一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株P(guān)enicillium oxalicum WX-209及產(chǎn)酶方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株P(guān)enicillium?oxalicum?WX-209及產(chǎn)酶方法。所述草酸青霉Penicillium?oxalicum?WX-209從甘肅文縣腐爛核桃皮中篩選到，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2013325。本發(fā)明發(fā)酵制取粗酶液的方法包括斜面培養(yǎng)、超聲波預(yù)處理底物（麩皮）、發(fā)酵、獲取酶液等步驟，在超聲波功率700～900W超聲處理底物40～55分鐘，有效提高了該菌株的纖維素酶（以CMCase酶計(jì)）活力，較未預(yù)處理對照組提高效果顯著，在降解纖維素應(yīng)用上具有很好的前景。
【專利說明】—株局產(chǎn)纖維素酶的菌株P(guān)en ici I I ium oxaI icumWX-209
及產(chǎn)酶方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)纖維素酶菌株及產(chǎn)酶方法，屬菌株發(fā)酵產(chǎn)酶【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生能源物質(zhì)，每年全球光合作用的產(chǎn)物高達(dá)
1.5 X IO11~2.0X 10nt，中國每年僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘?jiān)?稻草、秸桿等)就約有20億t。如何利用這些數(shù)量可觀的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)“下腳料”，開發(fā)系列高附加值產(chǎn)品成為當(dāng)今世界焦點(diǎn)問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外諸多專家開始嘗試?yán)梦⑸飳w維素進(jìn)行發(fā)酵降解，微生物產(chǎn)生的纖維素酶可將纖維素酶解為低分子量的己糖或戊糖，用于生產(chǎn)新型飼料、單細(xì)胞蛋白等，將緩解人類面臨的糧食、能源及環(huán)境危機(jī)，這一舉措即將儲(chǔ)量巨大的纖維素變?yōu)閮r(jià)值極為可觀的資源，對于目前社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大的戰(zhàn)略意義。在另一方面，微生物發(fā)酵纖維素過程中產(chǎn)生的纖維素酶可以制成酶制劑，在食品工業(yè)中也有著重要而廣泛的用途，可用于果蔬加工、油料作物加工、茶葉生產(chǎn)、酒精生產(chǎn)、啤酒生產(chǎn)、食醋釀造、活性物質(zhì)提取等方面，對上述行業(yè)的發(fā)展有著巨大的推動(dòng)作用。
[0003] 為了獲得酶活較高的野生纖維素降解菌，國內(nèi)外科學(xué)工作者自20紀(jì)60年代開始做了大量的工作，目前已篩選到很多纖維素降解菌，主要包括細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌等。已報(bào)道的對纖維素作用較強(qiáng)的菌株多是木霉屬、曲霉屬、青霉屬。本 申請人:通過剛果紅染色
初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩獲得高產(chǎn)纖維素酶菌株-草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209。
并對其發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行了研究。
[0004]纖維素在植物細(xì)胞壁中含量較高，但植物細(xì)胞細(xì)胞壁構(gòu)造復(fù)雜，纖維素分子鏈外層包裹著大量的半纖維素及數(shù)量可觀的木質(zhì)素，使細(xì)胞壁具有很強(qiáng)的剛性和韌性，同時(shí)多種成分構(gòu)成的復(fù)合物也使得單一酶無法有效降解底物；而且纖維素是由D-葡萄糖以β -1, 4糖苷鍵組成的大分子多糖，通常分子量為50000~2500000，相當(dāng)于300~15000個(gè)葡萄糖基，其分子內(nèi)和分子間形成大量氫鍵，使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，導(dǎo)致微生物難以利用，生物降解速率低。通常，通過蒸汽爆破等物理方式對底物進(jìn)行處理可以破壞細(xì)胞壁的宏觀結(jié)構(gòu)，但是普通機(jī)械處理耗能高，效率低，效果并不顯著。而超聲波則可以直接作用于細(xì)胞壁的微觀結(jié)構(gòu)，其原理是由于溶劑中含有氣體及微小雜質(zhì)，在溶劑中發(fā)射超聲波時(shí)，就會(huì)在溶劑和樣品之間形成聲波空化作用，導(dǎo)致溶液內(nèi)大量微小氣泡形成、增長、爆破和壓縮，對樣品產(chǎn)生破壞作用。超聲波空化時(shí)產(chǎn)生的巨大作用力會(huì)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使纖維素暴露并斷裂成易于利用的小分子，提高纖維素的降解速率。本發(fā)明通過超聲波處理麩皮纖維素，使其暴露并斷裂成菌種生長易于利用的小分子，從而提高菌種的生長及產(chǎn)纖維素酶效率。通過已有的報(bào)道，預(yù)處理手段大多是用于提高生物質(zhì)降解制備還原糖，對于降解產(chǎn)物提高微生物產(chǎn)酶的報(bào)道卻鮮有報(bào)道。
