一株曲霉及其在制備果糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株曲霉及其在制備果糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了一株曲霉，其保藏號(hào)為CGMCC?No.8912。本發(fā)明公開(kāi)的棘孢曲霉菌株是一株產(chǎn)高活力胞外果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株，該菌株可以應(yīng)用于以蔗糖或糖蜜為原料生產(chǎn)低聚果糖，對(duì)促進(jìn)蔗糖的深加工和廢棄物的有效利用具有重要意義。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株曲霉及其在制備果糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。 一株曲霉及其在制備果糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 低聚果糖是指通過(guò)β-(2-1)糖苷鍵在蔗糖分子的果糖殘基上連接1-3個(gè)果 糖分子而形成的果糖寡聚體鹿果三糖、鹿果四糖、鹿果五糖及其混合物（Clevenger Μ A, Turnbull D, Inone H. Toxicological evaluation of neosugar :genotoxicity, carcinoge nicity and chronic toxicity. Int J Toxicol，1988, 7 :643 - 662)，因低聚果糖具有促進(jìn)人 類腸道有益細(xì)菌雙岐桿菌（Bifidobacterium)的增殖，降低血液中的膽固醇，改善血脂，促 進(jìn)鈣吸收、低熱量，低齲齒等特殊的生理功效而成為近年來(lái)市場(chǎng)增長(zhǎng)最快的健康食品配料。
[0003] 雖然低聚果糖天然存在于許多果蔬中，但其在果蔬中的含量較低且受到季 節(jié)限制，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，工業(yè)上是利用微生物所產(chǎn)生的酶對(duì)蔗糖的轉(zhuǎn) 果糖基作用或水解酶對(duì)菊粉的水解作用生產(chǎn)低聚果糖（Crittenden R G, Playne Μ J.Production,properties and applications of food grade oligosaccharides.Ternds Food Sci Tech, 1996, 7 :353 - 361)。而微生物酶法生產(chǎn)低聚果糖被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)有效 快捷的方法。微生物中廣泛存在低聚果糖合成酶類，常被用來(lái)作為工業(yè)化生產(chǎn)的菌種有黑 曲霉（Aspergillus niger)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)和出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans)等。
[0004] 合成低聚果糖的酶類一般稱為β -果糖基轉(zhuǎn)移酶（β-fructosyltransferase， E. C. 2. 4. 1. 9)，但因?yàn)樵撁傅霓D(zhuǎn)果糖基活力最初是由Bacon及Blanchard在研究釀酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)轉(zhuǎn)化酶（invertase)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，因此有些學(xué)者仍用 β -呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，E. C. 3. 2. 1. 26)這一水解酶名稱來(lái)稱呼這 (Nguyen Q D, Mattes F, Hoschke A, Production, purification and identification of fructooligosaccharides produced byβ -fructofuranosidase from Aspergillus niger IMI303386. Biotechnol Lett, 1999, 21 :183 - 186)。
[0005] 1988年，Hidaka等人發(fā)現(xiàn)一株高產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的黑曲霉菌株，且在高蔗糖濃度 下表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)移活性，該酶與濃度為50%的蔗糖溶液反應(yīng)，產(chǎn)物中低聚果糖的含量最 高達(dá)至丨J 69 % (Hidaka H, Hirayama M, Sumi Ν. Afructooligosaccharide-producing enzyme from Aspergillus niger ATCC20611. Agric Biol Chem, 1988, 52:1181-1187)。隨后，日本明 治制糖公司人員將該酶應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)商品化低聚果糖，其產(chǎn)品命名為明治低聚糖。此 后，低聚果糖合成酶及低聚果糖工業(yè)化生產(chǎn)的研究開(kāi)始熱門(mén)起來(lái)。
[0006] 由于受反應(yīng)混合物中蔗糖濃度的限制以及生成的副產(chǎn)物葡萄糖的抑制作用，通 過(guò)微生物的β-果糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)進(jìn)行低聚果糖的工業(yè)化生產(chǎn)，其理論的最大產(chǎn)率僅為 55-60 % (Yun Jff. Fructooligosaccharides-occurrence, preparation, and application. Enzyme Microb Tech, 1996, 19:107 - 117)。為了獲得高純度的低聚果糖，大部分研究人員 嘗試通過(guò)不斷將副產(chǎn)物葡萄糖和殘余蔗糖從反應(yīng)產(chǎn)物中轉(zhuǎn)移出來(lái)的方法獲得高純度低聚 果糖（Nobre C，Teixeira J A, Rodrigues L R. New trends and technological challenges in the industrial production and purification of fructooligosaccharides. Crit Rev Food Sci Technol, 2013, doi : 10. 1080/10408398. 2012. 697082)。Nishizawa 等人通過(guò)使用 一個(gè)具有納濾膜的膜反應(yīng)系統(tǒng)在反應(yīng)過(guò)程中移除葡萄糖，最后得到的產(chǎn)物低聚果糖的含量 約為 90% (Nishizawa K, Nakajima M, Nabetani H. Kinetic study on transfructosylation byβ-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC20611and availability of a membrane reactor for fructooligosaccharide production. Food Sci Technol Res, 2001，7:39 - 44)。另外，通過(guò)向反應(yīng)體系中加入葡萄糖氧化酶將葡萄糖氧化成葡萄 糖酸的方法，能夠使反應(yīng)體系中的葡萄糖濃度降低，解除副產(chǎn)物的抑制作用，從而使低聚 果糖的產(chǎn)量達(dá)到 90 % -98 % (g 低聚果糖 /gsucrose) (Yun J W, Song S K. The production of high-content fructooligosaccharides from sucrose by the mixed-enzyme system of fructosyltransferase and glucose oxidase. Biotechnol Lett, 1993, 15:573 - 576) 〇
