專利名稱：：纖維素酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由真菌宿主細(xì)胞生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
：纖維素和半纖維素構(gòu)成了一種生產(chǎn)可發(fā)酵糖的重要的可再生和廉價(jià)的碳源。纖維素由通過0_1，4糖苷鍵以直鏈連接在一起的D-葡萄糖單元構(gòu)成。半纖維素主要由直鏈木糖骨架和多個(gè)側(cè)鏈構(gòu)成，所述直鏈木糖骨架包含通過0-1，4糖苷鍵連接在一起的D-木糖單元，所述側(cè)鏈通過3_1，2或3_1，3糖苷鍵或酯鍵(例如，L-阿拉伯糖、乙酸、阿魏酸等)與所述木糖單元連接。里氏木霉(Trichodermareesei)(紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)的無性型)是一種能夠生產(chǎn)包含多種纖維素酶和半纖維素酶的纖維素酶混合物的絲狀真菌。它們包括兩種纖維二糖水解酶、八種內(nèi)切葡聚糖酶、四種木聚糖酶、兩種a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和一種甘露聚糖酶。里氏木霉(T.reesei)也生產(chǎn)多種幫助從纖維素和半纖維素生成單糖的輔助酶，包括乙酰木聚糖酯酶、木糖苷酶和數(shù)種葡萄糖苷酶。對里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶的調(diào)控是復(fù)雜的，其主要是在針對可用碳源應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄水平上被控制。葡萄糖通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控子如crel(Strauss，J.，etal.，1995，F(xiàn)EBSLetters376:103-107)和acel(Aro，N.，etal.，2003，Appl.Environ.Microbiol.69:56-65)的作用抑制纖維素酶基因表達(dá)。在限制葡萄糖的條件下，纖維素酶轉(zhuǎn)錄被抑制，轉(zhuǎn)錄的完全激活需要存在誘導(dǎo)性碳水化合物，如纖維素或連接的二糖如纖維二塘、槐糖、龍膽二糖和乳糖(Ilmen,M.，etal.，1997，Appl.Environ.Microbiol.631298-1306)。誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物(CIC)也導(dǎo)致半纖維素酶轉(zhuǎn)錄的激活(Mach，R.L.andZeilinger,S.，2003,Appl.Microbiol.Biotechnol.60515-522；Margolles-Clarketal.，1997,J.Biotechnol57:167-179)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)xyrl基因產(chǎn)物參與木糖對半纖維素酶和纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄激活(Striker,A.R.，etal.,2006,EukaryoticCell5:2128_2137)。盡管里氏木霉在誘導(dǎo)纖維素酶的條件下只產(chǎn)生低水平的木聚糖酶活性，然而以木糖或其他半纖維素源碳水化合物培養(yǎng)的里氏木霉培養(yǎng)物生產(chǎn)的酶系統(tǒng)的半纖維素酶活性高于纖維素酶活性。分泌的木聚糖酶的生產(chǎn)可被木聚糖(Bailey，M.J.,etal.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.40224~229)和阿拉伯糖(Xiongetal.,2004,Appl.Microbiol.Biotech64:353-358)增強(qiáng)。半纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄既被半纖維素或其分解產(chǎn)物又被纖維素所激活。在里氏木霉中，編碼木聚糖酶1和2(xlnl和xln2)的基因的轉(zhuǎn)錄被纖維素、槐糖、木聚糖和阿拉伯糖醇所激活，阿拉伯呋喃糖苷酶基因abfl的轉(zhuǎn)錄被阿拉伯糖、阿拉伯糖醇和木聚糖所激活(Margolles-Clark,etal.，1997，J.Biotechnol.57167-179)。然而，由于木聚糖酶表達(dá)的增加，纖維素酶在分泌酶組成中的相對比例下降。這導(dǎo)致纖維素酶的比活性降低，并因此需要更多總量的蛋白用于纖維素底物的有效水解。提供等摩爾量的纖維二糖和木二糖在里氏木霉菌株QM9414的搖瓶批式培養(yǎng)物中產(chǎn)生相似水平的木聚糖酶活性(Zeilinger，S.，etal.，1996，J.Biol.Chem.27125624-25629)。由這兩種培養(yǎng)物產(chǎn)生的纖維素酶活性未見報(bào)道。通過將碳源從100%乳糖更換為75%乳糖/25%木糖，里氏木霉菌株RutC30分泌在補(bǔ)料批式培養(yǎng)物中的木聚糖酶的才目對比列從0.8%上升至Ij3.5%(Margeot,A.,etal.,2007,posterpresentationatPhysiologyofYeastandFilamentousFungi,Espoo,Finland)。同時(shí)，四禾中主要纖維素酶組分(纖維二糖水解酶1和2，內(nèi)切葡聚糖酶1和2)的總比例從82%下降到62%。其他半纖維素酶和纖維素酶的比例未見報(bào)道。文獻(xiàn)報(bào)道了使用鋸末水解產(chǎn)物進(jìn)行的里氏木霉菌株RutC30的搖瓶批式培養(yǎng)物產(chǎn)生的分泌纖維素酶活性(以每ml培養(yǎng)物的濾紙單位表示)水平與使用纖維素水解產(chǎn)物相似(Lo,C-H.etal.，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.Spring(121-124):561_573)。所述鋸末水解產(chǎn)物通過用濃硫酸處理而產(chǎn)生，且就鋸末而言，該鋸末水解產(chǎn)物由25-40%半纖維源碳水化合物、5-9%誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物、13-45%葡萄糖和2-45%寡糖組成。然而，由于沒有給出有關(guān)鋸末水解產(chǎn)物對半纖維素酶活性或總分泌蛋白的作用的信息，因此無法評估所述鋸末水解產(chǎn)物對纖維素酶和半纖維素酶在所分泌蛋白中的相對比例的影響。半纖維素酶的相對比例也可通過調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH進(jìn)行控制(Bailey，MJ.，etal.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.40224~229)；木聚糖酶活性相對纖維素酶活性的比例在PH6-7時(shí)增加。