一種新型內(nèi)切木聚糖酶及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型內(nèi)切木聚糖酶及其編碼基因和應用。本發(fā)明還涉及含有所述編碼基因的表達載體和宿主細胞。本發(fā)明還涉及利用所述木聚糖酶形成簡單糖的方法。本發(fā)明還涉及提高所述木聚糖酶熱穩(wěn)定性的突變體和提高該木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法。本發(fā)明的木聚糖酶的酶活性高，具有寬的pH適用范圍和良好的溫度穩(wěn)定性，可良好地應用于工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】一種新型內(nèi)切木聚糖酶及其編碼基因和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及一種新的內(nèi)切木聚糖酶，其編碼基因和應用。

【背景技術】
[0002] 木聚糖簡介。木聚糖，由木糖分子（D Xylose)以β-1，4-糖苷鍵連結成主鏈；阿 拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙?；冗B結成支鏈。木聚糖是植物細胞壁中半纖維素的 主要成份，半纖維素是植物多糖中僅次于纖維素的重要成份，是自然界中除纖維素為含量 最為豐富的可再生植物多糖。
[0003] 木聚糖的來源。富含木聚糖的原料來源廣泛，包括硬木、軟木、秸桿、稻草、麩皮等 農(nóng)、林、工業(yè)廢棄物及城市固體垃圾等。且不同植物所含木聚糖的多少也有所差別，硬材中 所含木聚糖比軟材中多，硬材中能占到干重的15?30%，軟材中一般占干重的7?12%。而 在一些一年生植物如小麥、甘煎、棉子殼中，木聚糖含量則高達3〇%以上。
[0004] 木聚糖酶簡介。木聚糖酶是一系列能特異降解木聚糖的糖基水解酶的總 稱。由于組成木聚糖單糖單元的差異、鍵的類型不同、以及木聚糖中存在許多不同 取代基的支鏈，木聚糖的徹底降解需要多種酶參與，包括：內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶 (end〇-i3-l，4_xylanase，EC3. 2. 1. 8)，β-木糖苷酶（i3_xylosidase，EC3. 2. 1. 37)， a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶（a -L-arabinofuranosidase，Ε· C. 3. 2. L 39)、β -D-葡萄糖醒 酸苷酶（β-D-glucuronidase，EC3.2. I. 39)、乙醜木聚糖酯酶（acetyl xylan esterases， E. C. 3. I. I. 72)以及降解阿拉伯糖側鏈殘基與酚酸（如阿魏酸或香豆酸）形成的酯鍵酚 酸酯酶（ferulic or p-coumaric acid esterase，E.C.3.2.1.73)等。其中，內(nèi)切-1， 4-β_木聚糖酶是降解木聚糖最主要的酶。該酶以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的 β-1，4-木糖苷鍵，將大分子多聚木糖水解為低聚木糖和少量木糖，從而起始多聚糖的逐步 降解（Bernier R, Driguez Η, Desrochers M Gene26:59 _ 65, 1983)
[0005] 木聚糖酶在傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)中的應用。木聚糖酶被廣泛應用于包括食品、飼料、造紙、紡 織等各種工業(yè)部門中，并在其中扮演重要的角色。第一，在食品工業(yè)中，木聚糖酶被用于水 果、蔬菜和植物加工，以促進浸漬過程，使汁液澄清，提高產(chǎn)量和過濾效率；被用于葡萄酒制 造和釀造以促進葡萄皮浸漬和降低成品的混濁度；被用于培烤、磨粉、糕點、糖果的加工中 以提高面團的彈性和強度，改善面包質(zhì)地；被用于咖啡加工中，以降低咖啡提取物的粘度并 改善了干燥/凍干過程。第二，在造紙工業(yè)中，木聚糖酶被用于促進制漿處理和代替機械制 漿，不僅能有效降低能量消耗還可提高紙漿的原纖維形成和透水性進而提高加工效率和紙 張強度。第三，在紡織工業(yè)中，木聚糖酶被用于紡織品（亞麻，黃麻，蘭麻，大麻等）的酶解 中，以減少或替代化學混麻方法。第四，在農(nóng)牧業(yè)中，木聚糖酶被廣泛應用于單胃動物（如 豬和家禽）以及反芻動物的飼料中。輔助動物有效降解木聚糖，降低飼料中非淀粉多糖的 含量，以提高飼料的可消化性和營養(yǎng)價值同時減少環(huán)境污染。
[0006] 木聚糖酶在生物能源領域的作用。尤為重要的是，在全球化石資源日益枯竭，開發(fā) 新型生物能源迫在眉睫的背景下，木聚糖酶可與其他纖維素酶、半纖維素酶共同應用于將 木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的工業(yè)生產(chǎn)中。一方面，木聚糖酶通過降解木質(zhì)纖維素中與木 質(zhì)素及纖維素骨架鏈緊密交聯(lián)的半纖維素鏈，大大提高纖維素酶接觸并作用于纖維素鏈的 頻率和效率，從而間接提高纖維素的降解效率；另一方面，隨著近年來五碳糖發(fā)酵途徑及菌 株的研究、開發(fā)，利用細菌、酵母及絲狀真菌發(fā)酵木聚糖水解產(chǎn)物木糖生產(chǎn)燃料乙醇的工藝 日趨成熟。兩方面共同作用使木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效率大大提高，從而有效降低燃料乙醇的 生產(chǎn)成本。