[0007] 固定化技術(shù)具有方便固定化酶/細(xì)胞的回收和重復(fù)利用，易于產(chǎn)物分離純 化，且利于連續(xù)化操作，對(duì)降低生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益等具有重要意義。因此，也 被廣泛應(yīng)用于低聚果糖工業(yè)化生產(chǎn)可能性的研究。Cheng等利用海藻酸鈉對(duì)日本 曲霉（Aspergillus japonicas)菌絲體進(jìn)行固定化，并與鹿糖在一個(gè)42 °C填充床反 應(yīng)器內(nèi)反應(yīng)，反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行35天僅有17 %的酶活損失（Cheng C-Y. Production of fructooligosaccharides by immobilized mycelium of Aspergillus japonicas. J Chem Tech Biotechnol, 1996, 66:135-138)。
[0008] 由Novozymes A/S提供的商業(yè)酶試劑Pectinex Ultra SP-L來(lái)源于棘孢曲霉，該 商業(yè)酶具有果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，其最適pH和最適作用溫度分別為5. 0-7. 0、60°C，其與 鹿糖反應(yīng)后，低聚果糖的最大產(chǎn)量可占總糖含量的60. 7% (Ghazi I，F(xiàn)ernandez-Arrojo L, Garcia~Are11ano H. Purification and kinetic characterization of a fructosyltransferase from Aspergillus aculeatus. J Biotechnol, 2007, 128:204-211) 〇 該酶制劑也可有效利用甜菜糖漿和糖蜜轉(zhuǎn)化生成低聚果糖，反應(yīng)達(dá)到最大產(chǎn)量時(shí)，低聚 果糖分別占總糖含量的 56 % 和 49 % (Ghazi I，F(xiàn)ernandez-Arrojo L, Segura A G. Beet sugar syrup and molasses as low-cost feedstock for the enzymatic production of fructo-oligosaccharides. J Agric Food Chem, 2006, 54:2964-2968) 〇
[0009] 我國(guó)對(duì)低聚果糖的研究起步較晚，到"九五"期間才形成工業(yè)規(guī)模和商品化。原無(wú) 錫輕工業(yè)大學(xué)和中國(guó)食品發(fā)酵研究所分別承擔(dān)并成功完成了國(guó)家"九五"重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目"酶 法生產(chǎn)低聚果糖"和國(guó)家科委課題"寡果糖開(kāi)發(fā)"的研究，且將取得的成果成功應(yīng)用于工業(yè) 化生產(chǎn)。廣西大學(xué)利用微生物發(fā)酵法將蔗糖轉(zhuǎn)化為蔗果低聚糖的生產(chǎn)工藝技術(shù)也于1994 年通過(guò)了技術(shù)鑒定（廣西大學(xué)工業(yè)測(cè)試實(shí)驗(yàn)中心蔗果低聚糖研究課題組：蔗果低聚糖研究 課題成果鑒定技術(shù)報(bào)告，1994桂科鑒字1號(hào)，1994桂教高科鑒字01號(hào)）。但受低聚果糖和 蔗糖價(jià)格以及生產(chǎn)成本的制約，低聚果糖的應(yīng)用范圍比較窄，民眾認(rèn)知度不高，還未實(shí)現(xiàn)低 聚果糖惠澤大眾的目標(biāo)。
[0010] 國(guó)內(nèi)對(duì)低聚果糖的研究報(bào)道不少，但是關(guān)于果糖基轉(zhuǎn)移酶的研究報(bào)道并不多。除 上述幾家單位研究果糖基轉(zhuǎn)移酶外，目前雖有江門(mén)量子高科、山東保齡寶、武漢盛世天元等 單位生產(chǎn)低聚果糖，但上述幾家企業(yè)均沒(méi)有菌種，而是外購(gòu)酶制劑。且菌種多為胞內(nèi)酶，增 加了酶分離提純的成本。
[0011] 為降低生產(chǎn)成本，提高低聚果糖的純度，近年來(lái)，人們也在不斷嘗試采用新的方 法來(lái)研究高純度低聚果糖的制備，并取得了一定進(jìn)展。山東大學(xué)的Lu等人用4%海藻 酸鈉將Wickerhamomyces anomala細(xì)胞固定化，作用于反應(yīng)好的低聚果糖糖楽12h后發(fā) 現(xiàn)，93. 6%的單糖被用來(lái)進(jìn)行代謝而低聚果糖并未受到影響，低聚果糖的純度從54. 4% 提高到80. 1%，該固定化酵母細(xì)胞能夠重復(fù)利用10次且每次的低聚果糖含量的純度 均能達(dá)到 8〇 % 以上（Lu L，Wu J, Song D. Purification of fructooligosaccharides by immobilized yeast cells and identification of ethyl β -D-fructofuranoside as a novel glycoside formed during the process. Bioresource Technol, 2013, 132:365-369) 〇 臺(tái)灣的Sheu等人也利用類似方法將法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous) BCBR31346和BCBR22367進(jìn)行深層共培養(yǎng)，反應(yīng)結(jié)束后，新科斯糖（低聚果糖的另一種構(gòu) 型）的純度達(dá)到了 87. 4 % (Sheu D_C，Chang J-Y，Chen Y-J. Production of high-purity neo-fructooligosaccharides by culture of Xanthophyllomyces dendrorhous. Bioresource Technol, 2013, 132:432-435) 〇
[0012] 廣西是我國(guó)目前最大的產(chǎn)糖省份，具有豐富的蔗糖資源，其甘蔗種植面積占全 國(guó)常年糖料作物種植面積的85%以上，產(chǎn)甘蔗糖量在食糖總產(chǎn)量中占90%以上，占全國(guó) 總產(chǎn)糖量的60%以上（李小玲.廣西優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)甘蔗生產(chǎn)若干問(wèn)題與對(duì)策.沿海農(nóng)業(yè)科 技，2011，8:56-58)。
[0013] 分離篩選出產(chǎn)高活力胞外果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株對(duì)生產(chǎn)低聚果糖具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提供一株曲霉及其在制備果糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的 棘孢曲霉M105制備的液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑對(duì)鹿糖酶解時(shí)的最適作用pH為5. 0、最適作 用溫度為65°C、pH耐受性范圍較廣，在pH值為3. 5-10. 0條件下的酶活力降低不明顯，在溫 度為45°C以下，棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的穩(wěn)定性較好，DNS (3, 5-二硝基水楊 酸，3, 5-dinitrosalicylic acid)法檢測(cè)棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑酶活，該酶 在最適作用條件下（pH5. 0、65°C )對(duì)蔗糖的活力為4. 76U/mL。另外，棘孢曲霉M105的菌絲 體制備的固定化細(xì)胞對(duì)鹿糖酶解時(shí)的最適作用pH值為7. 0、最適作用溫度為45°C，在反應(yīng) 時(shí)間為10h時(shí)，對(duì)蔗糖酶解得到的低聚果糖的百分含量達(dá)到最大值即62. 99%，此時(shí)蔗糖轉(zhuǎn) 化率為88. 59%，可以連續(xù)循環(huán)使用至少5次。棘孢曲霉M105的菌絲體制備的固定化細(xì)胞 對(duì)糖蜜作用時(shí)的最適pH為7. 5,在pH值為6. 0-7. 5范圍內(nèi)，固定化細(xì)胞的酶活比較穩(wěn)定，在 反應(yīng)時(shí)間為12h時(shí)，對(duì)糖蜜作用得到的低聚果糖的百分含量達(dá)到最大值即48. 74%，此時(shí)蔗 糖轉(zhuǎn)化率為82. 91%。
