專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于木材保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌及其在防治楊木變色病中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
楊樹是世界重要的速生用材樹種之一，更是我國速生豐產(chǎn)主栽樹種，具有適應(yīng)性 廣、生長速度快等特點(diǎn)，受到楊樹栽培者歡迎。目前，我國楊樹林面積已經(jīng)超過800萬ha，蓄 積量達(dá)到4.四億1113，居世界首位，超過其他國家的楊樹人工林面積的總和，其中楊樹用材林 面積為309萬ha，占全國楊樹人工林面積的40%左右，在華東地區(qū)楊木加工業(yè)已成為當(dāng)?shù)?的經(jīng)濟(jì)支柱。僅江蘇省泗陽縣有楊樹人工林60多萬畝(約4萬ha)，年總生產(chǎn)量100萬m3，森 林覆蓋率42%，活立木蓄積量550萬m3。但在楊樹砍伐后運(yùn)輸、儲存和加工過程中，易受到 變色菌和霉菌的侵染，致使木材變色、發(fā)霉，影響了木材表觀和實(shí)用價(jià)值，變色對木材物理 力學(xué)性能的影響與引起變色的真菌及木材種類有關(guān)，木材變色3個(gè)月以后，由Ophiostoma 屬的一些種引起針葉材的重量損失為14%，闊葉材重量損失可高達(dá)25%。雖然邊材變色不 嚴(yán)重改變木材的強(qiáng)度，但也有影響，嚴(yán)重變色松木韌性降低30%，比重?fù)p失1-2%，表面硬 度下降2-10%，彎曲強(qiáng)度和抗壓強(qiáng)度下降1-5%。由真菌引起木材變色是一種生物變色，嚴(yán)重影響木材材色。自Hartig(1878)首次 報(bào)道木材變色是由具有深色菌絲的真菌引起后，開啟了木材變色菌研究的先河，隨后各國 的學(xué)者對變色菌進(jìn)行了大量的研究。從20世紀(jì)20、30年代起在北溫帶地區(qū)著重研究由真 菌引起的針葉材變色。Uzrnovie等人(1999)從加拿大香脂冷杉(Abies balsamea)等六種 針葉樹中分離到1863個(gè)變色菌株，并依據(jù)其形態(tài)和生理學(xué)特性及交配親和性，將其鑒定為 5屬13種，其中長喙殼屬(Ophiostoma)包含了 9種。從上世紀(jì)90年代，人們開始研究用生物的手段來防治木材色變。大多是利用一些 拮抗菌或優(yōu)勢菌，如細(xì)菌、木腐菌、菌根真菌、藍(lán)變菌的白化菌株、放線菌等抑制變色菌的生 長，試圖達(dá)到防治木材藍(lán)變的目的。用于防治藍(lán)變的微生物可以從自然界中篩選或用變色 菌進(jìn)行雜交，或進(jìn)行單孢分離得到一些基因突變的無色菌株，或改變變色菌的基因，使其突 變得到不產(chǎn)生色素的無色菌株。長喙殼屬(Ceratocystis&Ophiostoma)的一些種是重要的 針葉材變色菌，所篩選出來的一些潛在生物防治真菌大多都是針對長喙殼屬的不同種，如 Phialemonium curuatum W. Gams and W. B. Cooke,Sporomiellasimiles Khan and Cain, 柱孢葡萄穗霉(Stachybotrys cylindrospora)對3種長喙殼有較強(qiáng)的抑制作用。我國的 研究者用從紅脂大小蠹19個(gè)伴生真菌菌株分別對Grosmanniakoreanum和L印tographium smoprocerum進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)，篩選出了具生防潛力的生防菌株。長喙殼(Ophiostoma Piliferum albino strain)是該菌的基因突變菌系，即菌絲缺少黑色素的無色菌系，已成 功應(yīng)用中松木防變色，該生防劑(Cartapip 97)已進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。禾丨J用長喙殼(Ophiostoma piliferum albino srain)不產(chǎn)生色素的菌 株預(yù)防木材變色的研究很多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些效果好的生防菌株，如=Ophiostoma
3Piliferum “Cartapip".白化菌株是通過雜交及藍(lán)變菌子囊孢子的單孢分離獲得的，它不 合成黑色素。研究證明，在室內(nèi)條件下，Ophiostoma piliferum白化菌株可以替代化學(xué)藥 劑，用于暫時(shí)性的保護(hù)木材，它顯示了高水平的群體競爭能力，可抑制由真菌生長引起的藍(lán) 變，同時(shí)在野外環(huán)境下也具有較好的防治功效。加拿大i^orintek公司分離得到一株白化藍(lán) 變菌Cartapip97TM，已經(jīng)獲得專利，并在Alberta和British Columbia兩地進(jìn)行了野外試 驗(yàn)，效果良好。另外還可以通過改變變色菌基因的方法，使其突變，得到無色菌株。Peter et al. (2003)采用根癌土壤桿菌(Agrobaterium tumefaciens)介導(dǎo)方法將自行設(shè)計(jì)的一段 抗潮霉素基因?qū)腴L喙殼(Ceratocystis resinifera)得到無色菌株。并對突變菌株和正 常菌株在培養(yǎng)基上的色素沉積進(jìn)行比較，表明了突變菌株在培養(yǎng)基上呈白色，而正常菌株 則呈黑色。除真菌外，細(xì)菌也是極佳的潛在防治木材變色的微生物之一。目前，從自然界 中篩選出的、可用于防治木材藍(lán)變的枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和假單胞菌 (Pseudomonascepacia)和鏈霉菌(Sti^ptomyces rimosus)等微生物，能夠抑制各種主要 木材藍(lán)變菌的生長，但作用機(jī)理還不清楚。目前，木材變色的生物防治研究還只處于試驗(yàn)階 段。我國在木材變色和變色菌的研究始于20世紀(jì)70年代，研究最多的為橡膠木，鍛 木、松木、馬尾松、泡桐、西南樺、白樺的變色中也存在藍(lán)變。但對于拮抗機(jī)理以及拮抗物質(zhì) 的分析很少。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種對楊木變 色真菌具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌。本發(fā)明的第二目的在于提供一種枯草芽孢桿菌在防治楊木變色病中的應(yīng)用。技術(shù)方案為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為一種枯草芽孢 桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37，在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)保藏，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼為100101，其保藏編號為CGMCCNo. 4277，保藏日 期為2010年10月27日。所述的枯草芽孢桿菌在防治楊木變色病中的應(yīng)用。具體應(yīng)用為將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 280C _37°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時(shí)，得到的發(fā)酵液作為防治楊木變色真菌的菌劑。本發(fā)明中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為1000mL蒸餾水，牛肉膏2_5g，蛋白胨5-10g， 氯化鈉 5g, ρΗ6· 5-7. 5。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37的生理活性特征如下所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落 較大，乳白色，直徑一般3-5mm，表面隆起，干燥，有皺褶，邊緣較規(guī)則，菌體桿狀，兩端鈍圓， 具鞭毛，大小為2. 41-1. 83 X 1. 02-0. 56 μ m,平均2. 1X0. 74 μ m ；芽孢中生，橢圓形，大小為 1. 08-0. 62X0. 66-0. 44 μ m,平均 0. 86X0. 51 μ m,周生鞭毛。
