一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）菌株KF-2，保藏編號為CGMCC?No.7690，另外本發(fā)明提供了利用該枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法。使用該菌株發(fā)酵豆粕后測定一些指標(biāo)，粗蛋白含量達(dá)到51%以上，酸溶蛋白含量達(dá)到6%以上，活菌數(shù)達(dá)到20億個/克發(fā)酵豆粕，揮發(fā)性鹽基氮低于50mg/100g。
【專利說明】一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]飼料級微生物添加劑是近年來發(fā)展起來的一類新型飼料添加劑，在提高飼料利用率，增加生產(chǎn)性能，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，增加免疫力等方面具有顯著的促進(jìn)作用。目前在飼料及動物生產(chǎn)上使用較多的微生物有乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌及光合細(xì)菌，其中芽孢桿菌具有抗逆性強、耐高溫高壓、耐酸堿膽鹽、易貯存等獨特的生物特性，從動物生產(chǎn)和飼料工業(yè)角度評價，其能更好地滿足飼料用微生物現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的要求。
[0003]枯草芽孢桿菌在代謝過程種可產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及其他有益因子，進(jìn)入生物體內(nèi)后能快速定殖，在腸道內(nèi)形成良好的微生態(tài)環(huán)境，具有加強動物消化能力，降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，增加飼料利用率，增強動物免疫力等功效。我國農(nóng)業(yè)部公布的可以直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種中就包括了枯草芽孢桿菌，其作為安全益生菌，現(xiàn)已在飼料領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
[0004]豆柏是畜禽最重要的植物性蛋白源，其粗蛋白含量高達(dá)43%~48%，并有較平衡的氨基酸組成，尤其是含有其它植物性飼料易缺的賴氨酸，其含量高達(dá)2.5%~2.8%。但豆柏中還存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，極大地影響了豆柏的飼用價值。胰蛋白酶抑制素是豆柏中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，在豆柏中的含量為2%左右。胰蛋白酶抑制素能阻礙腸道內(nèi)蛋白水解酶的作用而使蛋白質(zhì)消化率下降，還能作用于胰腺本身，刺激胰腺分泌過多的胰腺酶，造成蛋白質(zhì)內(nèi)源代謝損失，導(dǎo)致動物出現(xiàn)消化吸收功能失調(diào)或紊亂，抑制機(jī)體的生長現(xiàn)象。利用微生物固態(tài)發(fā)酵可改善這一狀況?？莶菅挎邨U菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性。
[0005]但是，現(xiàn)報道生 產(chǎn)的微生物菌株存在諸多問題，如發(fā)酵時間長(因此容易引起霉變)、發(fā)酵過程水分過高，抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解不徹底、發(fā)酵后粗蛋白和小肽(酸溶蛋白)含量不聞等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的技術(shù)方案。
[0007]本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌(ifeci77i/5.菌株KF-2,保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，保藏日:2013 年 06 月 09 日，保藏號:CGMCCN0.7690。
[0008]所述的枯草芽孢桿菌菌株KF-2在發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料中的應(yīng)用。
[0009]所述的一種利用如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
I)將所述的枯草芽孢桿菌菌株KF-2經(jīng)過平板培養(yǎng)基活化、種子搖瓶培養(yǎng)、一級搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐逐級放大培養(yǎng)，得到種子液；2)經(jīng)步驟I)得到的種子液接種至豆柏中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵；
3)將步驟2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行烘干、粉碎，即得到富含活性肽蛋白飼料。
[0010]所述的一種利用枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于所述的步驟2)中接種量為豆柏重量的8~12%。
[0011]所述的一種利用枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于所述的步驟2)中固態(tài)發(fā)酵條件為:接種時進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，發(fā)酵過程中監(jiān)測溫度變化，溫度高于50°C時，進(jìn)行翻料處理，發(fā)酵時間為48 h。