[0015] 本發(fā)明提供一株曲霉，其保藏號(hào)為CGMCC No. 8912。
[0016] 上述曲霉的培養(yǎng)液、菌絲體、孢子或孢子培養(yǎng)液也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0017] 所述培養(yǎng)液是將所述曲霉或其孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的；
[0018] 所述基本培養(yǎng)基按照如下方法制備：鹿糖30g，酵母粉1. 5g，蛋白胨1. 5g， NaN033. 0g，ΚΗ2Ρ041· 0g，MgS04 · 7Η200· 5g，KC10. 5g，F(xiàn)eS04 · 7Η200· 01g，羧甲基纖維素鈉 2g， 以上溶質(zhì)用800mL去離子水溶解，然后調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 0,用去離子水定容至1L，115°C 濕熱滅菌；
[0019] 所述pH值具體用鹽酸或NaOH水溶液調(diào)節(jié)；
[0020] 所述pH值具體為6. 0 ;
[0021] 所述滅菌的時(shí)間具體為30min。
[0022] -種液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，按照如下方法制備：將所 述的曲霉的孢子液在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，收集上清液即得；
[0023] 所述培養(yǎng)的條件具體為26°C -32°C、180rpm-200rpm、培養(yǎng)5-7天，再具體為28°C、 180rpm、培養(yǎng)6天；
[0024] 所述基本培養(yǎng)基具體按照如下方法制備：鹿糖30g，酵母粉1. 5g，蛋白胨1. 5g， NaN033. 0g，ΚΗ2Ρ041· 0g，MgS04 · 7Η200· 5g，KC10. 5g，F(xiàn)eS04 · 7Η200· Olg，羧甲基纖維素鈉 2g， 以上溶質(zhì)用800mL去離子水溶解，然后調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 0,用去離子水定容至1L，115°C 濕熱滅菌；
[0025] 所述pH值具體用鹽酸或NaOH水溶液調(diào)節(jié)；
[0026] 所述pH值具體為6. 0 ;
[0027] 所述滅菌的時(shí)間具體為30min ;
[0028] 所述曲霉的孢子液具體是用無(wú)菌水制備的；
[0029] 所述離心的條件具體為4°C -15°C，3000rpm-4000rpm，離心半徑7cm - 15cm，離心 10min_15min，再具體為 4°C，3500rpm，離心半徑 7cm,離心 10min。
[0030] -種固定化細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，按照如下方法制備：將所述曲 霉的孢子液在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；取培養(yǎng)液中的菌絲體，將菌絲體與 2g/100ml-4g/100ml海藻酸鈉的水溶液按照l(shuí)g : (5ml-10ml)的比例混合，形成細(xì)胞/海藻 酸鈉懸浮液；將懸浮液滴入滅菌的2. 2g/100ml-4. 4g/100ml的CaC12水溶液中，制成珠狀固 定化細(xì)胞，將其固化即得；
[0031] 所述海藻酸鈉的水溶液的濃度具體為3g/100ml ;
[0032] 所述比例具體為lg :10ml ;
[0033] 所述CaCl2水溶液的濃度具體為3. 3g/100ml ;
[0034] 所述固化的條件具體為4°C -15°C中固化10h-24h，再具體為4°C固化24h ;
[0035] 所述培養(yǎng)的條件具體為28°C -32°C、180rpm-200rpm、培養(yǎng)2-4天，再具體為28°C、 180rpm、培養(yǎng)2天；
[0036] 所述基本培養(yǎng)基具體按照如下方法制備：鹿糖30g，酵母粉1. 5g，蛋白胨1. 5g， NaN033. 0g，ΚΗ2Ρ041· 0g，MgS04 · 7Η200· 5g，KC10. 5g，F(xiàn)eS04 · 7Η200· 01g，羧甲基纖維素鈉 2g， 以上溶質(zhì)用800mL去離子水溶解，然后調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 0,用去離子水定容至1L，115°C 濕熱滅菌；
[0037] 所述pH值具體用鹽酸或NaOH水溶液調(diào)節(jié)；
[0038] 所述pH值具體為6. 0 ;
[0039] 所述滅菌的時(shí)間具體為30min ;
[0040] 所述曲霉的孢子液具體是用無(wú)菌水制備的；
[0041] 所述菌絲體與所述海藻酸鈉的水溶液混合之前還包括將菌絲體用去離子水洗滌， 用紗布過(guò)濾并壓干的步驟；
[0042] 所述珠狀固定化細(xì)胞的直徑具體為5mm-10mm，再具體為5mm。
[0043] 一種生產(chǎn)低聚果糖的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，是在底物中加入所述的液態(tài) 果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑或所述的固定化細(xì)胞，進(jìn)行酶解反應(yīng)即得。
[0044] 上述方法中，所述底物為蔗糖；
[0045] 所述酶解中所用的酶為所述的液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑時(shí)，所述酶解反應(yīng)的條 件為pH值為3. 5-7. 0,具體為4. 5-6. 0,再具體為5. 0 ;所述溫度為30°C -80°C，具體為 50°C -70°C，再具體為 65°C ;
[0046] 所述酶解中所用的細(xì)胞為所述的固定化細(xì)胞時(shí)，所述酶解反應(yīng)的條件為pH值為 4. 0-8. 0,具體為6. 0-8. 0,再具體為7. 0 ;所述溫度為30°C -60°C，具體為40°C -50°C，再具 體為45°C。
[0047] 上述方法中，所述底物為糖蜜；
[0048] 所述酶解中所用的細(xì)胞為所述的固定化細(xì)胞時(shí)，所述酶解反應(yīng)的條件為pH值為 5. 0 - 7. 5,具體為6. 0-7. 5,再具體為7. 5 ;所述溫度為45°C。
[0049] 上述的曲霉、上述的培養(yǎng)液、菌絲體、孢子或孢子培養(yǎng)液在制備果糖基轉(zhuǎn)移酶和/ 或具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)品和/或制備低聚果糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050] 上述的液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑或上述的固定化細(xì)胞在制備果糖基轉(zhuǎn)移酶和/或 具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)品和/或制備低聚果糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0051] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述低聚果糖為蔗果三糖和/或蔗果四糖。
