一株產(chǎn)果膠酶制劑的日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01及產(chǎn)酶方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株利用桔皮粉發(fā)酵產(chǎn)果膠酶制劑的菌株及利用表面活性劑提高其酶活的方法。本發(fā)明以日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01生產(chǎn)果膠酶制劑，制備所得果膠酶制劑活力以果膠酶活力、纖維素酶活力和半纖維素酶活力表征，果膠酶制劑的生產(chǎn)以粉碎的桔皮粉為唯一碳源，加入查氏培養(yǎng)基中的無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽，然后在液態(tài)發(fā)酵黑曲霉的培養(yǎng)基中添加0.1-0.5%（wt）的PEG4000，經(jīng)過3-5天搖床培養(yǎng)，外切果膠酶活力（Exo-Pectinase），纖維素酶活力（以CMCase酶計(jì)）和半纖維素酶活力（以木聚糖酶Xylanase計(jì)）較對(duì)照有明顯提高。此方法簡(jiǎn)單，能夠明顯提高曲霉產(chǎn)果膠酶制劑的能力，而且具有環(huán)境友好的特點(diǎn)，因此具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—株產(chǎn)果膠酶制劑的日本曲霉(Aspergi I Iusjaponicus)
PJ01及產(chǎn)酶方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及產(chǎn)果膠酶制劑的菌株及提高其酶活的產(chǎn)酶方法，具體涉及一株利用桔皮粉發(fā)酵產(chǎn)果膠酶制劑的菌株及利用表面活性劑提高其酶活的產(chǎn)酶方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柑橘加工過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的果汁、精油和其他副產(chǎn)物，其中橘皮是一種主要的固體副產(chǎn)物，大約占果實(shí)鮮重的50%，與此同時(shí)，新鮮橘皮被加工廠當(dāng)做垃圾廢棄而對(duì)環(huán)境造成很大壓力。以中國(guó)為例，全國(guó)每年產(chǎn)生皮渣在500萬t以上，僅湖南省柑橘皮渣產(chǎn)量高達(dá)65萬t。因此如何利用這些“垃圾”，開發(fā)成系列高附加值產(chǎn)品迫在眉睫。
[0003]橘皮的化學(xué)成分中果膠16.0%,纖維素22.5%,半纖維素6.0%,木質(zhì)素8.6%,因此可以作為微生物降解產(chǎn)酶制劑的優(yōu)良底物，制備的富含果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶的酶制劑?？梢杂糜诠崛〖俺吻?，植物韌皮組織的脫膠，提取柑橘皮中的檸檬油，提高紅酒的色度和穩(wěn)定性，動(dòng)物飼料等領(lǐng)域。另外，可用于生物酶法脫除柑橘囊衣，生物酶法脫囊衣是一種生產(chǎn)效率高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、安全性高、不污染環(huán)境的柑橘罐頭脫囊衣新技術(shù)。
[0004]近年來,單菌或混菌發(fā)酵產(chǎn)復(fù)合多酶(enzyme cocktail)的研究受到越來越多的關(guān)注。對(duì)于碳源選擇，Olsson、Botella等人發(fā)現(xiàn)霉菌發(fā)酵木質(zhì)素碳源、葡萄皮洛和玉米芯等生物質(zhì)都能夠產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶等復(fù)合多酶。國(guó)內(nèi)專利大多利用麩皮、秸桿、甜菜渣、蘋果渣等為復(fù)合碳源制備酶制劑，利用桔皮粉作為唯一碳源制備酶制劑還未見報(bào)道。
[0005]黑曲霉(Aspergi llusniger)作為生產(chǎn)宿主通常認(rèn)為是安全的(GRAS),而且能在合理的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酶，因此成為生產(chǎn)酶制劑的一種非常重要的菌種。但從公開報(bào)道的文獻(xiàn)中可以看出，對(duì)于其產(chǎn)果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶的研究大多集中在菌種篩選、鑒定及發(fā)酵條件的優(yōu)化上面。但是用于酶制劑的生產(chǎn)，其酶活力水平仍然不夠高，因此亟待找到限制其產(chǎn)酶能力的外部因素并優(yōu)化其培養(yǎng)條件。
[0006]眾所周知，諸如曲霉、木霉等真菌在降解植物細(xì)胞壁時(shí)產(chǎn)生胞外酶，因此分泌胞外酶與細(xì)胞通透性有直接關(guān)系，Tangnu等人發(fā)現(xiàn)合適濃度的Tween-80能夠促進(jìn)木霉分泌纖維素酶、半纖維素酶和β -葡萄糖苷酶的能力，曾光明等人通過在綠色木霉發(fā)酵纖維素的培養(yǎng)基中添加鼠李糖脂顯著提高其酶活力，Callow等人發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂和Triton X-100能夠促進(jìn)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的能力，但是利用表面活性劑促進(jìn)桔皮粉的降解產(chǎn)酶卻是一個(gè)空白。因此，利用一種價(jià)格低廉，低毒性環(huán)境友好的表面活性劑進(jìn)行生物發(fā)酵桔皮粉生產(chǎn)酶制劑具有良好開發(fā)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的之一在于提供一株利用桔皮粉發(fā)酵產(chǎn)果膠酶制劑的日本曲霉(Aspergillus japonicus)PJ01。本發(fā)明涉及的日本曲霉菌株已于2013年7月9日提交保藏。保藏單位為中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2013323，分類命名為日本曲霉 PJOlAspergillus japonicus PJOl0