[0012]所述的一種枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于所述的步驟3)中發(fā)酵產(chǎn)物烘干至水分< 12%，粉碎細(xì)度40~60目。
[0013]本發(fā)明誘變得到一種枯草芽孢桿菌菌株KF-2，該菌株能夠分泌豐富的蛋白酶等酶系，具有顯著的發(fā)酵豆柏的能力。利用該菌株及相應(yīng)的發(fā)酵工藝對豆柏進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵處理，可降解豆柏粉中大分子量的蛋白質(zhì)，使其轉(zhuǎn)化成具有生物活性的小肽蛋白，促進(jìn)了動物的吸收。同時，豆柏發(fā)酵后其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗原蛋白得到了有效地降解，顯著提高豆柏的營養(yǎng)品質(zhì)，提高動物對豆柏的利用效率并改善動物腸道和促進(jìn)健康。
[0014]使用該菌株發(fā)酵豆柏后顯著改善了豆柏的營養(yǎng)價值，測定一些指標(biāo)結(jié)果為:發(fā)酵豆柏的粗蛋白含量達(dá)到51%以上，酸溶蛋白含量達(dá)到8%以上，活菌數(shù)達(dá)到40億個/克發(fā)酵豆柏，揮發(fā)性鹽基氮低于50 mg/100g,同時含有較高的蛋白酶活性。
【具體實施方式】
[0015]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進(jìn)行。
[0016]實施例1:枯草芽孢桿菌菌株KF-2的分離、純化、誘變和鑒定
從自然條件下篩選獲得枯草芽孢桿菌，后經(jīng)過本公司的多輪誘變育種后，菌株得到了遺傳改良，其降解和轉(zhuǎn)化豆柏的能力得到了明顯提高，菌株的生產(chǎn)性能大大提高。
[0017]制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，從豆類等有機(jī)質(zhì)中分離培養(yǎng)，獲得枯草芽孢桿菌，獲得的菌株經(jīng)過菌落觀察、形態(tài)學(xué)顯微鑒定為枯草芽孢桿菌。
[0018]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆柏，反復(fù)篩選和提純復(fù)壯(步驟:從發(fā)酵較好的豆柏產(chǎn)品中分離培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，獲得純化菌株繼續(xù)培養(yǎng)，然后進(jìn)一步發(fā)酵豆柏，使其發(fā)酵能力不斷提高)，使得菌株發(fā)酵豆柏的性能得到了提高，表現(xiàn)在發(fā)酵豆柏后活菌數(shù)增強、酸溶蛋白含量提高等方面(豆柏蛋白含量可以達(dá)到5%以上，酸溶蛋白等小肽含量提高10%以上，乳酸含量提高2%以上)，該菌株命名為枯草芽孢桿菌菌株KF-2。
[0019]枯草芽孢桿菌菌株KF-2培養(yǎng)和繁殖方法:
枯草芽孢桿菌菌株KF-2在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上生長良好，該培養(yǎng)基可用于枯草芽孢桿菌菌株KF-2的生長和繁殖。培養(yǎng)溫度32°C。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基含量為牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15~20g、蒸餾水IOOOmL, pH 7.0~7.2。
[0020]枯草芽孢桿菌菌株KF-2的形態(tài)學(xué)特征:
枯草芽孢桿菌KF-2屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，為革蘭氏陽性菌，顯微鏡下觀察可見短桿狀的菌體，菌體細(xì)胞大小為0.68~0.85X2.0~3.1微米，菌體著色均勻，培養(yǎng)一定時間后，菌體細(xì)胞內(nèi)可形成芽孢，芽孢大小為0.6~0.9 X 1.0~1.5微米。芽孢橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏的位置，芽孢形成后菌體不膨大?？莶菅挎邨U菌KF-2無莢膜，周生鞭毛，能運動。
[0021]培養(yǎng)特性:枯草芽孢桿菌KF-2菌株單菌落接種后，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上32 °C、培養(yǎng)3天后，菌落呈現(xiàn)出表面粗糙，不透明，淺白色或微黃色。培養(yǎng)菌落表明有皺褶，菌落略顯干燥，較平整，不易挑起。
[0022]枯草芽孢桿菌KF-2接種后，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上生長15h后，就有大量的芽孢產(chǎn)生。
[0023]生理特性和代謝特性:枯草芽孢桿菌KF-2易培養(yǎng)，能利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉等多種有機(jī)物質(zhì)。是需氧菌，能夠迅速消耗環(huán)境中的游離氧，可以作為動物腸道菌培養(yǎng)，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長。
[0024]枯草芽孢桿菌KF-2發(fā)酵有機(jī)物可產(chǎn)生乳酸、丙酸等有機(jī)酸。
[0025]枯草芽孢桿菌KF-2產(chǎn)生的生物酶種類較多，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。在大豆分離蛋白、酪蛋白等培養(yǎng)基上有明顯的水解圈，顯示出較高蛋白酶活性。在淀粉平板上，經(jīng)過碘染色觀察有透明圈，顯示出淀粉水解酶活性。
[0026]枯草芽孢桿菌KF-2的具體用途和效果:枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is)菌株KF-2可以用來發(fā)酵豆柏，生產(chǎn)富含活性小肽的高蛋白飼料。