[0052] 本發(fā)明提供的棘孢曲霉菌株是一株產(chǎn)高活力胞外果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株，該菌株可 以應(yīng)用于以蔗糖或糖蜜為原料生產(chǎn)低聚果糖，對(duì)促進(jìn)蔗糖的深加工和廢棄物的有效利用具 有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0053] 圖1為棘孢曲霉M105在PDA平板上的菌落形態(tài)。
[0054] 圖2為光學(xué)顯微鏡下的棘孢曲霉M105的有隔菌絲（A)、分生孢子梗（B)、頂囊（C)、 分生小梗（D)及孢子（E)的顯微形態(tài)。
[0055] 圖3為棘抱曲霉M105的ITS序列和棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)菌株 A2S2_D14的ITS序列比對(duì)的結(jié)果。
[0056] 圖4為棘孢曲霉M105的β-微管蛋白（β-tubulin)基因序列和棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)菌株A2S3_D3的β-微管蛋白基因序列比對(duì)的結(jié)果。
[0057] 圖5為棘孢曲霉Μ105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑和蔗糖反應(yīng)后的產(chǎn)物分析。
[0058] 圖6為棘孢曲霉Μ105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的最適作用pH曲線。
[0059] 圖7為棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的最適作用溫度曲線。
[0060] 圖8為棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的pH耐受性曲線。
[0061] 圖9為棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的溫度耐受性曲線。
[0062] 圖10為棘孢曲霉M105菌絲體作為固定化細(xì)胞的最適作用pH曲線。
[0063] 圖11為棘孢曲霉M105菌絲體作為固定化細(xì)胞的最適作用溫度曲線。
[0064] 圖12為棘孢曲霉M105菌絲體作為固定化細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)程時(shí)間曲線。
[0065] 圖13為棘孢曲霉M105菌絲體作為固定化細(xì)胞的循環(huán)使用次數(shù)檢測(cè)結(jié)果。
[0066] 圖14為棘孢曲霉M105菌絲體作為固定化細(xì)胞對(duì)糖蜜作用的最適pH曲線。
[0067] 圖15為棘孢曲霉M105菌絲體作為固定化細(xì)胞對(duì)糖蜜作用的反應(yīng)進(jìn)程時(shí)間曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0068] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0069] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0070] 下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0071] 下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0072] 基本培養(yǎng)基的制備：蔗糖30g，酵母粉1. 5g，蛋白胨1. 5g，NaN033. 0g，KH2P041. 0g， MgS04 · 7H200. 5g，KC10. 5g，F(xiàn)eS04 · 7H200. Olg，羧甲基纖維素鈉 2g，用 800mL 去離子水溶解， 然后用濃鹽酸或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 0 (下述實(shí)施例中pH為6. 0)，用去離子水定 容至1L，115°C濕熱滅菌30min。
[0073] pH6. 0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制：將7. 71毫升0. 2M Na2HP04水溶液和 12. 29毫升0. 1M檸檬酸水溶液混合。
[0074] 在實(shí)施例1和實(shí)施例2中，果糖基轉(zhuǎn)移酶活力測(cè)定采用3, 5-二硝基水楊酸 (3, 5-dinitrosalicylic acid, DNS)法測(cè)定產(chǎn)生的還原糖（參考文獻(xiàn) "Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Cheml959, 31:426-428),具體步驟如下：
[0075] 1、用去離子水配制lmg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行8個(gè)梯度稀釋；每個(gè)稀釋度取 400 μ L葡萄糖液加入800 μ L DNS試劑，沸水浴5min顯色，冷卻至室溫，取200 μ L加入96 孔酶標(biāo)板，540nm處測(cè)定光吸收值；得到光吸收值和葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式 為y = 4. 1345X+0. 0305 (R2 = 0. 999)，y為540nm處的光吸收值，X為葡萄糖含量（μ g)。
[0076] 2、將10g蔗糖溶于100mL pH5. 0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，得到蔗糖溶液； 向2mL EP管中加入350 μ L蔗糖溶液，置于65°C的恒溫水浴鍋中；再加入50 μ L菌株M105的 培養(yǎng)液的上清液，65°C保溫30min，期間不斷振蕩，使酶與底物充分接觸；然后加入800 μ L DNS試劑，沸水浴5min顯色，冷卻至室溫，取200 μ L澄清液加入96孔酶標(biāo)板，于540nm處 測(cè)定光吸收值，將光吸收值帶入步驟1的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到反應(yīng)后的葡萄糖含量，進(jìn)而計(jì) 算酶活力。果糖基轉(zhuǎn)移酶活力定義：65°C條件下，每分鐘催化蔗糖生成1 μ mol還原糖所需 的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U)。
[0077] 糖蜜購(gòu)自廣西金源生物化工實(shí)業(yè)有限公司。
[0078] 下述實(shí)施例中的產(chǎn)物中的總糖量按照DNS法測(cè)定。
[0079] 下述實(shí)施例中的葡萄糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為10mg/mL，蔗果三糖、蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn) 品的濃度為lmg/mL，將標(biāo)準(zhǔn)品和反應(yīng)混合物在相同條件下進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，得到洗脫曲 線，計(jì)算各樣品的峰面積。分別將反應(yīng)混合物中的葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的洗 脫峰面積除以各自標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，再將得到的比值分別乘以各自標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，計(jì)算得 到反應(yīng)混合物中葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖的含量。