[0005]本發(fā)明關(guān)注于篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株，以及通過預(yù)處理提高其產(chǎn)酶效率。本發(fā)明以篩選得到的草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209為發(fā)酵菌株，以價(jià)格低廉的麩皮作為發(fā)酵底物，以簡單可操作的超聲波處理作為預(yù)處理手段獲得纖維素酶活較高的粗酶液。因此，本發(fā)明對于廢棄纖維素生物質(zhì)的高效利用及產(chǎn)高附加值工業(yè)產(chǎn)品具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)纖維素酶的草酸青霉Penicillium oxalicumWX-209，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013325，并提供一種通過超聲波預(yù)處理底物提高酶活力的產(chǎn)酶方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:從甘肅文縣境內(nèi)腐爛核桃皮中分離得到一株高產(chǎn)纖維素酶的草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209,已于2013年7月9日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013325，命名為草酸青霉WX-209Penicillium oxalicum WX-209? 草酸青霉 Penicillium oxalicum WX-209 的形態(tài)特征:
[0008]PDA平板上35°C培養(yǎng)I天為白色菌絲，培養(yǎng)2天形成外白色中間綠色產(chǎn)孢區(qū)的菌落，培養(yǎng)3天后菌落直徑為17-19_，菌落墨綠色，外緣白色(圖1);顯微觀察，菌絲交織，具橫隔；帚狀枝為對稱雙輪形；分生孢子橢圓形，半透明。
[0009]本發(fā)明所提供的Penicillium oxalicum WX-209可用于制備纖維素酶制劑,具有較高的產(chǎn)CMCase酶活力。草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209能夠在麩皮為唯一碳源的液體培養(yǎng)基上生長產(chǎn)酶，發(fā)酵工藝簡單可行，生長產(chǎn)酶迅速，廢棄物麩皮利用充分等特點(diǎn)。
[0010]采用所述的草酸 青霉菌株發(fā)酵產(chǎn)高活力酶的方法，包括以下步驟:
[0011]I)斜面培養(yǎng):將草酸青霉菌株P(guān)enicillium oxalicum WX-209抱子接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，35°C培養(yǎng)3~4天，用無菌水洗下孢子，制成孢子懸液備用；
[0012]2)底物前處理:取Mandels鹽溶液30ml加入質(zhì)量百分比為5~8%的麩皮，進(jìn)行超聲波處理，超聲波參數(shù)為:700~900W超聲處理40~55分鐘；
[0013]3)發(fā)酵:經(jīng)過前處理后的底物高壓滅菌20min，冷卻后按IXlO5~I X IO6個(gè)/mL的接種量接入草酸青霉孢子懸液，32°C~37°C、150~180r/min培養(yǎng)72h。
[0014]發(fā)酵容器為250mL搖瓶，裝液量為30~80mL。
[0015]本發(fā)明方法處理后粗酶液獲取及酶活測定:將培養(yǎng)液進(jìn)行抽濾或lOOOOr/min離心lOmin，分離得到的上清發(fā)酵液即為粗酶液，采用DNS法測定CMCase酶活力。
[0016]CMCase酶活力測定:取適當(dāng)緩沖液稀釋的酶液0.5mL加入1.5mLl.0% (W/V)的CMC-Na溶液(此溶液由pH=4.8，濃度0.05M檸檬酸緩沖液配置)于25mL具塞試管中，50°C反應(yīng)30min后加入2mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min，流水冷卻，用蒸餾水補(bǔ)充水分至刻度，540nm處測定吸光值。空白對照為在加入酶液前，先加入2mL的DNS終止反應(yīng)，其他步驟相同。酶活定義=ImL粗酶液在Imin分解底物產(chǎn)生I μ mol葡萄糖為一個(gè)酶活單位(U)。
[0017]超聲波預(yù)處理底物步驟中，所使用的儀器為寧波新芝生物科技有限公司制造的JY92-1I，超升功率700~900W超聲處理40~55分鐘效果最佳。
[0018]本發(fā)明具有以下優(yōu)勢:
[0019]I)成本低:整個(gè)發(fā)酵過程條件溫和，對設(shè)備要求不高而且耗能低，同時(shí)使用小麥麩皮作為發(fā)酵底物，充分利用了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的邊角料，既壓縮了纖維素酶的生產(chǎn)成本，又變廢為寶，充分利用了資源；
[0020]2)酶活力較高:本發(fā)明所涉及菌株具有較強(qiáng)的纖維素降解能力，通過超聲波預(yù)處理底物，能夠較明顯提高纖維素酶活。
[0021]3)應(yīng)用前景好:地球上纖維素儲(chǔ)量巨大，具有巨大的潛在價(jià)值，能否利用纖維素資源對社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大戰(zhàn)略意義，本發(fā)明立足于上述問題，對纖維素的利用進(jìn)行了嘗試，獲得了理想的結(jié)果，具有很好的前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明菌株P(guān)DA培養(yǎng)3天的菌落圖。 【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進(jìn)一步限定，本發(fā)明可以按
【發(fā)明內(nèi)容】