曲霉(Aspergillus)中的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)錄受到pH倚賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子pacC的調(diào)控(Maccabe,A.P.，etal.，1998，J.Bacteriol.1801331-1333)。有時(shí)希望使用主要包含來源于半纖維素的木糖和其他戊糖(例如通過對木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)處理產(chǎn)生的戊糖)的碳水化合物源由真菌培養(yǎng)物生產(chǎn)高纖維素酶比例的纖維素酶混合物。美國專禾IjNo.4，461，648,5,916，780,6,090，595,6,043，392、4，600，590；Weiletal.，1997，Appl.Biochem.Biotechnol.681:21_40禾口0hgren，K.，etal.，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.Spring(121-124)1055-1067中描述了含有半纖維的木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理方法，所述文獻(xiàn)都以引用的方式納入本文中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及由真菌宿主細(xì)胞生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵方法。本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種生產(chǎn)纖維素的改進(jìn)方法。本發(fā)明提供一種生產(chǎn)其中纖維素酶比例高于半纖維素酶的纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，包括在有助于生產(chǎn)半纖維素酶的條件下培育一種能夠生產(chǎn)纖維素酶的宿主細(xì)胞。生產(chǎn)纖維素的方法包括木霉屬種或肉座菌屬種通過液體深層發(fā)酵以高生產(chǎn)力獲得的、具有高纖維素酶半纖維素酶比的真菌酶混合物的使用，其中用于所述方法的高于40%的碳源來自半纖維素源碳水化合物，高于3但低于20%的碳源來自誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物。本發(fā)明提供一種生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，包括在約20°C到約35°C的溫度和約3.0到約6.5的pH下為一種分泌纖維素酶的木霉屬或肉座菌屬宿主細(xì)胞提供一種用于纖維素酶生產(chǎn)的碳源達(dá)約3到約30天，其中所述碳源包含占所述碳源中存在的總碳的約40wt%(重量百分比)到約97襯％的半纖維素源碳水化合物和占所述碳源中存在的總碳約3wt%到約20襯％的誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物；以及獲得所述纖維素酶混合物。本發(fā)明包括上述發(fā)酵方法，其中占所述碳源中存在的總碳的約80wt%到約97襯％的為半纖維素源碳水化合物，占所述碳源中存在的總碳的約8wt%到約15wt%的為誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物。此外，所述纖維素酶混合物包含的纖維素酶與半纖維素酶的比例為至少21，或至少31。在如上所述發(fā)酵方法中使用的碳源還可包含一種或多種其他碳源。所述一種或多種其他碳源可為甘油或有機(jī)酸。此外，所述發(fā)酵方法可為批式、補(bǔ)料批式或連續(xù)式的。本發(fā)明提供如上所述的發(fā)酵方法，其中所述宿主細(xì)胞是里氏木霉菌株。本發(fā)明還提供如上所述的發(fā)酵方法，其中與碳源由半纖維素源碳水化合物組成的方法所產(chǎn)生的分泌纖維素酶的量相比，所述方法生產(chǎn)至少高2倍的分泌纖維素酶。本發(fā)明方法的特征還可為，與碳源由半纖維素源碳水化合物組成的方法的比生產(chǎn)率(specificproductivity)(qp)相比，其qp至少提高3倍。此外，本發(fā)明方法的特征還可為，與碳源由半纖維素源碳水化合物組成的方法中的比生產(chǎn)率(qp)相比，其、至少提高5倍。本發(fā)明還涉及通過如上所述的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物用于水解纖維素底物的用途。所述纖維素底物可為一種預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素底物。本發(fā)明還提供一種水解纖維素底物的方法，包括將通過權(quán)利要求1的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物加至所述纖維素底物以形成反應(yīng)混合物，其中所述纖維素底物的濃度為從約lg/L到約200g/L并且所述纖維素酶混合物以約0.1至約lOOmg蛋白/gm纖維素的濃度加入；將所述反應(yīng)混合物在約30°C到約60°C的溫度和約3.5到約7.0的pH下孵育約4小時(shí)到約120小時(shí)以水解纖維素并產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物。本發(fā)明部分基于以下意外發(fā)現(xiàn)含有半纖維素源碳水化合物(HDC)和誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物(CIC)的碳水化合物源可用于發(fā)酵方法以生產(chǎn)具有高纖維素酶比例和相應(yīng)的低半纖維素酶比例的真菌纖維素酶混合物。所述發(fā)酵方法的生產(chǎn)力顯著高于只使用半纖維素酶源碳水化合物的相同方法。本發(fā)明的這些特征和其他特征會通過下面參照附圖的描述更加清楚，其中圖1示出了由里氏木霉菌株RutC30(A)和P59G(B)在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中生成和分泌的纖維素酶混合物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，其中供給所述發(fā)酵的碳水化合物由0-15%的誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物(對于RutC30為纖維二糖，或?qū)τ赑59G為CIC混合物)和85-100%的木糖組成。圖2示出了由里氏木霉菌株P(guān)59G在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中生成和分泌的纖維素酶混合物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，其中供給所述發(fā)酵的碳水化合物由0%、2%或10%的誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物和100%、98%或90%的阿拉伯糖組成。