[0080] 實(shí)施例1、棘孢曲霉菌株M105的分離鑒定
[0081] 一、菌株的獲得
[0082] 1、產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的分離篩選
[0083] (1)用去離子水配制分離培養(yǎng)基（察氏固體培養(yǎng)基）；每升分離培養(yǎng)基中含有：蔗 糖 30g，NaN033. 0g，ΚΗ2Ρ041· 0g，MgS04 · 7Η200· 5g，KC10. 5g，F(xiàn)eS04 · 7Η200· Olg，羧甲基纖維 素鈉2g，瓊脂15g，自然pH, 115°C濕熱滅菌30min ;滅菌后冷卻至50°C倒平板。
[0084] (2)取實(shí)驗(yàn)室保存的29株曲霉菌株的菌液各2yL涂布至步驟⑴制備的平板上， 28°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)6天。
[0085] (3)配制pH6. 0的察氏培養(yǎng)基（液體），方法同步驟（1)，不加瓊脂，調(diào)pH為6. 0。
[0086] (4)將步驟（2)培養(yǎng)得到的真菌菌株接種至步驟（3)配制的察氏培養(yǎng)基（液體） 中，28°C、180rpm培養(yǎng)6天，取上清液，以蔗糖為底物反應(yīng)6h，取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行硅膠薄 層層析（thin layer chromatography, TLC)，從中篩選出能夠產(chǎn)生胞外果糖基轉(zhuǎn)移酶且酶活 力最商的菌株GXN15。
[0087] 2、菌株GXN15的誘變
[0088] (1)收集菌株GXN15的孢子懸液，將孢子濃度為108個(gè)/mL的孢子懸液lmL分裝至 已滅過(guò)菌的2mL EP管中，用封口膠封口，根據(jù)輻照梯度的個(gè)數(shù)分別裝入各EP管盒中，進(jìn)行鈷 源輻照誘變。
[0089] (2)將經(jīng)6°C〇i射線輻照誘變后的孢子懸浮液進(jìn)行10' 10' 10' 10' 10' 10' 1〇_77個(gè)濃度梯度稀釋，每個(gè)濃度吸100 μ L孢子懸浮液涂布在察氏固體平板上，以未經(jīng)過(guò)誘 變處理的孢子懸浮液作為對(duì)照組，每個(gè)濃度梯度做三個(gè)重復(fù)。平板于28°C恒溫培養(yǎng)箱倒置 培養(yǎng)四天，計(jì)算各誘變劑量下孢子懸液的致死率。
[0090] (3)選擇致死率達(dá)到99%以上的該輻照梯度下的孢子懸液進(jìn)行大量稀釋涂平板， 從中挑取突變株接種至察氏液體培養(yǎng)基中，28°C、180rpm培養(yǎng)6天，取上清液，以蔗糖為底 物進(jìn)行果糖基轉(zhuǎn)移酶活力測(cè)定，從中篩選出果糖基轉(zhuǎn)移酶活力明顯提高的突變株M105。
[0091] 二、菌株M105的鑒定
[0092] 菌株M105在葡萄糖瓊脂（PDA)平板上的菌落形態(tài)如圖1所示，該菌株在PDA上 28°C暗培養(yǎng)72h的菌落形成圓形，圓形外圍產(chǎn)生較密的白色菌絲，菌落呈絲絨狀質(zhì)地，菌叢 厚2-3_ ;菌落中央產(chǎn)生較密的黑色的分生孢子；菌落背面呈淺黃色；菌落無(wú)明顯氣味，菌 落表面干燥，無(wú)滲出液，不產(chǎn)生色素。
[0093] 菌株M105的菌絲在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)如圖2所示。分生孢子梗的主軸明顯，可 育分枝沿主軸方向依次產(chǎn)生，一級(jí)分枝可再次分枝或者直接產(chǎn)生瓶梗，瓶梗為直的或者稍 微彎曲的安瓿形，中間部位明顯膨大，基部稍縊縮。分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈 球形。頂囊表面長(zhǎng)滿一層或兩層輻射狀小梗（初生小梗與次生小梗）。最上層小梗瓶狀，頂 端著生成串的球形分生孢子。
[0094] 提取菌株M105的總DNA并作為模板，利用通用引物 ITS1(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，SEQ ID No.1)和ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATG-3 '，SEQ ID No. 2)，PCR擴(kuò)增得到該菌株的ITS的PCR產(chǎn)物，分別用引物ITS1和ITS4對(duì)產(chǎn)物 測(cè)序獲得了 552bp的核苷酸序列（SEQ ID No. 3所示）。同源性比對(duì)分析表明：該序列與棘 抱曲霉（Aspergillus aculeatus)菌株 A2S2_D14 的 ITS(GenBank 登錄號(hào)：JX501377. 1)的 比對(duì)得分最高，序列覆蓋度為100%，一致性為100% (如圖3所示）。
[0095] 提取菌株M105的總DNA并作為模板，利用β -微管蛋白基因的通用 引物 Bt2a(5, -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3, ，SEQ ID Νο·4)和 Bt2b(5' - ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'，SEQ ID No. 5)，PCR 擴(kuò)增得到該菌株 β -微管蛋白基因的 PCR產(chǎn)物，分別用引物Bt2a和Bt2b對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，獲得了 537bp的核苷酸序列（SEQ ID No. 6所示）。同源性比對(duì)分析表明：該序列與棘孢曲霉菌株A2S3_D3的β -微管蛋白基 因（GenBank登錄號(hào)：JX545070. 1)的比對(duì)得分最高，序列覆蓋度為100%，一致性為100% (如圖4所示）。
[0096] 根據(jù)該菌株的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》（魏景超，上海：上海科學(xué)技術(shù)出版 社，1979)，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，菌株M105鑒定為棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus)，該菌 株已于2014年3月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱 CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)， 保藏號(hào)為 CGMCCNo. 8912。
[0097] 實(shí)施例2、利用曲霉菌株M105制備果糖基轉(zhuǎn)移酶
[0098] 一、培養(yǎng)液的獲得
[0099] 1、孢子液的制備
[0100] (1)將 PDA 培養(yǎng)基（固體）115°C滅菌 30min。
[0101] (2)把PDA平板上傳代活化6天的由實(shí)施例1得到的棘孢曲霉M105的孢子用無(wú)菌 水洗下后制成孢子懸液，孢子濃度為1X 1〇8個(gè)/mL。
[0102] 2、粗酶液的制備
[0103] (1)取150mL基本培養(yǎng)基于500mL三角燒瓶中。
[0104] (2)取棘孢曲霉M105的孢子液按1%的接種量（體積百分含量）接種至基本培養(yǎng) 基中，28°C、180rpm，培養(yǎng)6天（26-32°C、180rpm-200rpm、培養(yǎng)5-7天均可），收集培養(yǎng)物。
[0105] (3)將培養(yǎng)物進(jìn)行離心，4 °C，離心半徑7cm，3500rpm，離心培養(yǎng)物 10min(4°C -15°C，離心半徑為 7cm_ 15cm，3000rpm-4000rpm，離心時(shí)間為 lOmin- 15min 均 可）去除菌體，收集上清液即為棘孢曲霉M105粗酶液。