[0007] 木聚糖酶的研究歷史。由于木聚糖酶有著廣泛的用途，對木聚糖酶的研究早在 六十年代就已開始，且己經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚 糖酶。研究得較為清楚的有Trichoderma reesei (里氏木霉）、Aspergillus niger (黑 曲霉）、Streptomyces lividans(變鉛青鏈霉菌）、Cellulomonas 肥桿菌）、 Clostridium thermocellum(熱纖梭菌）、Penicillium simplicissimum(簡青霉）等所產(chǎn) 生的木聚糖酶。需要指出的是，這些木聚糖酶基因大部分都是從純培養(yǎng)的微生物中分離出 來的，而自然界中可培養(yǎng)微生物的種類尚不足1%，獲得的木聚糖酶在理化特性、催化效率、 產(chǎn)量等方面也遠遠不能滿足現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的需求。
[0008] 鑒于現(xiàn)有技術中大部分木聚糖酶的活力較低，在理化特性、催化效率、產(chǎn)量等方面 也遠遠不能滿足現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的需求，有必要進一步擴大篩選對象，從中篩選出新的、酶活 性高的木聚糖酶，以用于工業(yè)生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型內(nèi)切木聚糖酶及其編碼基因和應用。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供包括內(nèi)切木聚糖酶基因的表達載體和宿主細胞，基因的表 達和蛋白純化方法，以及重組蛋白的酶學特性和功能特征。
[0011] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組：
[0012] (a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；
[0013] (b)由SEQ ID NO:2的第19 - 272位氨基酸殘基組成的多肽片段；
[0014] (c)由SEQ ID NO:2的第19 - 267位氨基酸殘基組成的多肽片段；
[0015] (d)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中第19-267位氨基酸的多肽；
[0016] (e)由（a)、（b)、（c)或（d)中所述的多肽經(jīng)過一個或多個（如1-20個，較佳地 1-10個；更佳地1-5個；更佳地1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有多肽（a) 功能的多肽；
[0017] (f)在（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所述多肽的N或C末端添加標簽序列，或在其N末 端添加信號肽序列后形成的多肽。
[0018] 在一個優(yōu)選例中，所述的多肽來源于高等食木非培菌黃球白蟻腸道系統(tǒng)的元基因 組。
[0019] 在一個具體實施例中，所述（a)多肽的功能包括但不限于作為內(nèi)切木聚糖酶的功 能。
[0020] 在一優(yōu)選實施例中，（e )所述多肽除保留內(nèi)切木聚糖酶功能外，還相對于野生型序 列而目還具有提1?的熱穩(wěn)定性。
[0021] 在一個具體實施例中，所述多肽選自：
[0022] (i) SEQ ID NO:2 ;和
[0023] (ii) SEQ ID NO:2的至少含有其第19-267位氨基酸的片段。
[0024] 在一個具體實施例中，所述片段為由SEQ ID NO: 2的第19 一 272位氨基酸殘基組 成的片段。
[0025] 在一個具體實施例中，（e)所述多肽選自在SEQ ID N0:2的至少一個下述位點存 在氨基酸取代的多肽：K32、N37、S42、M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228 和 A386。
[0026] 在一個具體實施例中，（e)所述多肽至少在SEQ ID NO:2的Κ32和Κ223中存在取 代。在某些具體實施例中，所述取代突變?yōu)镵32T與選自K223M、K223E、K223T、K223C、K223S、 K223G和K223L中的任一種突變的組合。
[0027] 在一個具體實施例中，（e)所述多肽至少在223位上存在選自以下的取代突變： K223M、K223E、K223T、K223C、K223S、K223G 和 K223L。
[0028] 在一個具體實施例中，（e)所述多肽的突變?yōu)槿〈蛔?，所述取代突變選自以下 突變中的一個或多個：K32T、N37D、S42N、M80I、K205E、E219D、A221T、M222L、K223M、K223E、 Κ223Τ、K223C、K223S、K223G、K223L、T228S、和 A386S。
[0029] 在一個具體實施例中，（e)所述多肽選自：（1)在對應于SEQ ID Ν0:2的下述位置 上發(fā)生了如下所述取代的多肽：N37D; (2)在對應于SEQ ID Ν0:2的下述位置上發(fā)生了如下 所述取代的多肽：S42N ; (3)在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的 多肽：M80I ;(4)在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：E219D ; (5)在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述示取代的多肽：A221T; (6)在對 應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：M222L; (7)在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223M ;(8)在對應于SEQ ID N0:2的下述 位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：T228S ; (9)在對應于SEQ ID NO: 2的下述位置上發(fā)生 了如下所述取代的多肽：K205E、K223T和A386S;(10)在對應于SEQ ID N0:2的下述位置 上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K32T和K223T;(11)在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上 發(fā)生了如下所述取代的多肽：K205E和K223T;(12)在對應于SEQIDN0 :2的下述位置上 發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223E、K223T、K223C、K223S、K223G或K223L ; (13)在對應于 SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K21T和K223C;和（14)在對應于 SEQ ID Ν0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：Κ32Τ和K223S。
[0030] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸 序列選自下組：
[0031] (1)編碼所述多肽的多核苷酸；
[0032] (2)與多核苷酸（1)互補的多核苷酸。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼如SEQ ID Ν0:2所示氨基酸序列的多肽。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。
[0035] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。
[0036] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體，或其 基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0037] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽的制備方法，該方法包含：
[0038] (a)培養(yǎng)所述的宿主細胞；
[0039] (b)從培養(yǎng)物中分離出所述的多肽。
[0040] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種利用所述的多肽將木聚糖或含有木聚糖的物質(zhì)中 的木聚糖降解為低聚木糖或木寡糖或單糖的方法。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的低聚木糖或木寡糖是：木二糖、木三糖或木四糖。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的多肽以內(nèi)切形式水解底物，所述的底物是：木聚糖，或含 木聚糖的物質(zhì)（如半纖維素）。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的木聚糖是：樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖。
[0044] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，它含有安全有效量的所述的多肽以及食 品學或工業(yè)上可接受的載體。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有調(diào)節(jié)酶活性的添加物。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)酶活性的添加物是提高酶活性的添加物；較佳地選 自：K+，Mn 2+或在添加至底物后可水解形成K+，Mn2+的物質(zhì)；或
[0047] 所述的調(diào)節(jié)酶活性的添加物是抑制酶活性的添加物；較佳地選自：Ni2+、Zn 2+、Fe3+ 和EDTA ;或在添加至底物后可水解形成Ni2+、Zn2+或Fe3+的物質(zhì)。
[0048] 在一個優(yōu)選例中，所述的木聚糖是：樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，在 pH3-12 (例如 3. 5-9. 5、5-10、ρΗ4-9· 5、ρΗ5· 5-9. 5 ;優(yōu)選是 ρΗ6. 0-9. 5 ;更優(yōu)選是pH6. 0-8. 0 ;最佳地是ρΗ7. 0)條件下，用所述的多肽處理待水解的底 物。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，在溫度15-90°C (例如，25-80°C，較佳地是30-60°C ;更佳地是 45-55 °C，更進一步地，50-55 °C )條件下，用所述的多肽處理待水解的底物。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，用所述的多肽處理的同時，還加入調(diào)節(jié)酶活性的添加物。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)酶活性的添加物是提高酶活性的添加物；較佳地選 自：K+，Mn 2+或在添加至底物后可水解形成K+，Mn2+的物質(zhì)；或