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革蘭氏染色表現(xiàn)為陽性；酪蛋白水解、淀粉水解、明膠液化為陽性，V. P反應(yīng)陽性， 吲哚反應(yīng)陰性；糖類產(chǎn)酸發(fā)酵?？莶菅挎邨U菌的16SrDNA序列如SEQ ID No. 1所示。將所測16SrDNA序列通過 BLAST比對，鑒定其為枯草芽孢桿菌。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37對楊樹多種變色真菌具有抑制作用， 在拮抗細(xì)菌對植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如種類和數(shù)量眾多；對病原菌 的作用方式多樣化；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；抗逆能力強(qiáng)等 優(yōu)點(diǎn)，尤其是對真菌引起的楊木變色病的防治具有重要意義；(2)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè) 化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37形態(tài)圖；圖 2a 為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37 對長喙殼(Ceratocystis adiposa(Butl. )C. Moreau, Hz91)的抑制作用；圖 2b 為.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) B37 對鐮刀菌(Fusarium sp.，YM05) 的抑制作用；圖2c、圖2d為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37對可可球二孢 [Lasiodiplodiatheobromae (Pat.) Griffon&Maubl. , YM0737, Fx46]的抑制作用；圖3a為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37對Hz91的作用；圖3b為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37對Fx46的作用；圖3c為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37對Ym05的作用；圖3d為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37對Ym0737的作用；
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)闡述本發(fā)明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)例1 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) B37對楊木變色真菌長喙 殼[Ceratocystisadiposa(Butl. )C. Moreau, Hz91]> 可可球二抱[Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Gr iff on&Maubl.，YM0737，F(xiàn)x46]、鐮刀菌(Fusarium sp. , YM05))平板抑
菌作用。將用LB斜面活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37菌株劃線接種于PDA 平板一側(cè)，再將楊樹變色真菌PDA平板培養(yǎng)物用直徑5mm的打孔器打取同質(zhì)同量的菌塊，點(diǎn) 接于平板另一側(cè)。培養(yǎng)2天觀察抑菌帶的有無，并記錄其寬度(如表1)，實(shí)驗(yàn)效果如圖 加至圖2d所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37對四種病原菌均 有拮抗作用。表1B37對4種楊樹變色真菌的抑制
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37，保藏在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4277，保藏日期 為2010年10月27日。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在防治楊木變色病中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) B37接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在_37°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時(shí)，得到的發(fā)酵液作為防治楊 木變色真菌的菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為1000mL蒸餾 水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化鈉5g，ρΗ6· 5-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B37，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.4277，保藏日期為2010年10月27日。所述的枯草芽孢桿菌主要用于楊木變色病的生物防治。本發(fā)明枯草芽孢桿菌B37對楊木上的多種變色真菌具有抑制作用，該拮抗細(xì)菌對多種植物病害也有很好的防治效果；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對真菌引起的楊木變色病的防治具有重要意義；培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A01P3/00GK102146352SQ20111000758
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者席剛俊, 張小華, 趙桂華 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院