一株少動鞘氨醇單胞菌菌株gxas-815及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株少動鞘氨醇單胞菌菌株及其應(yīng)用，其分類命名為少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas?paucimobilis)gxas-815，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?M2013327。本發(fā)明利用少動鞘氨醇單胞菌以蔗糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)冷膠，結(jié)冷膠產(chǎn)量達(dá)13.75g/L。
【專利說明】—株少動鞘氨醇單胞菌菌株gxas-815及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一株少動鞘氨醇單胞菌菌株gxas-815，從廣西南寧采集樣品篩選獲得，該菌株應(yīng)用于以蔗糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)冷膠。

【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)冷膠是一種新型微生物胞外多糖，是由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖及L-鼠李糖或甘露聚糖4種糖單元構(gòu)成的高分子聚合物。結(jié)冷膠用途非常廣泛，在食品領(lǐng)域主要用作增稠劑，是目前國際上集增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定于一體，性能優(yōu)越的食品膠之一。作為新型的微生物膠，在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)，結(jié)冷膠將逐步取代植物膠，如瓊脂、卡拉膠等，具有良好的市場前景。(魏春，張棟慧，應(yīng)向賢等.產(chǎn)結(jié)冷膠的黃色素缺陷型抗藥性鞘氨醇單胞菌WZ013發(fā)酵條件優(yōu)化.中國食品學(xué)報.2013，23(2):101-107)。結(jié)冷膠對酶穩(wěn)定，是絮凝效果好、易自然降解、不會引起二次污染等特點的新型絮凝劑。
[0003]少動鞘氨醇單胞菌又譯名少動鞘脂單胞菌，是結(jié)冷膠的發(fā)酵生產(chǎn)菌株。在污水處理的活性污泥中曾多次分離出少動鞘氨醇單胞菌，其具有絮凝活性，生產(chǎn)的結(jié)冷膠能溶于冷水，有良好的穩(wěn)定性，耐酸、耐高溫，熱可逆等特性，還能抵抗微生物及酶的作用，能作為生物絮凝劑的組成部分行使廢水處理等生物修復(fù)功能。國內(nèi)結(jié)冷膠生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)規(guī)模小、生產(chǎn)的結(jié)冷膠規(guī)格較少，工業(yè)化生產(chǎn)中依然存在發(fā)酵產(chǎn)率低，發(fā)酵過程中通氣攪拌能耗高，產(chǎn)物提取繁瑣，產(chǎn)品澄清困難等問題，直接導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，限制了國內(nèi)結(jié)冷膠行業(yè)的發(fā)展。在微生物多糖的發(fā)酵過程中，選擇合適的發(fā)酵條件是極其重要的。結(jié)冷膠是由少動鞘氨醇單胞菌在適宜的培養(yǎng)基中經(jīng)糖代謝合成，在合成過程中，糖類為主的碳源、蛋白質(zhì)為主的氮源構(gòu)成發(fā)酵原料成本的最大部分(胡桂萍，劉波，朱育菁等.少動鞘脂單胞菌產(chǎn)結(jié)冷膠發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面法優(yōu)化.生物數(shù)學(xué)學(xué)報.2012, 27 (3): 507-517)。
[0004]少動鞘氨醇單胞菌是一種好氧革蘭氏陰性桿菌，能在以葡萄糖、淀粉、蔗糖等作碳源，硝酸銨、酵母膏、蛋白胨等為氮源以及含其他微量元素的培養(yǎng)基中生長并產(chǎn)膠。國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，碳源、氮源、種齡、接種量、溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基初始PH都對其發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠有較大的影響。
[0005]以少動鞘氨醇單胞菌或者少動鞘脂單胞菌為檢索要素，在中國知識產(chǎn)權(quán)局共檢索到44項專利。這些專利涉及范圍主要有:少動鞘氨醇單胞菌新菌株的發(fā)現(xiàn)、基因的發(fā)掘和基因敲除重組菌構(gòu)建、相關(guān)酶制劑的生產(chǎn)、發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的生產(chǎn)方法和提取方法、作為微生物添加劑用于食品風(fēng)味改善和廢水處理等應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一株少動鞘氨醇單胞菌菌株及其應(yīng)用。這個菌株具有良好的發(fā)酵優(yōu)化和遺傳改造前景，同時也具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。
[0007]本發(fā)明所提供的少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) gxas-815是從廣西南寧采樣分離篩選得到的。
[0008]所述少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis) gxas_815CCTCC M2013327分離篩選方法:
[0009]a)采樣:從廣西南寧采集樣品，
[0010]b)富集:每個樣品各稱取Ig置于以蔗糖為主要碳源的培養(yǎng)基中，置于220r/min搖床30°C發(fā)酵72h，取粘度高的發(fā)酵醪進(jìn)行初篩，
[0011]c)初篩:將粘度高的發(fā)酵醪稀釋涂布篩選平板培養(yǎng)基，置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，從平板上挑選黃色、圓形、光滑、有光澤、低凸起、邊緣整齊的菌落進(jìn)行復(fù)篩，
[0012]d)復(fù)篩:從篩選平板上挑選單菌落于蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于220r/min搖床30°C發(fā)酵72h，發(fā)酵醪80°C水浴30min、離心去菌體、乙醇沉淀、烘干、經(jīng)傅立葉變換紅外光譜儀NicoletislO (Thermo)檢測，篩選結(jié)冷膠產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行優(yōu)化，
[0013]e)鑒定:經(jīng)生化自動鑒定儀和16S rDNA鑒定本菌株為少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)。
[0014]本發(fā)明的少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) gxas-815,可用于發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)冷膠。
[0015]所述發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)冷膠的具體方法是:將少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis) gxas-815接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于220r/min搖床,發(fā)酵溫度為30°C,發(fā)酵72h得到結(jié)冷膠發(fā)酵醪。
[0016]所述發(fā)酵培養(yǎng)基是以蔗糖為主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，蔗糖的質(zhì)量百分含量為3~4%，最適量為3% ;蛋白胨的質(zhì)量百分含量為0.2~0.4%，最適量為0.3% ;磷酸氫二鉀的質(zhì)量百分含量為0.05~0.2%，最適量為0.15%;硫酸鉀的質(zhì)量百分含量為0.1~0.3%，最適量為0.15% ;磷酸二氫鉀質(zhì)量百分含量為0.3~0.5%，最適量為0.25% ;無水硫酸鎂的質(zhì)量百分含量為0.2~0.4 %，最適量為0.3%。
[0017]所述接種是將生長至對數(shù)期的少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)gxas-815按照體積百分含量為10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0018]本發(fā)明的少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) gxas-815以鹿糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)冷膠，結(jié)冷膠產(chǎn)量最高可達(dá)13.75g/L。
[0019]保藏信息說明
[0020]少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) gxas-815,已經(jīng)保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCC No:M 2013327。保藏日期為2013年7月10日，保藏地址為武漢市武昌路珈山武漢大學(xué)。