[0027]發(fā)酵后的豆柏蛋白含量可以達(dá)到5%以上，酸溶蛋白等小肽含量提高明顯，可以提高10%以上，乳酸含量提高2%以上。發(fā)酵產(chǎn)物中，富含蛋白酶、淀粉酶等豐富的酶系，可以降解豆柏中的抗?fàn)I養(yǎng)因子等有害物質(zhì)。同時，發(fā)酵豆柏中含有大量的抗逆性較強的枯草芽孢桿菌芽孢，便于貯存和運輸。在動物食用后，枯草芽孢桿菌在腸道內(nèi)迅速繁殖，顯著抑制有害菌的生長，改善動物腸道健康，提高飼料的利用率，改善動物營養(yǎng)水平，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。
[0028]實施例2:利用枯草芽孢桿菌KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法
I)將所述的枯草芽孢桿菌KF-2經(jīng)過平板培養(yǎng)基活化、種子搖瓶培養(yǎng)、一級搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐逐級放大培養(yǎng)，得到種子液，上述的平板培養(yǎng)基、搖瓶培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基；平板培養(yǎng)基活化是從斜面保存的菌株轉(zhuǎn)接到平板，32°C培養(yǎng)，然后從平板挑取3個單菌落到種子搖瓶，種子搖瓶在32°C、150 r/min搖床條件下,培養(yǎng)15 h后,種子培養(yǎng)液全部接種到發(fā)酵罐，發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)24h。
[0029]上述的平板培養(yǎng)基為:牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15~20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0~7.2)，種子搖瓶培養(yǎng)基為:上述平板培養(yǎng)基不加瓊脂，發(fā)酵培養(yǎng)基:同種子培養(yǎng)基。
[0030]2)經(jīng)步驟I)得到的發(fā)酵罐中的菌種液按豆柏重量的8~12%接種至豆柏中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，接種時進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，確保菌種和豆柏混合均勻，發(fā)酵的時間為48 h，發(fā)酵過程中監(jiān)測溫度變化，溫度高于50°C時，進(jìn)行翻料處理，充分透氣降溫，溫度較低時，適當(dāng)延長發(fā)酵時間，此外，發(fā)酵過程中還需觀察發(fā)酵是否正常、氣味是否具有豆香和酵母酒香味、發(fā)酵物中有沒有發(fā)黑、霉變、結(jié)塊等。[0031]3)將步驟2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物烘干至水分< 12%，粉碎至細(xì)度40~60目，即得到富含活肽蛋白飼料。[0032]經(jīng)鑒定，實施例2得到的富含活肽蛋白飼料中粗蛋白含量達(dá)到51%以上，酸溶蛋白含量達(dá)到6%以上，活菌數(shù)達(dá)到20億個/克發(fā)酵豆柏，揮發(fā)性鹽基氮低于50mg/100g，蛋白含量比初始豆柏原料可以提高5%以上，酸溶蛋白等小肽含量提高4%以上，乳酸含量提高1%以上 。
【權(quán)利要求】
1.枯草芽孢桿菌(及?&77心菌株KF-2，保藏編號為CGMCCN0.7690。
2.如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株KF-2在發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料中的應(yīng)用。
3.一種利用如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于包括以下工藝步驟: 1)將所述的枯草芽孢桿菌菌株KF-2經(jīng)過平板培養(yǎng)基活化、種子搖瓶培養(yǎng)、一級搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐逐級放大培養(yǎng)，得到種子液； 2)經(jīng)步驟I)得到的種子液接種至豆柏中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵； 3)將步驟2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行烘干、粉碎，即得到富含活性肽蛋白飼料。
4.如權(quán)利要求3所述的一種利用枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于所述的步驟2)中接種量為豆柏重量的8~12%。
5.如權(quán)利要求3所述的一種利用枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于所述的步驟2)中固態(tài)發(fā)酵條件為:接種時進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，發(fā)酵過程中監(jiān)測溫度變化，溫度高于50°C時，進(jìn)行翻料處理，發(fā)酵時間為48 h。
6.如權(quán)利要求3所述的一種枯草芽孢桿菌菌株KF-2發(fā)酵生產(chǎn)富含活性肽蛋白飼料的方法，其特征在于所述的步驟 3)中發(fā)酵產(chǎn)物烘干至水分< 12%，粉碎細(xì)度40~60目。
【文檔編號】C12N1/20GK103468604SQ201310327938
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】章亭洲 申請人:浙江科峰生物技術(shù)有限公司