[0053] 所述的調(diào)節(jié)酶活性的添加物是抑制酶活性的添加物；較佳地選自：Ni2+、Zn 2+、Fe3+ 和EDTA ;或在添加至底物后可水解形成Ni2+、Zn2+或Fe3+的物質(zhì)。
[0054] 本發(fā)明還提供一種提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性方法，所述方法包括：
[0055] 將木聚糖酶多肽中對應于SEQ ID NO:2第32位和/或第223位的氨基酸進行突 變，從而得到熱穩(wěn)定性提高的木聚糖酶。
[0056] 在一具體實施例中，所述木聚糖酶多肽是本領域已知的木聚糖酶多肽。
[0057] 在其它實施例中，所述木聚糖酶多肽是本發(fā)明的SEQ ID N0:2或其活性片段。
[0058] 在其它實施例中，所述突變還包括在該木聚糖酶的其它位置上進行的突變。在優(yōu) 選實施例中，所述其它位置包括下述位置中的一個或多個：37、42、80、205、219、221、222、 228和386,所述位置編號對應于SEQ ID NO:2的編號。
[0059] 本發(fā)明還提供一種篩選熱穩(wěn)定性提高的木聚糖酶的方法，所述方法包括：
[0060] (1)構建含有SEQ ID NO:2或其活性片段的突變體的文庫；和
[0061] (2)對所述文庫中的突變體進行熱穩(wěn)定性測試；
[0062] 其中，在相同的測試條件下，若突變體測試后活力下降的程度低于對照的下降程 度至少5% (優(yōu)選低于至少10%、至少20%、至少30%或更低)，則篩選該該突變體為熱穩(wěn) 定性提1?的木聚糖酶。
[0063] 所述方法中，對照可以是構建該突變體文庫的出發(fā)多肽，例如SEQ ID N0:2或其含 有第19到267或272位氨基酸的片段，也可以是某些已確定具有SEQ ID NO: 2的內(nèi)切木聚 糖酶活性且其熱穩(wěn)定性與SEQ ID NO:2或其含有第19到267或272位氨基酸的片段相同 或提高的突變體。
[0064] 在一具體實施例中，構建的突變體至少包括以下一個或幾個位置中的取代突變： K32、N37、S42、M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228 和 A386,所述氨基酸編號以 SEQ ID NO:2的編號計。
[0065] 在一具體實施例中，構建的突變體至少包括K32和/或K223位上的突變。在其 它實施例中，構建的突變體還可包括以下一個或幾個位置中的突變，優(yōu)選為取代突變：N37、 S42、M80、K205、E219、A221、M222、T228 和A386。上述氨基酸編號對應于SEQIDN0:2的編 號。
[0066] 在一具體實施例中，所述熱穩(wěn)定性測試包括在pH為3-12,優(yōu)選5. 5-10,更優(yōu)選約 7. 0 ;溫度為15-90°C，優(yōu)選為30-60°C，更優(yōu)選為50-55°C的條件下測試突變體及對照的酶 活，測試的底物選自樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖。
[0067] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0068] 圖1為重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-xyl7菌落PCR后的電泳圖。圖中泳道M為 DNA marker 的電泳結果（片段由上到下依次是 23. lkb、9. 4kb、6. 6kp、4. 4kp、2. 3kb、2. Okb、 564bp)，1-5為大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a(+)-xyl75個單克隆菌落PCR后的電泳圖。
[0069] 圖2為內(nèi)切-1，4-β -木聚糖酶基因 xyl7的表達和表達產(chǎn)物的純化SDS-PAGE圖。 其中左圖泳道1為細胞裂解液上清中的蛋白，泳道2為20mM咪唑洗脫液，泳道3為40mM咪 唑洗脫液，泳道4為60mM咪唑洗脫液，泳道5為IOOmM咪唑洗脫液，泳道6為200mM咪唑洗 脫液，泳道7為500mM咪唑洗脫液，泳道M為蛋白Marker(分子量由上到下依次為200、116、 97. 2、66· 4、44· 3、29、20· 1、14· 3kDa)。
[0070] 圖3為Xyl7在不同pH條件下的酶活力曲線。其中，?表示NaAc緩沖液中的酶活 力，表示NaH 2PO4緩沖液中的酶活力，▲表示Tris-HCl緩沖液中的酶活力。
[0071] 圖4為Xyl7pH耐受性測定。其中，?表示Ph6. 5的NaH2PO4緩沖液中的酶活力，▲ 表示pH7. 0的NaH2PO4緩沖液中的酶活力，*表示pH7. 0的NaH2PO4緩沖液中加入70mM巰基 乙醇的酶活力，X表示ρΗ7· 5的NaH2PO4緩沖液中的酶活力。
[0072] 圖5為Xyl7在不同溫度條件下的酶活力曲線。
[0073] 圖6為Xyl7對不同溫度的耐受性檢測結果。其中，?表示45°C下的酶活力，表 示50°C下的酶活力，▲表示55°C下的酶活力，X表示50°C下NaH 2PO4緩沖液中加入70mM巰 基乙醇的酶活力。
[0074] 圖7為Xyl7對樺木木聚糖在不同作用條件下的水解底物的TLC分析。其中，1 :標 準品：X1為木糖，X2為木二糖，X3為木三糖；2 :對照組(未與酶作用的1%樺木木聚糖）；3 : 當作用時間為10分鐘時的水解產(chǎn)物；4 :當作用時間為1小時時的水解產(chǎn)物；5 :當作用時間 為4小時時的水解產(chǎn)物；6 :當作用時間為12小時時將其最終水解為木寡糖，主要包括：木 二糖、木三糖、木四糖。
[0075] 圖8為Xyl7在pH8和pH9條件下，在55°C、60°C和70°C分別放置兩小時后測得的 剩余酶活。
[0076] 圖9為Xyl7在pH4和pH5下37°C溫浴15、30、45和60分鐘后的相對剩余酶活。