[0008]日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl的形態(tài)特征:PDA平板上35°C培養(yǎng)I天為白色菌絲，培養(yǎng)2天形成黑色產(chǎn)孢區(qū)，培養(yǎng)4天后菌落直徑為50-60mm(圖4);分生孢子梗長(zhǎng)l-3mm,直徑20-30 μ m，透明；分生孢子球型，褐黑色，直徑40-60 μ m ;孢子直徑約為4-6 μ m，圓形。
[0009]本發(fā)明所提供的日本曲霉(Aspergillusjaponicus) PJOl可用于制備果膠酶制劑，酶制劑中含果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等復(fù)合酶活力。日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl能夠在桔皮粉為唯一碳源的液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)產(chǎn)酶,發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單可行，生長(zhǎng)產(chǎn)酶迅速，橘皮廢棄物利用充分，產(chǎn)品附加值高等特點(diǎn)。
[0010]本發(fā)明目的之二在于提供一種上述的日本曲霉(Aspergillusjaponicus) PJOl發(fā)酵來提高所產(chǎn)復(fù)合酶酶活的方法。
[0011]I)斜面培養(yǎng):將日本曲霉(Aspergillusjaponicus) PJOl抱子接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，34-36 °C培養(yǎng)3-5天，待孢子成熟后保藏至4°C ；
[0012]2)菌懸液制備:用含質(zhì)量百分比0.02-0.1%的吐溫-80的生理鹽水洗下PDA斜面培養(yǎng)基曲霉孢子，制成孢子懸液；
[0013]3)發(fā)酵培養(yǎng):柑橘皮50-60°C烘干，粉碎過10-20目篩；配制查氏培養(yǎng)基鹽溶液，250mL三角瓶裝液量50-100mL，加入質(zhì)量百分比1_3%的桔皮粉，質(zhì)量百分比0.1-0.5%的表面活性劑PEG4000 ;121°C高壓滅菌15_25min，接種孢子懸液至1 X 105-1 X 106個(gè)孢子/mL，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48-72h，溫度34-36°C，自然pH，轉(zhuǎn)速150_180r/min。
[0014]本發(fā)明采用的查氏培養(yǎng)基鹽溶液配方(g/L):NaN033-5, K2HPO3I, KC10.5，MgSO4.7Η200.5，F(xiàn)eSO4.7Η200.01。
[0015]本發(fā)明表面活 性劑的選擇:250mL三角瓶裝液量50_100mL，添加不同表面活性劑Tween-20、Tween-80、PEG4000、PEG6000、Triton X-100 及洗衣粉 0.3% (wt)。121?高壓滅菌15-25min，接種曲霉孢子懸液濃度至I X IO5-1 X IO6個(gè)/mL，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48_72h，溫度34-36°C，自然pH，轉(zhuǎn)速150-180r/min。由于桔皮粉中果膠成分含量比重最大，因此選定果膠酶活力較對(duì)照增加最大的PEG4000進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)(圖1)。
[0016]本發(fā)明表面活性劑PEG4000的最適濃度選擇:添加0.1-0.9%(wt)濃度的PEG4000，利用DNS法測(cè)定果膠酶活力(圖2)、纖維素酶活力和半纖維素酶活力(圖3)。
[0017]本發(fā)明酶液提取方法:將發(fā)酵獲得的產(chǎn)物用8000r/min離心10_15min去除固形物，上清液即為酶液，采用DNS法測(cè)定果膠酶活力、纖維素酶活力和半纖維素酶活力。
[0018]酶活力分析方法:
[0019]a、果膠酶活力測(cè)定:取適當(dāng)緩沖液稀釋的酶液0.5mL加入1.5mL0.5% (W/V)的果膠溶液(此溶液由pH=5.0，濃度0.1M乙酸緩沖液配置)于25mL具塞試管中，45°C反應(yīng)IOmin后加入2mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min，流水冷卻，用蒸餾水補(bǔ)充水分至刻度，540nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照為在加入酶液前，先加入2mL的DNS終止反應(yīng)，其他步驟相同。酶活定義:ImL粗酶液在Imin分解底物產(chǎn)生I μ mo I D-半乳糖醛酸為一個(gè)酶活單位(U)。