圖3示出了由里氏木霉菌株P(guān)59G在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中生成的生物質(zhì)的量，其中供給所述發(fā)酵的碳水化合物(A)由如所示的0-15%的CIC混合物加85-100%的木糖組成或(B)由0-10%的纖維二糖加90-100%的阿拉伯糖組成。每個(gè)柱形表示三次獨(dú)立發(fā)酵的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖4示出了由里氏木霉菌株P(guān)59G在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中生成的分泌蛋白的量，其中供給所述發(fā)酵的碳水化合物(A)由如所示的0-15%的CIC混合物加85-100%的木糖組成或(B)由0-10%的纖維二糖加90-100%的阿拉伯糖組成。每個(gè)柱形表示三次獨(dú)立發(fā)酵的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。圖5示出了14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中的里氏木霉菌株P(guān)59G以mg分泌蛋白/g生物質(zhì)/h表示的平均比生產(chǎn)率(qp)，其中供給所述發(fā)酵的碳水化合物由(A)由如所示的0-15%的CIC混合物加85-100%的木糖組成或(B)由0-10%的纖維二糖加90-100%的阿拉伯糖組成。每個(gè)柱形表示三次獨(dú)立發(fā)酵的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及由真菌宿主細(xì)胞生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵方法。下面描述的為優(yōu)選實(shí)施方案，這些只以示例方式進(jìn)行描述，而非對實(shí)施本發(fā)明所必需的特征的組合進(jìn)行限制。本發(fā)明提供通過真菌細(xì)胞的發(fā)酵、優(yōu)選地通過液體深層培養(yǎng)發(fā)酵進(jìn)行的纖維素酶的生產(chǎn)。生產(chǎn)纖維素酶混合物的方法纖維素酶混合物可通過使生長旺盛的真菌培養(yǎng)物在適于宿主細(xì)胞的溫度和pH下在幾乎不含或不含葡萄糖但含有誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物(CIC)以及其他細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)素的培養(yǎng)基(固體或液體)上生長而產(chǎn)生。如本文所述，可使用任何已知的生產(chǎn)纖維素的方法，其中誘導(dǎo)物如純纖維素被替換為一種碳水化合物源，該碳水化合物源包含半纖維素源碳水化合物(HDC)和誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物(CIC)，優(yōu)選地包含約40%到約97%或之間任何量的HDC以及約3%到約20%或之間任何量的CIC。例如，約40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97%或之間任何量的HDC以及約3、4、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20%或之間任何量的CIC。對里氏木霉及相關(guān)絲狀真菌的液體深層發(fā)酵通常以批式、補(bǔ)料批式或連續(xù)式方法進(jìn)行。在批式方法中，將除用于好氧方法的氧氣以外的所有必需材料在操作起始時(shí)置于反應(yīng)器中，使發(fā)酵進(jìn)行至完成，然后收獲產(chǎn)物。在補(bǔ)料批式方法中，隨著培養(yǎng)液的取出，將一種或多種培養(yǎng)基組分連續(xù)或序貫供給所述培養(yǎng)物。在連續(xù)式方法中，以體積相等的速度連續(xù)地提供新鮮培養(yǎng)基并取出培養(yǎng)液體以將培養(yǎng)物維持在一個(gè)穩(wěn)定的生長速率。本發(fā)明的方法可以批式、補(bǔ)料批式、重復(fù)補(bǔ)料批式、連續(xù)式方法或它們的任何組合的方式進(jìn)行。例如，所述方法可為一種補(bǔ)料批式方法。本發(fā)明的方法可在從約20°C到約35°C或之間的任何溫度下進(jìn)行，例如在從約250C到約300C或之間的任何溫度下進(jìn)行，或在約20、22、25、26、27、28、29、30、32、35°C或之間的任何溫度下進(jìn)行。本發(fā)明的方法可在約pH3.0-6.5或之間的任何pH下進(jìn)行，例如在約pH3.5-5.5或之間的任何pH下進(jìn)行，或在約ρΗ3·0、3·2、3·4、3·5、3·7、3·8、4·0、4·1、4·2、4·3、4·4、4·5、4.6、4·7、4·8、4·9、5·0、5·2、5·4、5·5、5·7、5·8、6·0、6·2、6·5或之間的任何ρΗ下進(jìn)行。本發(fā)明的方法可進(jìn)行3-30天或之間任意長的時(shí)間，例如進(jìn)行3-10天或之間任意長的時(shí)間，進(jìn)行4-8天或之間任意長的時(shí)間，或進(jìn)行3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天或之間任意長的時(shí)間。本發(fā)明的方法可在至少1升的培養(yǎng)物中進(jìn)行，例如，在從約1到約400000升或之間任何量，在從10到約400000升或之間任何量，在從1000到約200000升或之間任何量，在從10000到約200000升或之間任何量，在約1、10、50、100、200、400、600、800、1000、2000、4000、6000、8000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90，000、95000、100000、150000、200000、300000、400000升的體積或之間任何量的培養(yǎng)物中進(jìn)行。本發(fā)明方法可在好氧即存在氧氣的條件下進(jìn)行，或在厭氧即無氧氣的條件下進(jìn)行。例如，所述方法可在好氧條件下進(jìn)行。與碳源只含有HDC且所用真菌菌株未就增加HDC的纖維素酶生產(chǎn)活性而被改造或選擇的相應(yīng)方法相比，本發(fā)明的發(fā)酵方法可產(chǎn)生高至少2.5倍、更優(yōu)選高3倍的分泌蛋白。例如，與碳源只含有HDC且所用真菌菌株未就增加HDC纖維素酶生產(chǎn)活性而被改造或選擇的相應(yīng)方法相比，本文所述方法可產(chǎn)生高2.5到約10倍或之間任意倍數(shù)例如約2.5,2.6、2.8、3·0、3·2、3·4、3·6、3·8、4·0、4·2、4·4、4·6、4·8、5·0、5·2、5·4、5·6、5·8、6·0、6·2、6·4、6.6、6·8、7·0、7·2、7·4、7·6、7·8、8·0、8·2、8·4、8·6、8·8、9·0、9·2、9·4、9·6、9·8、10倍或之間任意倍數(shù)的分泌蛋白，或者高于10倍的分泌蛋白。因此，本發(fā)明發(fā)酵方法的特征可為，與碳源只含有HDC且所用真菌菌株未就增加HDC纖維素酶生產(chǎn)活性而被改造或選擇的相應(yīng)方法相比，以mg產(chǎn)生的分泌纖維素酶/gm生物質(zhì)/h表示的比生產(chǎn)率提高至少3倍，更優(yōu)選地提高5倍，或之間任何倍數(shù)。