[0106] 二、粗酶液中果糖基轉(zhuǎn)移酶的驗(yàn)證及其酶學(xué)特性
[0107] 1、粗酶液和蔗糖反應(yīng)后的產(chǎn)物分析
[0108] 將步驟一制備的粗酶液與pH6. 0、500g/L的蔗糖的水溶液于40°C恒溫水浴鍋中反 應(yīng)6h，沸水煮沸5分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。
[0109] HPLC 條件：島津（RID-10A)示差檢測(cè)器，依利特 NH2+(4.6mmX250mm)，溫度：30°C， 流動(dòng)相：乙腈/水（體積比75 :25)，流速：1. OmL/min。樣品上樣前用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾。
[0110] 圖5中各數(shù)字的意義分別為：1 :果糖，2 :葡萄糖，3 :蔗糖，4 :蔗果三糖，5 :蔗果四 糖。
[0111] 圖5表明，步驟一制備的棘孢曲霉M105粗酶液含有果糖基轉(zhuǎn)移酶，可以將蔗糖酶 解轉(zhuǎn)化為蔗果三糖和蔗果四糖。因此，該粗酶液也可以稱為果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑，下述將其記 為棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑。
[0112] 2、果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的最適作用pH和最適作用溫度
[0113] (1)最適作用pH
[0114] 將棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑按照DNS方法檢測(cè)其對(duì)蔗糖的酶活 力，僅分別用不同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（ρΗ3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、 6. 5)、Na2HP04_NaH2P04 緩沖液（ρΗ6· 5、7· 0、7· 5)、Tris-HCl 緩沖液（ρΗ7· 5、8· 0、8· 5)、 Glycine-NaOH 緩沖液（ρΗ8· 5、9· 0、9· 5、10. 0)，反應(yīng)溫度采用 40°C ;
[0115] 酶活力定義：40°C條件下，每分鐘催化蔗糖生成1 μ mol還原糖（相當(dāng)于等量的葡 萄糖）所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U)。
[0116] 以最高酶活力為100%,其它pH值的酶活力與最高酶活力的比值為相對(duì)酶活力， 以pH值為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖6所示。圖6表明，棘孢曲霉M105 液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的最適作用pH為5. 0，在pH值為4. 5-6. 0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。
[0117] (2)最適作用溫度
[0118] 將棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑按照DNS方法檢測(cè)其對(duì)蔗糖的酶活， 僅分別采用不同的反應(yīng)溫度（30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、 80°C )，反應(yīng)緩沖液采用pH5. 0的檸檬酸-磷酸氫二鈉。
[0119] 酶活力定義：ρΗ5· 0條件下,每分鐘催化鹿糖生成1 μ mol還原糖（相當(dāng)于等量的 葡萄糖）所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U)。
[0120] 以最高酶活力作為100%,其它溫度的酶活力與最高酶活力的比值為相對(duì)酶活力， 以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖7所示。圖7表明，棘孢曲霉M105液 態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的最適作用溫度為65°C。
[0121] 3、果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的pH耐受性和溫度耐受性
[0122] (1) pH 耐受性
[0123] 將棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑分別以等量混入不同pH值的緩沖液中 [檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（PH3. 5-6. 5)，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH6. 5-7. 5)， Tris-HCl 緩沖液（ρΗ7· 5-8. 5)，Glycine-NaOH 緩沖液（ρΗ8· 5 - 10. 0)]，于 4°C冰箱中靜置 24h后，按照DNS方法檢測(cè)其對(duì)蔗糖的酶活力。
[0124] 酶活力定義：65°C條件下，每分鐘催化蔗糖生成1 μ mol還原糖（相當(dāng)于等量的葡 萄糖）所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U)。
[0125] 以最高酶活力為100 %,其它pH值的酶活力與最高酶活力的比值為相對(duì)酶活力， 以pH值為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖8所示。圖8表明，棘孢曲霉M105 液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑在pH值為3. 5-10. 0條件下的酶活力降低不明顯，說(shuō)明M105的液態(tài) 果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的pH耐受性范圍較廣。
[0126] (2)溫度耐受性
[0127] 將棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑分別以等量分裝至不同EP管中，于不同 溫度下（30°C -75°C )保溫lh后，用DNS方法檢測(cè)其對(duì)蔗糖的酶活。
[0128] 酶活力定義：65°C條件下，每分鐘催化蔗糖生成1 μ mol還原糖（相當(dāng)于等量的葡 萄糖）所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U)。
[0129] 以最高酶活力作為100%,其它溫度的酶活力與最高酶活力的比值為相對(duì)酶活力， 以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖9所示。圖9表明，在溫度為45°C以 下，M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的穩(wěn)定性較好，超過(guò)45°C后，隨著溫度的升高，酶活急劇降 低。
[0130] 4、果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑對(duì)蔗糖的酶活力
[0131] DNS法檢測(cè)棘孢曲霉M105液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑酶活，該酶在最適作用條件下 (pH5· 0、65°C )對(duì)蔗糖的活力為 4. 76±0· llU/mL。
[0132] 實(shí)施例3、棘孢曲霉M105的菌絲體細(xì)胞的固定化
[0133] -、棘孢曲霉M105固定化細(xì)胞的制備