[0077] 圖10為Xyl7定向進化第一輪隨機突變文庫篩選結果。
[0078] 圖11為定向進化第一輪篩選到突變子的熱穩(wěn)定性測定結果。
[0079] 圖12為第二輪隨機突變文庫篩選結果和第223位點的飽和突變篩選結果。
[0080] 圖13為第223位點組合突變子分別在55度(上)和60度(下)熱穩(wěn)定性測定結果。
[0081] 圖14為Xyl7第19-272位氨基酸片段的表達和表達產(chǎn)物的純化SDS-PAGE圖。其 中泳道1為細胞裂解后的總蛋白，泳道2為細胞裂解液沉淀,泳道3為細胞裂解液上清,泳 道4為60mM咪唑洗脫液，泳道5為IOOmM咪唑洗脫液，泳道6為200mM咪唑洗脫液，泳道7 為500mM咪唑洗脫液，泳道M為蛋白Marker (分子量由上到下依次為200、116、97· 2、66· 4、 44.3、29、20. 1、14. 3kDa)。
[0082] 圖15為Xyl7第19-272位氨基酸片段中第223位點突變子分別在55度(上）和 60度(下）的熱穩(wěn)定性測定結果。
[0083] 圖16為Xyl7第19-267位的蛋白表達結果，命名為Xyl7R2。泳道1為細胞裂解 后的總蛋白，泳道2為細胞裂解液沉淀，泳道3為細胞裂解液上清，泳道4為60mM咪唑洗脫 液，泳道5為IOOmM咪唑洗脫液，泳道6為200mM咪唑洗脫液，泳道7為500mM咪唑洗脫液， 泳道M為蛋白Marker。

【具體實施方式】
[0084] 本發(fā)明人經(jīng)過大規(guī)模的篩選，首次從白蟻腸道的元基因組中分離得到一種新的木 聚糖酶（較佳地為內(nèi)切-1，4- β -木聚糖酶），其酶活性高，對溫度和pH具有較寬的作用范 圍，可良好地應用于工業(yè)生產(chǎn)。所述的木聚糖酶的氨基酸序列與已知氨基酸序列的相似性 最高的為69%，證明其是一種新的蛋白。本發(fā)明的木聚糖酶具有很高的酶活性，在pH7.0， 50°C下的比活力高于6340U/mg。
[0085] 針對傳統(tǒng)微生物學中基因篩選方面的缺陷，元基因組學（Metagenomics)技術異 軍突起。通過直接從環(huán)境中抽提微生物核酸并構建元基因組文庫（BAC，fosmid或者質(zhì)粒 文庫），可以有效克服由于微生物分離培養(yǎng)技術造成的缺陷，獲得群落中所有種群的遺傳信 息，這些遺傳信息就包括了群落中所欲參與生物轉(zhuǎn)化的基因，這些基因編碼的酶在克隆宿 主中的表達可以用于各種與生物轉(zhuǎn)化相關的酶的篩選，從而有可能獲得大量新的基因。
[0086] 眾所周知，針對不同用途需要使用不同性質(zhì)的木聚糖酶，而不同性質(zhì)的木聚糖酶 極有可能蘊藏于自然界不同生態(tài)環(huán)境下的微生物基因組中。白蟻作為自然生態(tài)系統(tǒng)中木 質(zhì)纖維素的重要降解者，其腸道共生微生物群落在纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起到了關鍵作 用。鑒于白蟻腸道生態(tài)系統(tǒng)的高效性、獨特性和復雜性，本發(fā)明以白蟻作為木聚糖酶篩選的 體系，利用元基因組學技術進行篩選，對其基因和酶進行挖掘，最終找到了本發(fā)明的木聚糖 酶。
[0087] 本發(fā)明的木聚糖酶可作用于木聚糖長鏈分子的內(nèi)部，以內(nèi)切方式作用于木聚糖主 鏈內(nèi)部的β-1，4-木糖苷鍵，將大分子多聚木糖水解為簡單糖（如木寡糖）。
[0088] 如本文所用，術語"本發(fā)明的多肽"、"本發(fā)明的蛋白"、"本發(fā)明的木聚糖酶"、"Xyl7 蛋白"、"Xyl7多肽"或"木聚糖酶Xyl7"可互換使用，都指具有木聚糖酶Xyl7氨基酸序列 (SEQ ID N0:2、其片段或變異形式或衍生物）的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲 硫氨酸的木聚糖酶Xyl7。
[0089] 如本文所用，術語"本發(fā)明的基因"、"xyl7基因"、"xyl7"指具有木聚糖酶編碼基 因序列（SEQ ID NO: 1或其變異形式或衍生物）的多核苷酸。
[0090] 如本文所用，所述的"簡單糖"廣義地指木聚糖鏈被切割后形成的一類糖的總稱， 其鏈長度低于被切割前。例如，所述的簡單糖含有1-50個木糖，較佳的，含有1-30個木糖； 更佳的，含有1-15個木糖；更佳地含有1-10個木糖，如2, 3,4, 5,6, 7,8,9個木糖。所述的 簡單糖包括：木寡糖、木二糖、木三糖、木四糖等。本發(fā)明中，所述的簡單糖又指：低聚木糖、 少量木糖。
[0091] 如本文所用，所述的"木糖"指一種含有五個碳原子的單糖。分子式C4H90 4CH0。所 述的"木聚糖"是"木糖"的聚合體。
[0092] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化 的。
[0093] 如本文所用，"分離的Xyl7蛋白或多肽"是指Xyl7多肽基本上不含天然與其相關 的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化 Xyl7蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。Xyl7多肽的 純度能用氨基酸序列分析。
[0094] 本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多 肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主（例 如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞）中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起 始的甲硫氨酸殘基。