存在如本文所述的不同量的HDC、CIC或HDC及CIC時(shí)蛋白生產(chǎn)的比生產(chǎn)率的提高示于表1。表1在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中生長在HDC加0_20%CIC中的里氏木霉菌株的液體深層培養(yǎng)物的蛋白和真菌細(xì)胞生產(chǎn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3用于這些發(fā)酵的CIC是包含基于總碳水化合物的56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物的誘導(dǎo)混合物。b用于這些發(fā)酵的CIC為纖維二糖。c對于P59G菌株，報(bào)告值為三次(木糖)或兩次(阿拉伯糖)重復(fù)發(fā)酵的平均結(jié)果；對于RutC30菌株，報(bào)告值為單次發(fā)酵的結(jié)果。發(fā)酵培養(yǎng)基在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在發(fā)酵過程中對所述真菌細(xì)胞提供至少兩種碳源半纖維素源碳水化合物(HDC)和誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物(CIC)。本文所用的術(shù)語半纖維素源碳水化合物或HDC是指一種或多種源自半纖維素并可被宿主微生物用于生長、酶生產(chǎn)或生長及酶生產(chǎn)的寡糖、二糖或單糖。HDC的非限制性實(shí)例^^K^H(xylo-oligosaccharide)、|^可{白tK胃II(arabinoxylo-oligosaccharide)、D-木糖、木二糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖和D-半乳糖。優(yōu)選地，HDC包含D-木糖和/或L-阿拉伯糖。源自HDC的碳為在發(fā)酵過程中供給真菌細(xì)胞的總碳量的從約40%到約97%。例如，源自HDC的碳可為在發(fā)酵過程中供給真菌細(xì)胞的總碳量的40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或之間任何量。例如，源自HDC的碳為在發(fā)酵過程中供給真菌細(xì)胞的總碳量的從約80%到約97%。本文所用的術(shù)語誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物或CIC是指一種或多種導(dǎo)致宿主細(xì)胞生產(chǎn)纖維素酶的寡糖、二糖或單糖。優(yōu)選地，CIC是一種或多種纖維二糖、槐糖或龍膽二糖。CIC可通過由一種或多種纖維素酶進(jìn)行的主要產(chǎn)生3連接的葡萄糖二聚體的纖維素的酶水解來產(chǎn)生?；蛘撸邼舛鹊钠咸烟菨{可縮合形成葡萄糖二聚體的混合物。產(chǎn)生葡萄糖的縮合反應(yīng)可通過稀酸催化并在120-150°c以上的溫度下進(jìn)行，或者用葡萄糖苷酶或纖維素酶催化并在約40-70°C的較適中的溫度下進(jìn)行(美國專利申請US2004/0121446A1)。本發(fā)明的實(shí)施并不受到所用的產(chǎn)生CIC的方法的限制。優(yōu)選地，源自CIC的碳為在發(fā)酵過程中供給真菌細(xì)胞的總碳量的從約3%到約20%或之間任何量。例如，源自CIC的碳可為在發(fā)酵過程中供給真菌細(xì)胞的總碳量的3%、4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%^；20%或之間的任何量。例如，源自CIC的碳為在發(fā)酵過程中供給真菌細(xì)胞的總碳量的從約8%到約15%或之間的任何量。除HDC和CIC以外，在發(fā)酵過程中供給宿主細(xì)胞的總碳量的從約0.到約20%或之間的任何量可包含一種或多種葡萄糖、甘油、有機(jī)酸或其他可被所述宿主細(xì)胞利用的碳源。例如，在發(fā)酵過程中供給宿主細(xì)胞的總碳量的約0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5、2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0、20%或之間的任何量可包含一種或多種葡萄糖、甘油、有機(jī)酸或其他可被所述宿主細(xì)胞利用的碳源。對于批式發(fā)酵，可在接種之前或同時(shí)將碳源加入發(fā)酵培養(yǎng)基。對于補(bǔ)料批式或連續(xù)式操作，也可在發(fā)酵過程中連續(xù)或間歇地供給碳源。優(yōu)選地，給料速率為0.2到2.5g碳/L培養(yǎng)物A或之間的任何量。更優(yōu)選地，給料速率為0.4到1.6g碳/L培養(yǎng)物/h或之間的任何量。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入其它營養(yǎng)素、維生素和礦物質(zhì)以提高宿主細(xì)胞的生長和酶生產(chǎn)。這些其他培養(yǎng)基組分可在用宿主細(xì)胞接種培養(yǎng)物之前、同時(shí)或之后加入。有時(shí)使用有機(jī)氮源如氨基酸和肽作為碳源；然而，這些有機(jī)氮源不計(jì)算在發(fā)酵過程中供給宿主細(xì)胞的總碳量之內(nèi)。發(fā)酵后，含有纖維素酶的發(fā)酵液可直接使用，或者可將纖維素酶通過例如過濾或離心從真菌細(xì)胞中分離出來。低分子溶質(zhì)例如未耗盡的發(fā)酵培養(yǎng)基組分可通過超濾而除去。纖維素酶可通過例如蒸發(fā)、沉淀、沉降或過濾而濃縮?？杉尤牖瘜W(xué)物質(zhì)例如甘油、蔗糖、山梨糖醇等以穩(wěn)定纖維素酶?？蓪⑵渌瘜W(xué)物質(zhì)如苯甲酸鈉或山梨酸鉀加入纖維素酶中以防止所包含微生物的生長。牛產(chǎn)纖維素酶的真菌細(xì)胞用于所述方法的真菌細(xì)胞可為任何屬于子囊真菌亞門(Acomycotina)或擔(dān)子真菌亞門(Basidiomycotina)的絲狀真菌，例如木霉屬、肉座菌屬、曲霉屬(Aspergillus)、腐質(zhì)酶屬(Humicola)、鏈孢霉屬(Neurospora)、Orpinomyces、赤霉菌屬(Gibberella)、翹孢霉屬(Emericella)、毛殼菌屬(Chaetomium)、鐮刀酶屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)、稻瘟菌屬(Magnaporthe)或平革菌屬(Phanerochaete)的種。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是木霉屬種或肉座菌屬種。最優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是里氏木霉菌株。可改造所述真菌細(xì)胞以增加或減少一種或多種同源或異源蛋白的生產(chǎn)和分泌。例如，可用一種或多種遺傳構(gòu)建體改造所述真菌細(xì)胞，所述遺傳構(gòu)建體包含與一個(gè)可被HDC和/或CIC誘導(dǎo)的啟動子可操作地連接的編碼纖維素酶的基因。例如，可根據(jù)美國專利No.6,015,703改造所述真菌細(xì)胞以過表達(dá)葡萄糖苷酶。