[0134] 將實(shí)施例2中步驟一制備的孢子懸液按1 %的接種量（體積百分含量）接種 于裝有150mL基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28°C、180rpm、搖床培養(yǎng)兩天（28°C -32°C、 180rpm - 200rpm、搖床培養(yǎng)2-4天均可）。取10mL培養(yǎng)后菌液的菌絲體，用去離子 水洗滌三次，用紗布過(guò)濾并壓干水，收集菌絲體。將海藻酸鈉加熱溶于滅菌水，制成 3g/100ml (2g/100ml - 4g/100ml均可）的海藻酸鈉水溶液。取lg菌絲體與10ml (5ml_10ml 均可）3g/100ml海藻酸鈉水溶液均勻混合，形成細(xì)胞/海藻酸鈉懸浮液，用注射器把懸浮液 滴入已除菌的3. 3g/100ml (2. 2g/100ml-4. 4g/100ml均可）的CaCl2水溶液中，制成直徑約 5mm(5mm-10mm均可）的珠狀固定化細(xì)胞，4°C固化24h (4°C -15°C固化10h_24h均可），得到 棘孢曲霉M105固定化細(xì)胞，備用。
[0135] 二、棘孢曲霉M105固定化細(xì)胞特性及產(chǎn)物分析
[0136] 1、最適反應(yīng)pH
[0137] 將步驟一制備的固定化細(xì)胞與10mL不同pH值[檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (PH3-7)，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH7-8)，Tris-HCl緩沖液（pH8-9)]的600g/L 蔗糖溶液45°C溫度下反應(yīng)6h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)。
[0138] HPLC 條件：島津（RID-10A)示差檢測(cè)器，依利特 NH2+(4. 6mmX250mm)，溫度：30°C， 流動(dòng)相：乙腈/水（體積比75 :25)，流速：1. OmL/min。樣品上樣前用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾。
[0139] 以低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖）占總糖的百分含量為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo) 作圖，結(jié)果如圖10所示。圖10表明，棘孢曲霉M105固定化細(xì)胞的最適作用pH值為7.0。
[0140] 低聚果糖占總糖的百分含量=(蔗果三糖生成量+蔗果四糖生成量）*100% /產(chǎn) 物中總糖量（下述計(jì)算方法相同）
[0141] 2、最適反應(yīng)溫度
[0142] 將步驟一制備的固定化細(xì)胞與10mL pH7.0600g/L蔗糖溶液在不同溫度（30°C， 35°C，40°C，45°C，50°C，55°C，60°C )下反應(yīng) 6h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) HPLC 分析檢測(cè)。
[0143] HPLC 條件：島津（RID-10A)示差檢測(cè)器，依利特 NH2+(4. 6mmX 250mm)，溫度：30°C， 流動(dòng)相：乙腈/水（體積比75 :25)，流速：1. OmL/min。樣品上樣前用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾。
[0144] 以低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖）占總糖的百分含量為縱坐標(biāo)，反應(yīng)溫度為橫坐 標(biāo)作圖，結(jié)果如圖11所示。圖11表明，棘孢曲霉M105固定化細(xì)胞的最適作用溫度為45°C。
[0145] 3、在最適條件下的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程
[0146] 將步驟一制備的固定化細(xì)胞與10mL600g/L蔗糖溶液在最適條件下（pH7. 0,溫度 為45°C )反應(yīng)不同時(shí)間（311、611、911、1211、1511、1811、2111、2411)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)冊(cè)^：分析檢測(cè)。
[0147] HPLC 條件：島津（RID-10A)示差檢測(cè)器，依利特 NH2+(4. 6mmX250mm)，溫度：30°C， 流動(dòng)相：乙腈/水（體積比75 :25)，流速：1. OmL/min。樣品上樣前用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾。
[0148] 以各糖（葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖）占總糖的百分含量為縱坐標(biāo)，低聚 果糖（蔗果三糖、蔗果四糖）占總糖的百分含量、蔗糖轉(zhuǎn)化率為次坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo) 作圖，結(jié)果如圖12所示。圖12表明，在反應(yīng)時(shí)間為10h時(shí)，低聚果糖的百分含量達(dá)到最大 值即62. 99 %，此時(shí)蔗糖轉(zhuǎn)化率為88. 59 %。
[0149] 蔗糖轉(zhuǎn)化率=(產(chǎn)物中總糖量-剩余蔗糖量）*100% /產(chǎn)物中總糖量（下述計(jì)算 方法相同）
[0150] 4、固定化細(xì)胞的循環(huán)使用情況
[0151] 將步驟一制備的固定化細(xì)胞與10mL600g/L蔗糖溶液在最適條件下（pH7.0,溫度 為45°C )，反應(yīng)6h，將反應(yīng)產(chǎn)物移去后，立即加入新鮮的10mL600g/L蔗糖溶液繼續(xù)在上述條 件下反應(yīng)l〇h，連續(xù)循環(huán)反應(yīng)。每次的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析檢測(cè)。
[0152] HPLC 條件：島津（RID-10A)示差檢測(cè)器，依利特 NH2+(4. 6mmX250mm)，溫度：30°C， 流動(dòng)相：乙腈/水（體積比75 :25)，流速：1. OmL/min。樣品上樣前用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾。
[0153] 以低聚果糖占總糖的百分含量為縱坐標(biāo)，循環(huán)次數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖13所 示。圖13表明，步驟一制備的固定化細(xì)胞能夠連續(xù)循環(huán)5次，每循環(huán)使用一次所得低聚果 糖占總糖的百分含量都有所降低。
[0154] 三、棘孢曲霉M105固定化細(xì)胞對(duì)糖蜜的轉(zhuǎn)化研究
[0155] 1、糖蜜pH值對(duì)反應(yīng)的影響
[0156] 初始糖蜜？!1值為4.75，將糖蜜用10111〇1/1似0!1水溶液調(diào)成不同的？!1值（?冊(cè).0、 5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0)，將步驟一制備的固定化細(xì)胞與不同pH值的糖蜜在45°C條件 下反應(yīng)6h，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析檢測(cè)。
[0157] HPLC 條件：島津（RID-10A)示差檢測(cè)器，依利特 NH2+(4. 6mmX250mm)，溫度：30°C， 流動(dòng)相：乙腈/水（體積比75 :25)，流速：1. OmL/min。樣品上樣前用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾。
[0158] 以低聚果糖占總糖的百分含量為縱坐標(biāo)，反應(yīng)pH為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖14所 示。圖14表明，在pH7. 5條件下，低聚果糖的百分含量最高，表明步驟一制備的固定化細(xì)胞 在此pH條件下活性最高。但在pH值為6. 0-7. 5范圍內(nèi)，固定化細(xì)胞的酶活比較穩(wěn)定。