所述的任一方式實(shí)施。
[0024]實(shí)例1:草酸青霉Penicillium oxalicum WX-209的篩選及鑒定方法
[0025]a、初篩:從甘肅文縣發(fā)霉核桃、岳麓山土樣、桔園土樣、獼猴桃園土樣、岳麓山腐爛樹枝等18處采集樣品。取樣品5g加入100mL2% (ff/V) CMC-Na液體富集培養(yǎng)基，于35°C、170r/min搖床條件下富集培養(yǎng)3天后，取ImL培養(yǎng)液稀釋至106_108，取0.2mL稀釋液均勻涂布在CMC-Na為碳源的篩選平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天后，用剛果紅染色的方法篩選出透明圈較大的霉菌菌株共20支，進(jìn)一步進(jìn)行劃平板純化菌株，最后轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)保存。
[0026]b、復(fù)篩:配制Mandels營養(yǎng)液，250mL三角瓶裝液量50mL，加入質(zhì)量百分比2%的CMC-Na, 121°C高壓滅菌15min，接種初篩孢子懸液至I X IO6孢子/mL，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72h，溫度35°C，自然pH，轉(zhuǎn)速170r/min。發(fā)酵液離心后用于檢測CMCase酶活力。通過篩選獲得CMCase 酶活力較高的菌株 Penicillium oxalicum WX_209。
[0027]C、菌株鑒定:通過ITS序列擴(kuò)增比對鑒定,表明該序列與Penicillium oxalicum屬相似度為99%，證明為草酸青霉的菌株，最終命名為Penicillium oxalicum WX-209。
[0028]實(shí)施例2:
[0029]將草酸青霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上，350C生長4天后，用無菌水洗下孢子，制成孢子懸液4°C冷藏備用。
[0030]稱取麩皮2.4g投入到30ml Mandels營養(yǎng)液中，充分浸潤。浸潤后進(jìn)行超聲波預(yù)處理，在超聲功率800W條件下超聲處理50分鐘。處理后，高壓滅菌20min，滅菌結(jié)束后冷卻至室溫，在無菌條件下接入草酸青霉孢子，使接種孢子濃度達(dá)到I X IO6個(gè)/mL。將接種后的搖瓶置于恒溫?fù)u床中35°C培養(yǎng)72h，設(shè)置轉(zhuǎn)速為170r/min。將培養(yǎng)液抽濾或離心，得到粗酶液，用DNS法檢測酶液CMCase酶活力，測得CMCase酶活為7.15U，與未進(jìn)行超聲波預(yù)處理組(6.0U)對照活力提高15.2%。
[0031]實(shí)施例3:
[0032]將草酸青霉孢子接種到斜面培養(yǎng)基上，35°C生長3天后，用無菌水洗下孢子，制成孢子懸液4°C冷藏備用。
[0033]稱取麩皮2.4g投入到30ml Mandels營養(yǎng)液中，充分浸潤。浸潤后進(jìn)行超聲波預(yù)處理，在超聲功率800W條件下超聲處理55分鐘。處理后，高壓滅菌20min，滅菌結(jié)束后冷卻至室溫，在無菌條件下接入草酸青霉孢子，使接種孢子濃度達(dá)到I X IO5個(gè)/mL。將接種后的搖瓶置于恒溫?fù)u床中35°C培養(yǎng)72h，設(shè)置轉(zhuǎn)速為180r/min。將培養(yǎng)液抽濾或離心，得到粗酶液，用DNS法檢測酶液CMCase酶活力，測得CMCase酶活為6.70U,與未進(jìn)行超聲波預(yù)處理組(5.94U)對照活力提高 12.8%。
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)纖維素酶的草酸青霉菌株P(guān)enicillium oxalicum WX-209,保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013325o
2.一種采用權(quán)利要求1所述的草酸青霉菌株發(fā)酵產(chǎn)高活力纖維素酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)斜面培養(yǎng):將草酸青霉菌株P(guān)enicilliumoxalicum WX-209抱子接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，35°C培養(yǎng)3~4天，用無菌水洗下孢子，制成孢子懸液備用； (2)底物前處理:取Mandels鹽溶液30ml加入質(zhì)量百分比5~8%的麩皮，進(jìn)行超聲波處理，超聲波參數(shù)為:700~900W超聲處理40~55分鐘； (3)發(fā)酵:經(jīng)過前處理后的底物高壓滅菌20min，冷卻后按IXIO5~IX IO6個(gè)/mL的接種量接入草酸青霉孢子懸液，32°C~37°C、150~180r/min培養(yǎng)72h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:發(fā)酵容器為250mL搖瓶，裝液量為30~80mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:在Mandels營養(yǎng)液基礎(chǔ)上補(bǔ)充蛋白胨為速效氮源，濃度為lg/L。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103468583SQ201310350621
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】單楊, 夏金蘭, 高奇瑞, 李培駿, 張闖, 聶珍媛, 李高陽, 付復(fù)華 申請人:湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 中南大學(xué)