也可根據(jù)共同未決的美國專利申請US2008/0057541A1和60/969，046改造所述宿主細(xì)胞以生產(chǎn)一種優(yōu)化的纖維素酶組分和輔助組分的混合物。制備包含與纖維素酶基因可操作地連接的CIC或HDC誘導(dǎo)型啟動子的遺傳構(gòu)建體的方法和遺傳改造真菌菌株的方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法，包括但不限于通過CaCl2、電穿孔、生物射彈轟擊、PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合來處理細(xì)胞(美國專利No.6，015，703和美國專利No.6，939，704)。纖維素酶混合物本文所用的纖維素酶混合物是在所述發(fā)酵過程中由真菌細(xì)胞分泌的纖維素酶、半纖維素酶和其他蛋白的混合物。使用本發(fā)明的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物優(yōu)選地具有約大于21的纖維素酶半纖維素酶組分比例(表2)。更優(yōu)選地，所述纖維素酶半纖維素酶比例為至少約31。最優(yōu)選地，所述纖維素酶半纖維素酶比例為至少約41。例如，所述半纖維素酶纖維素酶比例可為約21,2.51、31,3.51、41或之間的任意比例。表2在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中在HDC和CIC的液體深層培養(yǎng)物中生長的里氏木霉培養(yǎng)物的分泌酶的組成。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>女通過對在如實(shí)施例4中所述的每種條件下分泌到發(fā)酵液中的蛋白的SDS-PAGE分析的掃描光密度法確定。-k如實(shí)施例4中所述的對預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素底物的相對水解活性。3用于這些發(fā)酵的CIC是包含基于總碳水化合物的56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物的誘導(dǎo)混合物。b用于這些發(fā)酵的CIC為纖維二糖。纖維素底物的水解用本發(fā)明的發(fā)酵方法生產(chǎn)的分泌纖維素酶可用于纖維素底物的水解。術(shù)語“纖維素底物”是指源自植物生物質(zhì)并包含纖維素的任何底物，包括但不限于，用于生產(chǎn)乙醇或其他高價(jià)值產(chǎn)品的預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素原料、動物飼料、林業(yè)廢產(chǎn)品如紙漿和木片、以及紡織品。分泌纖維素酶對預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素和濾紙的活性示于表3。表3在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中在HDC和CIC的液體深層培養(yǎng)物中生長的里氏木霉培養(yǎng)物的纖維素酶混合物的活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>女通過對在如在實(shí)施例4所述的每種條件下分泌到發(fā)酵液中的蛋白的SDS-PAGE分析的掃描光密度法確定。-k如實(shí)施例4中所述的對預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素底物的相對水解活性；n.d.=未確定的。3用于這些發(fā)酵的CIC為包含基于總碳水化合物的56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物的誘導(dǎo)混合物。b用于這些發(fā)酵的CIC為纖維二糖。用本發(fā)明的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶可用于“預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素原料”的酶水解。預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素原料是一種植物來源的材料，其在預(yù)處理前含有至少20%纖維素(干重)，更優(yōu)選地含有超過約30%的纖維素，甚至更優(yōu)選地含有超過40%的纖維素，以及含有至少10%木素(干重)，更典型地含有至少12%木素(干重)，并且已經(jīng)過物理和/或化學(xué)加工以使其纖維更易于受到和/或接受纖維素分解酶的作用。預(yù)處理加工的非限制實(shí)例包括用以下物質(zhì)對木質(zhì)素纖維素原料進(jìn)行化學(xué)處理硫酸、亞硫酸，或其他酸；氨、石灰、氫氧化銨或其他堿；乙醇、丁醇或其他有機(jī)溶劑；或加壓水(參見美國專利No.4，461，648、5，916，780、6，090，595、6，043，392、4，600，590，Weiletal.，1997，Appl.Biochem.Biotechnol.681:21_40禾口Ohgren,K.,etal.,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.Spring(121-124):1055_1067；這些文獻(xiàn)以引用的方式納入本文中)。例如，可用本文所述方法生產(chǎn)的纖維素酶孵育纖維素底物，其中所述底物的濃度為約1至約200g纖維素/L反應(yīng)混合物或之間的任何量，例如約1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、20(^纖維素/L反應(yīng)混合物或之間的任何量，并且纖維素酶的劑量為約0.1至約100mg蛋白/g纖維素或之間的任何量，例如約0.1,0.5,1.0、2.0,5.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg蛋白/g纖維素或之間的任何量。可將所述反應(yīng)混合物孵育約4至約120小時(shí)或之間任意長的時(shí)間，其中溫度為約30至約60°C或之間的任何溫度，例如約30、35、40、45、50、55、60°C或之間任意溫度，pH為約3.5至約7.0或之間任意pH，例如約3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或之間的任意pH。孵育后，反應(yīng)產(chǎn)物(包括半纖維素源碳水化合物、誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物、葡萄糖、寡糖)可用于進(jìn)一步加工，例如作為生產(chǎn)乙醇、丁醇、糖醇、乳酸、乙酸的底物，或者終產(chǎn)物可使用本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)方法濃縮和純化。總之，本發(fā)明提供生產(chǎn)可用于纖維素底物水解的具有低半纖維素酶含量的纖維素酶的高生產(chǎn)力發(fā)酵方法。以上描述并非意圖以任何方式限制要求保護(hù)的發(fā)明。此外，所討論的特征的結(jié)合對本發(fā)明的解決方案可能并非絕對必需。