[0159] 2、固定化細(xì)胞與糖蜜反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程研究
[0160] 將步驟一制備的固定化細(xì)胞與10mL pH7. 5的糖蜜于45 °C恒溫水浴鍋中反應(yīng)不同 的時(shí)間，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)分析。
[0161] HPLC 條件：島津（RID-10A)示差檢測(cè)器，依利特 NH2+(4. 6mmX250mm)，溫度：30°C， 流動(dòng)相：乙腈/水（體積比75 :25)，流速：1. OmL/min。樣品上樣前用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾。
[0162] 以各糖（葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖）占總糖的百分含量為縱坐標(biāo)，低聚 果糖占總糖的百分含量、蔗糖轉(zhuǎn)化率為次坐標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖15所示。 圖15表明，在反應(yīng)時(shí)間為12h時(shí)，低聚果糖的百分含量達(dá)到最大值48. 74%，此時(shí)蔗糖轉(zhuǎn)化 率為82. 91%。此后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，低聚果糖的百分含量以及蔗糖的轉(zhuǎn)化率等都在 逐漸降低。
[0001] 序列表 <"〇>廣叫人7: <120> _株_裕及其備采糖坫鈄移_中的應(yīng)!丨1 <160>6 <210>1 <211>19 <212>DXA <213>人_丨.序列 <220> <22 3 > C400M tccgtagglg aaccIgcgg 19 <210>2 <211>19 <2I2>DXA <213〉人11:序列 <220〉 <223〉 <4()0>2 I ccl ccgcl t al.t gal Hlg 19
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【權(quán)利要求】
1. 一株曲霉，其保藏號(hào)為CGMCC No. 8912。
2. 權(quán)利要求1所述曲霉的培養(yǎng)液、菌絲體、孢子或孢子培養(yǎng)液。
3. -種液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑，按照如下方法制備：將權(quán)利要求1所述的曲霉的孢子 液在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，收集上清液即得； 所述培養(yǎng)的條件具體為261：-321：、180印111-200印111、培養(yǎng)5-7天，再具體為281：、 180rpm、培養(yǎng)6天； 所述基本培養(yǎng)基具體按照如下方法制備：鹿糖30g，酵母粉1. 5g，蛋白胨1. 5g， NaN033. Og，ΚΗ2Ρ041· Og，MgS04 · 7Η200· 5g，KC10. 5g，F(xiàn)eS04 · 7Η200· Olg，羧甲基纖維素鈉 2g， 以上溶質(zhì)用800mL去離子水溶解，然后調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 0,用去離子水定容至1L，115°C 濕熱滅菌； 所述pH值具體用鹽酸或NaOH水溶液調(diào)節(jié)； 所述pH值具體為6. 0 ; 所述滅菌的時(shí)間具體為30min。
4. 一種固定化細(xì)胞，按照如下方法制備：將權(quán)利要求1所述曲霉的孢子液在基本培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；取培養(yǎng)液中的菌絲體，將菌絲體與2g/100ml-4g/100ml海藻酸鈉的 水溶液按照l(shuí)g : (5ml-10ml)的比例混合，形成細(xì)胞/海藻酸鈉懸浮液；將懸浮液滴入滅菌 的2. 2g/100ml-4. 4g/100ml的CaCl2水溶液中，制成珠狀固定化細(xì)胞，將其固化即得； 所述海藻酸鈉的水溶液的濃度具體為3g/100ml ; 所述比例具體為lg :l〇ml ; 所述CaCl2水溶液的濃度具體為3. 3g/100ml ; 所述固化的條件具體為4°C -15°C中固化10h-24h，再具體為4°C固化24h ; 所述培養(yǎng)的條件具體為28°C -32°C、180rpm-200rpm、培養(yǎng)2-4天，再具體為28°C、 180rpm、培養(yǎng)2天； 所述基本培養(yǎng)基具體按照如下方法制備：鹿糖30g，酵母粉1. 5g，蛋白胨1. 5g， NaN033. 0g，ΚΗ2Ρ041· 0g，MgS04 · 7Η200· 5g，KC10. 5g，F(xiàn)eS04 · 7Η200· Olg，羧甲基纖維素鈉 2g， 以上溶質(zhì)用800mL去離子水溶解，然后調(diào)節(jié)pH值至4. 0-6. 0,用去離子水定容至1L，115°C 濕熱滅菌； 所述pH值具體用鹽酸或NaOH水溶液調(diào)節(jié)； 所述pH值具體為6. 0 ; 所述滅菌的時(shí)間具體為30min。
5. -種生產(chǎn)低聚果糖的方法，是在底物中加入權(quán)利要求3所述的液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制 劑或權(quán)利要求4所述的固定化細(xì)胞，進(jìn)行酶解反應(yīng)即得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述底物為蔗糖； 所述酶解中所用的酶為權(quán)利要求3所述的液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑時(shí)，所述酶解反應(yīng)的 條件為pH值為3. 5-7. 0,具體為4. 5-6. 0,再具體為5. 0 ;所述溫度為30°C -80°C，具體為 50°C -70°C，再具體為 65°C ; 所述酶解中所用的細(xì)胞為權(quán)利要求4所述的固定化細(xì)胞時(shí)，所述酶解反應(yīng)的條件為pH 值為4. 0-8. 0,具體為6. 0-8. 0,再具體為7. 0 ;所述溫度為30°C -60°C，具體為40°C -50°C， 再具體為45 °C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述底物為糖蜜； 所述酶解中所用的細(xì)胞為權(quán)利要求4所述的固定化細(xì)胞時(shí)，所述酶解反應(yīng)的條件為pH 值為5. 0 - 7. 5,具體為6. 0-7. 5,再具體為7. 5 ;所述溫度為45°C。
8. 權(quán)利要求1所述的曲霉、權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)液、菌絲體、孢子或孢子培養(yǎng)液在制 備果糖基轉(zhuǎn)移酶和/或具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)品和/或制備低聚果糖中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求3所述的液態(tài)果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑或權(quán)利要求4所述的固定化細(xì)胞在制備果 糖基轉(zhuǎn)移酶和/或具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)品和/或制備低聚果糖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N11/10GK104059857SQ201410309113
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】馮家勛, 黃妹平, 徐強(qiáng)勝, 伍敏, 莫德姣 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)