[0020]b、纖維素酶活力測(cè)定:取適當(dāng)緩沖液稀釋的酶液0.5mL加入1.5mLl.0% (W/V)的CMC-Na溶液(此溶液由pH=4.8，濃度0.05M檸檬酸緩沖液配置)于25mL具塞試管中，50°C反應(yīng)30min后加入2mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min，流水冷卻，用蒸餾水補(bǔ)充水分至刻度，540nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照為在加入酶液前，先加入2mL的DNS終止反應(yīng)，其他步驟相同。酶活定義=ImL粗酶液在Imin分解底物產(chǎn)生I μ mol葡萄糖為一個(gè)酶活單位(U)。
[0021]C、半纖維素酶活力測(cè)定:取適當(dāng)緩沖液稀釋的酶液ImL加入ImLl.0%(W/V)的木聚糖溶液(此溶液由pH=5.0，濃度0.1M乙酸緩沖液配置)于15mL具塞試管中，50°C反應(yīng)IOmin后加入2.5mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5min，流水冷卻，用蒸餾水補(bǔ)充水分至刻度，540nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照為在加入酶液前，先加入2.5mL的DNS終止反應(yīng)，其他步驟相同。酶活定義:lmL粗酶液在Imin分解底物產(chǎn)生I μ mol木糖為一個(gè)酶活單位(U)。
[0022]本發(fā)明在優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較研究了表面活性劑Tween-20、Tween-80、PEG4000、PEG6000、Triton X-100及洗衣粉對(duì)篩選菌株產(chǎn)酶活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEG4000較其他種類表面活性劑對(duì)菌株的三種酶酶活的改善較為突出。添加
0.1%-0.5%(wt)的PEG4000，經(jīng)過3-5天搖床培養(yǎng)，菌株的外切果膠酶活力(Exo-Pectinase)提高25.48%，纖維素酶活力(以CMCase酶計(jì))提高16.39%，半纖維素酶活力(以木聚糖酶Xylanase計(jì))提高11.66%。由于PEG具有良好的潤(rùn)滑性，熱穩(wěn)定性，低毒性及難揮發(fā)性等優(yōu)良特點(diǎn)，因此適用于工業(yè)酶制劑添加劑。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，能夠明顯提高曲霉產(chǎn)果膠酶制劑的能力，而且具有環(huán)境友好的特點(diǎn)，因此具有較好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1 為不同表面活性劑種類(Tween-20、Tween-80, PEG4000、PEG6000、TritonX-100及洗衣粉)對(duì)果膠酶制劑中外切果膠酶的影響；
[0024]圖2為不同濃度 表面活性劑PEG4000對(duì)果膠酶制劑中外切果膠酶活的影響；
[0025]圖3為不同濃度表面活性劑PEG4000對(duì)果膠酶制劑中纖維素酶和半纖維素酶活的影響；
[0026]圖4為本發(fā)明菌株P(guān)DA平板培養(yǎng)4天菌落圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]為了進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)而不是對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0028]實(shí)施例1:培養(yǎng)基制備
[0029]桔皮粉制備:柑橘皮50-60°C烘干，粉碎過10-20目篩，放置玻璃干燥器備用。
[0030]斜面培養(yǎng)基(g/L):去皮馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然，水IOOOmL ;121°C滅菌15min，放置試管斜面；冷卻后接種，35°C培養(yǎng)4天。
[0031]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):桔皮粉20，NaN035, K2HPO3I, KC10.5，MgSO4.7Η200.5，F(xiàn)eSO4.7Η200.01。
[0032]實(shí)施例2:孢子懸液制備
[0033]用含0.lwt%吐溫-80的生理鹽水洗下日本曲霉孢子,制成孢子懸液,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并放置至4°C冰箱保存。
[0034]實(shí)施例3:日本曲霉(Aspergillusjaponicus) PJOl的篩選及鑒定方法
[0035]a、初篩:從岳麓山土樣、桔園土樣、獼猴桃園土樣、岳麓山腐爛樹枝、水果市場(chǎng)腐爛橘子等15處采集樣品。取樣品5g加入至含IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于35°C、170r/min搖床條件下富集培養(yǎng)3天后，取ImL培養(yǎng)液稀釋至孢子數(shù)10_6_10_8個(gè)/mL,取