實(shí)施例以下實(shí)施例將進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。然而，應(yīng)理解，這些實(shí)施例只用于說明，而不應(yīng)用于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1描述了以下實(shí)施例中使用的菌株。實(shí)施例2描述了使用HDC和CIC的補(bǔ)料批式和連續(xù)式發(fā)酵方法。實(shí)施例3描述了使用HDC和CIC的補(bǔ)料批式發(fā)酵方法的比生產(chǎn)率和產(chǎn)量的確定。實(shí)施例4描述了使用HDC和CIC的補(bǔ)料批式發(fā)酵中生產(chǎn)的纖維素酶混合物的表征。實(shí)施例1里氏木霉菌株以下實(shí)施例使用了里氏木霉菌株RutC30(ATCC#56765；Montenecourt，B.andEveleigh,D.1979.Adv.Chem.Ser.181:289_301)或P59G。菌株P(guān)59G是一種生產(chǎn)和分泌高水平的由里氏木霉bgll編碼的葡萄糖苷酶的遺傳改造菌株，如US6，015，703中所述。P59G的親本菌株BTR213是一種通過隨機(jī)誘變產(chǎn)生的RutC30的衍生菌株，其中首先就在含有酸性溶脹纖維素和4gr12-脫氧葡萄糖的基本培養(yǎng)基瓊脂上產(chǎn)生更大透明圈的能力進(jìn)行篩選，然后就在含有0.g/ml多菌靈(carbendazim)的乳糖培養(yǎng)基上生長的能力進(jìn)行篩選。實(shí)施例2使用HDC和CIC混合物的發(fā)酵將從冷凍(_80°C)的15%甘油原種中取出的木霉屬孢子接種于裝有馬鈴薯右旋糖瓊脂(PDA)的標(biāo)準(zhǔn)85mm陪替氏培養(yǎng)皿(Petriplate)中。這些培養(yǎng)皿在28°C下孵育3-5天以實(shí)現(xiàn)新鮮綠色孢子的匯合生長。為制備用于發(fā)酵試驗(yàn)的接種體，將取自單個(gè)PDA培養(yǎng)皿的孢子轉(zhuǎn)移到裝有添加了5.lg/L玉米漿粉和10g/L葡萄糖的750mL液體Berkley培養(yǎng)基(pH5.5)的2L帶擋板三角瓶中。將燒瓶使用軌道攪拌器(orbitalagitator)(型號G-52NewBrunswickScientificCo.)以lOOrpm在28°C下孵育3天。用于燒瓶的Berkley培養(yǎng)基組分g/L(nh4)2so41.4kh2po42.00MgS047H200.31CaCl22H200.53玉米漿干粉5.1葡萄糖10微量元素*lmL/L*微量元素轉(zhuǎn)1液含有5g/LFeS047H20；1.6g/LMnS04‘H20；1.4g/LZnS047H20。2a補(bǔ)料批式發(fā)酵將接種物燒瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有10L初始試驗(yàn)培養(yǎng)基(pH5.5)的14L試驗(yàn)規(guī)模的發(fā)酵容器(型號MF114NewBrunswickScientificCo.)中。所述容器以批式模式運(yùn)行直至培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡。此時(shí)，以連續(xù)方式從通常含有36w%的固體的備料中加入碳源。蠕動泵被用于以0.4g碳/L培養(yǎng)物/小時(shí)的給料速率遞送碳源。所述運(yùn)行的批式和補(bǔ)料批式部分的操作參數(shù)為通過500rpm的葉輪攪拌混合，以8標(biāo)準(zhǔn)升/min的速率注入空氣，溫度為28°C。使用與在線pH探頭連接的自動控制器和可加入10%氫氧化銨溶液的泵，將培養(yǎng)物PH在批式生長過程中維持在4.0-4.5，而在纖維素酶生產(chǎn)過程中維持在pH3.5。定時(shí)取出IOOmL發(fā)酵液樣品進(jìn)行生物質(zhì)和蛋白質(zhì)分析。總發(fā)酵時(shí)間通常介于96-144小時(shí)。補(bǔ)料批式發(fā)酵的初始培養(yǎng)基Μg/L·(NH4)2SO42.20KH2PO41.39MgSO4·7H200.70CaCl2·2H200.185玉米漿干粉6.00葡萄糖13.00微量元素*0.38mL/L*微量元素溶液含有5g/LFeSO4·7H20；1.6g/LMnSO4·H2O；1.4g/LZnSO4·7H20。將5-10mL的發(fā)酵液等分式樣稱重，通過玻璃微纖維真空過濾，然后在100°C下烘箱干燥4-24小時(shí)以確定發(fā)酵液的生物質(zhì)含量。根據(jù)下面的公式確定生物質(zhì)的濃度。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>濕樣品質(zhì)量(g)發(fā)酵液濾出液的蛋白濃度用Bradford試驗(yàn)測定。使用分光光度計(jì)測量595nm的吸收值以定量測量考馬斯亮藍(lán)G-250染料的顏色強(qiáng)度變化，這形成了此試驗(yàn)的基礎(chǔ)。所用的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)對照是已知組成和濃度的纖維素酶混合物。與只使用HDC的相應(yīng)方法相比，使用HDC和CIC的補(bǔ)料批式發(fā)酵方法產(chǎn)生了多3_5倍的蛋白，并產(chǎn)生了少10%-46%之間任意量的生物質(zhì)(表4，圖3)。表4在僅使用HDC或使用HDC和CIC的里氏木霉菌株的14L補(bǔ)料批式培養(yǎng)物中的分泌蛋白和真菌細(xì)胞塊的生產(chǎn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>aCIC誘導(dǎo)混合物，包含(基于總碳水化合物)56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物。b對于P59G菌株，報(bào)告值為三次(木糖)或兩次(阿拉伯糖)重復(fù)發(fā)酵的平均結(jié)果；對于RutC30菌株，報(bào)告值為單次發(fā)酵的結(jié)果。2b.連續(xù)發(fā)酵如上面的實(shí)施例2a所述制備木霉屬菌株接種物燒瓶。如上面的實(shí)施例2a所述，將接種物燒瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有5L初始試驗(yàn)培養(yǎng)基(pH5.5)的14L試驗(yàn)規(guī)模的發(fā)酵容器(ModelMFl14NewBrunswickScientificCo.)中。所述容器以批式模式運(yùn)行直至培養(yǎng)基中的葡萄糖耗盡。此時(shí)，以連續(xù)方式加入碳源和新鮮營養(yǎng)素。蠕動泵被用于以0.0251Γ1的稀釋速率，以0.85-1.Ig碳/L培養(yǎng)物/小時(shí)的給料速率遞送碳源。所述碳源由基于總碳水化合物的92%HDC和8%CIC組成。HDC是純的木糖、葡萄糖和阿拉伯糖的混合物或者通過麥秸的預(yù)處理產(chǎn)生的預(yù)處理水解產(chǎn)物，HDC由81.木糖、11.葡萄糖和7.8%阿拉伯糖組成。CIC是一種具有如下所示組成的誘導(dǎo)混合物。