[0095] 本發(fā)明還包括Xyl7蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生 物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然Xyl7蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。 本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基 (優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是 由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或（iii)成 熟多肽與另一個化合物（比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的多 肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前導序列或分泌序列或 用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白）。根據(jù)本文的 教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
[0096] 在本發(fā)明中，術語"Xyl7多肽"指具有Xyl7蛋白活性的SEQ ID N0:2序列的多肽 或活性片段和活性衍生物。在一優(yōu)選實施例中，所述活性片段可以是含有SEQ ID N0:2的 保守功能域(第32-256位氨基酸）的片段。例如，所述片段可以是含有SEQ ID N0:2的第 19-267位氨基酸殘基的片段。在其它實施例中，所述活性片段可以是含有SEQ ID N0:2的 第19-272位氨基酸殘基的片段。例如，所述片段可以為SEQ ID NO: 2的第19-450位氨基酸 序列、第19-300位氨基酸序列不等，優(yōu)選SEQ ID NO:2的第19-267位氨基酸序列以及SEQ ID N0:2的第19-272位氨基酸序列。又例如，變異可以發(fā)生在SEQ ID N0:2的保守功能域 (第32-256位氨基酸)之外；在一優(yōu)選實施例中，變異發(fā)生在例如SEQ ID NO:2的第19-267 或272位氨基酸序列之外。變異可以是1-20個、例如1-10個、優(yōu)選1 一 5或1 一 3個氨基 酸缺失、取代和插入。該術語還包括具有與Xyl7蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列或SEQ ID NO:2的第19-272位氨基酸序列或第19-267位氨基酸序列的變異形式。這些變異形式 包括（但并不限于）：一個或多個（通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，更佳 地1-10個，最佳地1-5個）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端 添加或缺失一個或數(shù)個（通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi)）氨基 酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功 能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的 功能；又比如，僅表達該蛋白的催化結構域，而不表達碳水化合物結合結構域也能獲得和完 整蛋白同樣的催化功能。該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天 然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與xyl7DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、 以及利用抗Xyl7多肽的抗體獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含Xyl7 多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 Xyl7多肽的可溶性片 段。通常，該片段具有Xyl7多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨 基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100 個連續(xù)氨基酸。
[0097] 本發(fā)明SEQ ID NO:2序列或SEQ ID NO:2的第19-272位氨基酸序列或SEQ ID N0:2的第19-267位氨基酸序列的變異形式包括但不限于發(fā)生在SEQ ID N0:2序列或相對 于該序列相同位點的第32位、第37位、第42位、第80位、第205位、第219位、第221位、 第222位、第223位、第228位、第386位中的一個或多個位置上的取代突變。用來取代的氨 基酸并無特別限制。在某些實施例中，本發(fā)明的變異序列可包含以下取代中的一個或多個： K32T、N37D、S42N、M80I、K205E、E219D、A221T、M222L、K223M、K223E、K223T、K223C、K223S、 K223G、K223L、T228S、和 A386S。
[0098] 在一些實施方式中，本發(fā)明的變異形式的多肽包括但不限于SEQ ID NO: 13、15、 17、19、21、23、25、27和29中所示的序列。本發(fā)明也包括這些變異多肽的編碼序列，其編碼 序列的例子包括SEQ ID N0:12、14、16、18、20、22、24、26和28所示的序列。