0.2mL稀釋液均勻涂布在分別以果膠、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)和木聚糖為碳源的篩選平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天后，用剛果紅染色的方法篩選出透明圈較大的霉菌菌株共20支，進(jìn)一步進(jìn)行劃平板純化菌株，最后轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)保存。
[0036]b、復(fù)篩:柑橘皮60°C烘干，粉碎過10-20目篩；配制查氏培養(yǎng)基鹽溶液，250mL三角瓶裝液量IOOmL,加入質(zhì)量百分比2%的桔皮粉，121 °C高壓滅菌15min，接種初篩孢子懸液至I父106個(gè)孢子/1^，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7211，溫度351:，自然？!1，轉(zhuǎn)速1701./!^!!。發(fā)酵液離心后用于檢測(cè)外切果膠酶、CMCase酶和木聚糖酶活力。通過篩選獲得外切果膠酶、CMCase酶和木聚糖酶活力較高的菌株日本曲霉(AspergiIlusjaponicus) PJ01。
[0037]C、菌株鑒定:通過ITS序列擴(kuò)增比對(duì)鑒定,表明該序列與Aspergillusjaponicus屬相似度為100%，證明為日本曲霉的新菌株，最終命名為Aspergillusjaponicus PJOl0
[0038]實(shí)施例4:產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0039]250mL三角瓶加入75mL發(fā)酵培養(yǎng)基，添加PEG40000.1% (wt)。121°C高壓滅菌15min，接種黑曲霉孢子懸液濃度為1父106個(gè)/1^，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7211，溫度351:，自然pH，轉(zhuǎn)速170r/min。外切果膠酶活力68.72U/mL,纖維素酶活力(以CMCase酶計(jì))1.33U/mL,半纖維素酶(以木聚糖酶計(jì))活力12.00U/mL，分別較對(duì)照提高12.95%，9.02%和5.17%。
[0040]實(shí)施例5:產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0041]250mL三角瓶加入75mL發(fā)酵培養(yǎng)基，添加PEG40000.3% (wt)。121°C高壓滅菌15min，接種黑曲霉孢子懸液濃度為1父106/1^，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7211，溫度35°C，自然pH，轉(zhuǎn)速170r/min。外切果膠酶活力76.34U/mL，纖維素酶活力(以CMCase酶計(jì))1.42U/mL，半纖維素酶(以木聚糖酶計(jì))活力12.74U/mL,分別較對(duì)照提高25.48%，16.39%和11.66%。[0042]實(shí)施例6:產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0043]250mL三角瓶加入75mL發(fā)酵培養(yǎng)基，添加PEG40000.5% (wt)。121°C高壓滅菌15min，接種曲霉孢子懸液濃度為1父106/1^，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7211，溫度35°C，自然pH，轉(zhuǎn)速170r/min。外切果膠酶活力70.12U/mL，較對(duì)照提高15.25% ;纖維素酶活力(以CMCase酶計(jì))1.40U/mL，較對(duì)照提高14.75% ;半纖維素酶活力(以木聚糖酶計(jì))10.9U/mL，較對(duì)照降低
4.47%ο
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)果膠酶制劑的日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2013323o
2.一種采用權(quán)利要求1所述的日本曲霉菌株發(fā)酵制備果膠酶制劑的方法，其特征在于: 1)斜面培養(yǎng):將日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl孢子接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，34-36°C培養(yǎng)3-5天，待孢子成熟后保藏至4°C ； 2)菌懸液制備:用含質(zhì)量百分比0.02-0.1%的吐溫-80的生理鹽水洗下PDA斜面培養(yǎng)基曲霉孢子，制成孢子懸液； 3)發(fā)酵培養(yǎng):柑橘皮50-60°C烘干，粉碎過10-20目篩；配制查氏培養(yǎng)基鹽溶液，250mL三角瓶裝液量50-100mL，加入質(zhì)量百分比1-3%的桔皮粉，質(zhì)量百分比0.1-0.5%的表面活性劑PEG4000 ;121°C高壓滅菌15_25min，接種孢子懸液至I X IO5-1 X IO6個(gè)孢子/mL，恒溫?fù)u床中培養(yǎng) 48-72h，溫度 34 -36°C，自然 pH，轉(zhuǎn)速 150_180r/min。
【文檔編號(hào)】C12R1/66GK103468582SQ201310350534
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】單楊, 夏金蘭, 李培駿, 高奇瑞, 張闖, 聶珍媛, 李高陽, 付復(fù)華 申請(qǐng)人:湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 中南大學(xué)