通過使用虹吸管將培養(yǎng)物體積在整個(gè)發(fā)酵過程中都維持在5L。所述運(yùn)行的批式和補(bǔ)料批式部分的操作參數(shù)為通過500rpm的葉輪攪拌混合，以8標(biāo)準(zhǔn)升/min的速率注入空氣，溫度為28°C。使用與在線pH探頭連接的自動控制器和可加入10%氫氧化銨溶液的泵，將培養(yǎng)物pH在批式生長過程中維持在4.0-4.5，而在纖維素酶生產(chǎn)過程中維持在pH3.5。定時(shí)取出IOOmL發(fā)酵液樣品進(jìn)行生物質(zhì)和蛋白質(zhì)分析。批式階段的總發(fā)酵時(shí)間通常為24小時(shí)，連續(xù)階段的總發(fā)酵時(shí)間為144小時(shí)。連續(xù)發(fā)酵營養(yǎng)培養(yǎng)基的組成R/kR(NH4)2SO41.68KH2PO41.06MgSO4·7H200.53CaCl2·2H200.11玉米漿干粉2.52微量元素*0.29(mL/L)糖(木糖、阿拉伯糖、葡萄糖)和aCIC)97*微量元素溶液含有5g/LFeSO4·7H20；1.6g/LMnSO4·H2O；1.4g/LZnSO4·7H20。aCIC:誘導(dǎo)混合物，包含(基于總碳水化合物)56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物。如實(shí)施例2a所述測定發(fā)酵液的含量和發(fā)酵液濾出液的蛋白濃度。如表5所示，使用各純糖或預(yù)處理水解產(chǎn)物的HDC混合物生長的培養(yǎng)物產(chǎn)生相似量的蛋白和細(xì)胞。表5在使用CIC和來自預(yù)處理水解產(chǎn)物或各純化學(xué)物質(zhì)的HDC混合物的里氏木霉的14L連續(xù)培養(yǎng)物中的分泌蛋白和真菌細(xì)胞塊的生產(chǎn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>aCIC:誘導(dǎo)混合物，包含(基于總碳水化合物)56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物。b報(bào)告值是兩次重復(fù)發(fā)酵的平均結(jié)果。實(shí)施例3比牛產(chǎn)率與只使用HDC的相應(yīng)方法相比，使用HDC和CIC的補(bǔ)料批式發(fā)酵方法表現(xiàn)出高4-12倍的比生產(chǎn)率(表6，圖4)。表6在僅使用HDC或使用HDC和CIC的里氏木霉菌株的14L補(bǔ)料批式培養(yǎng)物的比生產(chǎn)率。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>aCIC:誘導(dǎo)混合物，包含(基于總碳水化合物)56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物。b對于P59G菌株，報(bào)告值為三次(木糖)或兩次(阿拉伯糖)重復(fù)發(fā)酵的平均結(jié)果；對于RutC30菌株，報(bào)告值為單次發(fā)酵的結(jié)果。連續(xù)發(fā)酵方法使用CIC結(jié)合以通過麥秸的稀酸流預(yù)處理產(chǎn)生的HDC混合物(如美國專利4，461，648和5，916，780中所述)或結(jié)合以使用純糖制備的等價(jià)HDC混合物。這些HDC混合物基于總碳水化合物含有81.木糖、11.葡萄糖和7.8%阿拉伯糖。如表7所示，使用預(yù)處理水解產(chǎn)物或各純糖形式的HDC混合物的連續(xù)培養(yǎng)物的比生產(chǎn)率是相似的。表7使用CIC和來自預(yù)處理水解產(chǎn)物或各純化學(xué)物質(zhì)的HDC混合物的里氏木霉菌株的CSTR培養(yǎng)物的比生產(chǎn)率。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>棚列4昆使用SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)基于分子大小分離由實(shí)施例2中所述的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物的各個(gè)組分。為此目的，堆積凝膠為4%丙烯酰胺、0.125MTris-HCl,pH6.8；分離凝膠為12%丙烯酰胺、0.375MTris-HCl,pH8.8。用于凝膠制備的凝膠單體原液的丙烯酰胺雙丙烯酰胺比例為37.51。上樣前，將蛋白樣品在含有巰基乙醇的緩沖液中煮沸5分鐘進(jìn)行變性。按照大約10μg蛋白/泳道上樣到10X8X0.075cm凝膠上。電泳分離在200V下進(jìn)行約45分鐘。通過用考馬斯亮藍(lán)G-250染液染色使分級分離的蛋白顯現(xiàn)。通過SDS-PAGE分級分離的纖維素酶和半纖維素酶的比例用凝膠掃描測光密度法表征。此方法需要首先獲取用考馬斯亮藍(lán)G-250染料染色的凝膠的數(shù)字圖像。這是用CHEMIGENIUS2生物成像系統(tǒng)(SynopticsLtd.)和GeneSnapv6.03軟件包(SynopticsLtd.)完成的。然后基于一個(gè)給定樣品中顯示為可區(qū)分帶的分級分離纖維素酶和半纖維素酶蛋白的圖像信號強(qiáng)度相對于全部帶的總信號進(jìn)行表征。使用GeneToolsν3.05軟件包(SynopticsLtd.)按照默認(rèn)設(shè)置測定信號強(qiáng)度。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel電子數(shù)據(jù)表(MicrosoftInc.)進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過測量從預(yù)處理的麥秸底物中或?yàn)V紙中釋放的還原糖，測定了使用HDC和CIC的混合物的里氏木霉發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶混合物的比活。根據(jù)用于測量纖維素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)IUPAC方法(Ghose，T.K.，1987,Pure&Appl.Chem.59:257_268)進(jìn)行了對濾紙的水解。報(bào)告值是以IU/mg蛋白表示的纖維素酶比活。麥秸的水解如下進(jìn)行將發(fā)酵濾出液稀釋在含有0.5%苯甲酸鈉的50mMpH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中，再加入來自黑曲霉(Aspergillisniger)的β-葡萄糖苷酶制劑補(bǔ)足并與根據(jù)美國專利No.4，461，648制備的酸預(yù)處理的麥秸一起孵育；在50°C下將所述反應(yīng)混合物搖動24小時(shí)，目標(biāo)纖維素轉(zhuǎn)化水平大于70%。通過測定達(dá)到目標(biāo)纖維素轉(zhuǎn)化水平所需的酶量來計(jì)算酶活性。將這些酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為對照發(fā)酵濾出液的活性，所述對照發(fā)酵濾出液是在利用由葡萄糖的酸縮合生成的碳源生長的相同菌株的14L補(bǔ)料批式培養(yǎng)物中生產(chǎn)的。