[0099] 發(fā)明還提供Xyl7蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然Xyl7多肽的差別可以 是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多 肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露 于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還 包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似物，以及具有非天然存在的 或合成的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例 舉的代表性的多肽。修飾（通常不改變一級結構）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學衍 生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加 工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶 (如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基 (如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水 解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
[0100] 在本發(fā)明中，"Xyl7蛋白保守性變異多肽"指與SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:2的第 19-267或272位的氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地至多5個，最佳 地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最 好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0101] 表 1
[0102]

【權利要求】
1. 一種分離的多肽，其特征在于，該多肽選自下組： (a) 如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽； (b) 由SEQ ID NO:2的第19 一 272位氨基酸殘基組成的多肽片段； (c) 由SEQ ID NO:2的第19 一 267位氨基酸殘基組成的多肽片段； (d) 包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中第19-267位氨基酸的多肽； (e) 由（a)、（b)、（c)或（d)中所述的多肽經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添 加后仍具有多肽（a)功能的多肽； (f) 在（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所述多肽的N或C末端添加標簽序列，或在其N末端 添加信號肽序列后形成的多肽。
2. 如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自： 在對應于SEQ ID N0:2的至少一個下述位點存在氨基酸取代的多肽：K32、N37、S42、 M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228 和 A386。
3. 如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自： (1) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K32T ; (2) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：N37D ; (3) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：S42N ; (4) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：M80I ; (5) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K205E (6) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：E219D ; (7) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：A221T ; (8) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：M222L ; (9) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223M ; (10) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223T ; (11) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223C ; (12) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223S ; (13) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223G ; (14) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223L ; (15) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：T228S ; (16) 在對應于SEQ ID NO:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：A386S ; (17) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K205E、K223T 和 A386S ; (18) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K32T和K223T; (19) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K205E和 K223T ； (20) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K223E、K223T、 K223C、K223S、K223G 或 K223L ; (21) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K21T和K223C; 和 (22) 在對應于SEQ ID N0:2的下述位置上發(fā)生了如下所述取代的多肽：K32T和K223S。
4. 一種分離的多核苷酸，選自下組： (1) 編碼權利要求1 一 3中任一項所述多肽的多核苷酸；和 (2) 與多核苷酸（1)互補的多核苷酸。
5. -種載體，其特征在于，它含有權利要求4所述的多核苷酸。
6. -種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求5所述的載體，或其基因 組中整合有權利要求4所述的多核苷酸。
7. -種制備如權利要求1 一 3中任一項所述多肽的方法，其特征在于，該方法包含： (a) 在適于權利要求5所述的宿主細胞表達權利要求1 一 3中任一項所述多肽的條件 下培養(yǎng)所述宿主細胞；和 (b) 從培養(yǎng)物中分離出權利要求1 一 3中任一項所述的多肽。
8. 權利要求1 一 3中任一項所述多肽的用途，其特征在于，所述的多肽用于將木聚糖或 含有木聚糖的物質(zhì)中的木聚糖降解成低聚木聚糖或木寡糖或單糖。
9. 一種降解木聚糖的方法，其特征在于，所述方法包括將權利要求1 一 3中任一項所述 的多肽與木聚糖或含有木聚糖的物質(zhì)混合，在適合的反應條件下將所述的木聚糖或含有木 聚糖的物質(zhì)中的木聚糖降解成低聚木聚糖或木寡糖或木糖。
10. 如權利要求8所述的用途或權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的木聚糖選 自樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖。
11. 如權利要求8所述的用途或權利要求9所述的方法，其特征在于，所述含木聚糖的 物質(zhì)選自：紙漿、飼料和秸桿。
12. 如權利要求9 一 11中任一項所述的方法，其特征在于，所述的適合的反應條件 為：pH為3-12,優(yōu)選5. 5-10,更優(yōu)選約7. 0 ;溫度為15-90°C，優(yōu)選為30-60°C，更優(yōu)選為 50-55。。。
13. 如權利要求9 一 12中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括，在所述多 肽與與木聚糖或含有木聚糖的物質(zhì)混合物中還加入調(diào)節(jié)所述多肽的酶活性的添加物，所述 添加物選自K2+、Mn2+、Cu2+或Co2+或在添加至底物后可水解形成K 2+、Mn2+、Cu2+或Co2+的物 質(zhì)。
14. 一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1 一 3中任一項所述的多 肽以及食品學或工業(yè)上可接受的載體。
15. -種提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性方法，其特征在于，所述方法包括： 將木聚糖酶多肽中對應于SEQ ID NO:2氨基酸序列的第32位和/或第223位的氨基 酸進行突變，所獲得的突變木聚糖酶相對于突變前的木聚糖酶熱穩(wěn)定性提高。
16. -種篩選熱穩(wěn)定性提高的木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 以SEQ ID NO:2或其含有第19-267位氨基酸的片段為基礎，構建含有SEQ ID NO:2 或所述片段的突變體的文庫；和 (2) 對所述文庫中的突變體進行熱穩(wěn)定性測試； 其中，在相同的測試條件下，若突變體測試后活力下降的程度低于對照的下降程度至 少5%，則篩選該該突變體為熱穩(wěn)定性提高的木聚糖酶。
17. 如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述熱穩(wěn)定性測試包括在pH為3-12,優(yōu) 選5. 5-10,更優(yōu)選約7. 0 ;溫度為15-90°C，優(yōu)選為30-60°C，更優(yōu)選為50-55°C的條件下測 試突變體及對照的酶活，測試的底物選自樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖。
【文檔編號】C12P19/00GK104371988SQ201310357541
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權日:2013年8月15日
【發(fā)明者】周志華, 王錢福, 錢昌麗, 劉寧, 嚴興, 魏維, 王倩, 謝磊, 黃勇平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院