【具體實施方式】
[0021 ]下列實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0022]實施例1
[0023]少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) gxas-815的分離、篩選與鑒定
[0024]第一步:采樣
[0025]在廣西北海潿洲島采集樣品。
[0026]第二步:富集
[0027]富集培養(yǎng)基組分:鹿糖5g,蛋白胨1g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,用蒸懼水定容到1000mL,pH6.0~7.2。將以上成份混合均勻，分裝于250mL容積的三角瓶中，每瓶裝50ml，115°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0028]每個樣品各稱取Ig分別置于裝有富集培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30°C搖床，220r/min培養(yǎng)72h，挑選發(fā)酵醪粘度較高的進(jìn)行篩選。
[0029]第三步:初篩
[0030]初篩平板培養(yǎng)基:鹿糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水100mL, ρΗ7.0 ~7.2，115°C高壓蒸汽滅菌 20min。
[0031]將發(fā)酵醪粘度較高的樣品稀釋涂布初篩平板培養(yǎng)基，置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑選黃色、圓形、光滑、有光澤、低凸起、邊緣整齊的菌落進(jìn)行復(fù)篩。
[0032]第四步:復(fù)篩
[0033]蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖30g，蛋白胨3g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鉀1.5g，磷酸二氫鉀2.5 g，無水硫酸鎂3g，用蒸餾水定容到1000mL，pH7.0。將以上成份混合均勻，分裝于250mL容積的三角瓶中，每瓶裝50ml，115°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0034]從初篩培養(yǎng)基平板上挑選單菌落于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C搖床220r/min發(fā)酵72h，對發(fā)酵醪進(jìn)行離心去菌體后乙醇沉淀、烘干、用紅外光譜儀檢測分析，最終選定一株利用蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)冷膠產(chǎn)量較高的菌株，命名為gxas-815。
[0035]第五步:鑒定
[0036]生理生化特征:
[0037]

【權(quán)利要求】
1.一株少動鞘氨醇單胞菌菌株,其分類命名為少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)gxas-815，于2013年7月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為:CCTCC M2013327。
2.權(quán)利要求1所述的少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis) gxas-815在發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)冷膠中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵結(jié)冷膠的方法是將少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) gxas-815接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于220r/min搖床，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵72h得到結(jié)冷膠發(fā)酵醪。
4.根據(jù)權(quán)利要求2-3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述接種是將生長至對數(shù)期的少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis) gxas-815按照體積百分含量為5~10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基是以蔗糖為主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，蔗糖的質(zhì)量百分含量為3~4%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有蛋白胨，質(zhì)量百分含量為0.2~0.4 %，磷酸氫二鉀的質(zhì)量百分含量為0.05~0.2 %，硫酸鉀的質(zhì)量百分含量為0.1~0.3%,磷酸二氫鉀質(zhì)量百分含量為0.3~0.5%,無水硫酸鎂的質(zhì)量百分含量為 0.2 ~0.4%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的質(zhì)量百分含量為蛋白胨0.3%，磷酸氫二鉀0.15%，的硫酸鉀0.15%，磷酸二氫鉀0.25%，無水硫酸鎂0.3%。
【文檔編號】C12N1/20GK104164385SQ201410309093
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月29日
【發(fā)明者】林麗華, 裴建新, 郭媛, 龐浩, 莫莉, 黃日波 申請人:廣西科學(xué)院