在試驗(yàn)中檢測的所有發(fā)酵濾出液的總蛋白量是相同的。如表8所示，與只利用HDC生長的培養(yǎng)物相比，由利用至少3%CIC且結(jié)合以HDC生長的里氏木霉培養(yǎng)物產(chǎn)生的發(fā)酵濾出液可生產(chǎn)出質(zhì)量更高的纖維素酶。在給予發(fā)酵物的碳源中加入至少3%的CIC提高了纖維素酶半纖維素酶的比例和用于纖維素底物的水解的纖維素酶的比活。表8在14L補(bǔ)料批式發(fā)酵中在HDC和CIC的液體深層培養(yǎng)物中生長的里氏木霉培養(yǎng)物的分泌酶的組成。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a用于這些發(fā)酵的CIC是包含(基于總碳水化合物)56%龍膽二糖、14%槐糖、6%纖維二塘、10%海藻糖、6%麥芽三糖、4%葡萄糖和14%其他碳水化合物的誘導(dǎo)混合物。b用于這些發(fā)酵的CIC為纖維二糖。e對預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素底物或?yàn)V紙的相對水解活性。值表示用來自三次(HDC=木糖)或兩次(HDC=阿拉伯糖)獨(dú)立14L發(fā)酵的濾出液的分泌酶進(jìn)行的三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值(n.d.=未確定的)。d純糖的混合物(81.木糖、11.葡萄糖和7.8%阿拉伯糖)。6預(yù)處理水解產(chǎn)物中的糖混合物(81.木糖、11.葡萄糖和7.8%阿拉伯糖)。權(quán)利要求一種生產(chǎn)纖維素酶混合物的發(fā)酵方法，所述方法包括在約20℃到約35℃的溫度和約3.0到約6.5的pH下為一種分泌纖維素酶的木霉屬(Trichoderma)或肉座菌屬(Hypocrea)宿主細(xì)胞提供一種用于纖維素酶生產(chǎn)的碳源達(dá)約3到約30天，所述碳源包含占所述碳源中存在的總碳的約40wt％到97wt％的半纖維素源碳水化合物和占所述碳源中存在的總碳的約3wt％到20wt％的誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物；以及獲得纖維素混合物。2.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中占所述碳源中存在的總碳的約80wt%到約97wt%的為半纖維素源碳水化合物，并且占所述碳源中存在的總碳的約8wt%到約15wt%的為誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物。3.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述纖維素酶混合物包含的纖維素酶與半纖維素酶的比例為至少21。4.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述纖維素酶混合物包含的纖維素酶與半纖維素酶的比例為至少31。5.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述碳源包含一種或多種其他碳源。6.權(quán)利要求5的發(fā)酵方法，其中所述一種或多種其他碳源為甘油或有機(jī)酸。7.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述宿主細(xì)胞是里氏木霉(Trichodermareesi)菌株。8.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中與其中所述碳源由半纖維素源碳水化合物組成的方法所產(chǎn)生的分泌纖維素的量相比，所述方法生產(chǎn)至少高2倍的分泌纖維素酶。9.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述方法的特征為，與所述碳源由半纖維素源碳水化合物組成的方法的比生產(chǎn)率(qp)相比，所述方法的、至少提高3倍。10.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述方法的特征為，與所述碳源由半纖維素源碳水化合物組成的方法中的比生產(chǎn)率(qp)相比，所述方法的、至少提高5倍。11.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述方法為補(bǔ)料批式的。12.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述方法為連續(xù)式的。13.權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述方法在好氧條件下進(jìn)行。14.通過權(quán)利要求1的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物用于水解纖維素底物的用途。15.通過權(quán)利要求1的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物用于水解預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素底物的用途。16.一種水解纖維素底物的方法，包括將通過權(quán)利要求1的發(fā)酵方法生產(chǎn)的纖維素酶混合物加至所述纖維素底物以形成反應(yīng)混合物，其中所述反應(yīng)混合物中纖維素的濃度為從約lg/L到約200g/L并且所述纖維素酶混合物以約0.Img蛋白/g纖維素到約IOOmg蛋白/g纖維素的濃度加入；將所述反應(yīng)混合物在約30°C到約60°C的溫度和約3.5到約7.O的pH下孵育約4小時(shí)到約120小時(shí)以水解所述纖維素底物并生成反應(yīng)產(chǎn)物。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述反應(yīng)產(chǎn)物包括半纖維素酶源碳水化合物、葡萄糖、寡糖、誘導(dǎo)纖維素酶的碳水化合物以及它們的組合。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述纖維素底物為預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素底物。全文摘要本發(fā)明提供了一種使用半纖維素源碳水化合物以生產(chǎn)其中纖維素酶比例高于半纖維素酶比例的纖維素酶混合物的發(fā)酵方法。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的纖維素酶的特征還在于高比生產(chǎn)率。獲得的纖維素酶混合物包含的纖維素酶比半纖維素酶至少多兩倍，并可用于水解纖維素底物尤其是預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素底物。文檔編號C12P19/02GK101809151SQ200880109552公開日2010年8月18日申請日期2008年8月28日優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日發(fā)明者B·E·福迪,G·D·芒克沃德,J·B·愛德華茲申請人:埃歐金能源公司