并抑制其酶活性的抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種由該雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的抗CKM單克隆抗體。本發(fā)明的目的還在于提供一種該雜交瘤細(xì)胞株的制備方法。另外，本發(fā)明的目的在于提供一種單克隆抗體在CKMB試劑盒中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供了下面所述的⑴至(6)的內(nèi)容。(1)產(chǎn)生能特異性結(jié)合CKM并抑制其酶活性的抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。(2) (1)中所述的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCC4333。(3) (1)至(2)任一項(xiàng)所述的雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的抗CKM單克隆抗體。(4) 一種抗CKM單克隆抗體，其特征在于，能識(shí)別(2)中的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗 CKM單克隆抗體所識(shí)別的表位，并特異性抑制CKM酶活性。(5) 一種制備(1)或(2)中所述的雜交瘤細(xì)胞株的方法，其特征在于，包括從CKM 和CKB亞基序列中差異較大的片段中選取3段CKM特有的片段作為篩選抗原，采用間接 ELISA法進(jìn)行CKM亞基特異性單克隆抗體的篩選的工序。(6) (3)或(4)所述的抗CKM單克隆抗體在CKMB試劑盒制備中的應(yīng)用。發(fā)明效果本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株能夠特異性地結(jié)合并抑制CKM亞基酶活性，對(duì)CKMB酶活的抑制率接近50%，而由該雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗CKM單克隆抗體可以特異性地識(shí)別CKM亞基的抗原決定簇，而不與CKB亞基結(jié)合。由于該抗CKM單克隆抗體很好得滿足CKMB檢測(cè)的要求，因此可以應(yīng)用于CKMB檢測(cè)試劑盒中。


圖1為由2C3雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的單克隆抗體應(yīng)用于試劑盒中的相關(guān)性分析圖。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明下文的詳細(xì)描述中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域中的已知技術(shù)在不同的實(shí)施方案中實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，此外本發(fā)明并不局限于以下所列舉的實(shí)施方案中。本發(fā)明所說的“CKM”除非特別說明，是指具有肌酸激酶活性的人肌酸激酶M型亞基及其相關(guān)產(chǎn)物，如肌酸激酶M型亞基的前體、成熟形式或片段。本發(fā)明所說的“特異性結(jié)合”是指抗CKM單克隆抗體僅與CKM亞基結(jié)合，而不與CKB
亞基結(jié)合。本發(fā)明所說的“抗體”是指能夠與完整的全長(zhǎng)度的CKM分子或CKM片段特異性結(jié)合的單克隆抗體，或者這些抗體的部分片段。本發(fā)明所說的“抑制率接近50% ”是指抗CKM單克隆抗體具有抑制CKMB酶活的能力，但抗體的加入只能使酶活性下降到不加抗體時(shí)的50%左右。本發(fā)明中的雜交瘤細(xì)胞株與抗CKM單克隆抗體可以通過下文所述的方法產(chǎn)生。進(jìn)一步，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用這些根據(jù)下文描述及本領(lǐng)域中已知技術(shù)改造過的更適合的方法。 (1)免疫原的制備本發(fā)明采用原核表達(dá)純化的CKM亞基作為免疫原。CKM的氨基酸序列為NCBI網(wǎng)站上公布的序列，其序列號(hào)為NP_001815，具體地參見SEQ ID No. 1。將氨基酸序列用Vector NTI軟件翻譯成不帶大腸桿菌稀有密碼子的核苷酸序列，具體序列見SEQ ID No. 2。本發(fā)明是通過構(gòu)建含有編碼CKM的DNA片段(SEQ ID No. 2)的表達(dá)載體并通過在宿主細(xì)胞導(dǎo)入及表達(dá)該載體的方式來獲得重組人CKM。宿主細(xì)胞可以使用常用的宿主細(xì)胞，例如可以舉出E. coli BL 21(DE3)或其他的E. coli感受態(tài)細(xì)胞，優(yōu)選為E. coli BL21(DE3)。使用宿主細(xì)胞表達(dá)后，通過用菌落PCR的方法挑選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液進(jìn)行細(xì)胞破碎，經(jīng)過濾膜過濾后，用GST親和純化柱，優(yōu)選GE公司的GSTrap FF預(yù)裝柱進(jìn)行純化。對(duì)于細(xì)胞破碎，可以采用常規(guī)的細(xì)胞破碎方法，例如在8000-12000轉(zhuǎn)/分的條件下、 離心5-10分鐘，離心后的上清用0. 22um濾膜過濾，然后按純化柱填料產(chǎn)品說明書提供的方法進(jìn)行純化。(2)檢測(cè)抗原的制備本發(fā)明是通過采用CKM與CKB亞基差異較大的多肽片段作為雜交瘤細(xì)胞的檢測(cè)抗原來進(jìn)行單克隆抗體的篩選。具體的為用DNAStar軟件所帶的同源性比對(duì)軟件MegAlign 分析CKM與CKB亞基的序列，找出CKM與CKB的一些差異較大的片段，從中選取3段多肽片段進(jìn)行合成作為檢測(cè)抗原。本發(fā)明所選3段多肽序列示于表1中。表 權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生能特異性結(jié)合CKM并抑制其酶活性的抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCC4333。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雜交瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的抗CKM單克隆抗體。
4.一種抗CKM單克隆抗體，其特征在于，能識(shí)別權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗CKM單克隆抗體所識(shí)別的表位，并特異性抑制CKM酶活性。
5.一種制備權(quán)利要求1或2所述的雜交瘤細(xì)胞株的方法，其特征在于，包括從CKM和 CKB亞基序列中差異較大的片段中選取3段CKM特有的片段作為篩選抗原，采用間接ELISA 法進(jìn)行CKM亞基特異性單克隆抗體的篩選的工序。
6.權(quán)利要求4或5所述的抗CKM單克隆抗體在CKMB試劑盒制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗CKM單克隆抗體與產(chǎn)生其的雜交瘤細(xì)胞株以及其的應(yīng)用。所述抗CKM單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合并抑制CKM亞基酶活性，進(jìn)一步，本發(fā)明的產(chǎn)生抗CKM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，能夠特異性地結(jié)合并抑制CKM亞基酶活性，對(duì)CKMB酶活的抑制率接近50％。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102154216SQ201010623039
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:北京利德曼生化股份有限公司研發(fā)中心