一種枯草芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種枯草芽孢桿菌及其應用。所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）HS5B5，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC?No.6088。本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5對牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉具有很強的抑制作用，能夠有效的預防和治療牡丹褐斑病。本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5對生態(tài)環(huán)境無害，不會引起病原的抗藥性。本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5的培養(yǎng)條件簡單，容易保存，易于工業(yè)化生產，具有良好的開發(fā)應用前景。
【專利說明】一種枯草芽孢桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種枯草芽孢桿菌及其應用。

【背景技術】
[0002] 牡丹蟲害較少，但病害發(fā)生種類多且危害嚴重。病害是牡丹在其生長發(fā)育和越 冬過程中，受到病原微生物的浸染或不良環(huán)境條件的影響，使其從生理機制到形態(tài)結構發(fā) 生一系列病變。已鑒定出來的20余種牡丹病害中，大多數是真菌性病害，如褐斑病、灰霉 病、銹病、白絹病和紫紋羽病等。它們引起葉局部壞死或整葉枯死，危害牡丹的葉、枝條和 根莖部，使牡丹提前落葉，影響生機。牡丹褐斑病是最為嚴重的病害之一，此病主要危害 葉片，也可侵染莖和花，多在開花前后發(fā)生，一直延續(xù)到枯葉期。病原真菌為牡丹枝孢霉 (QWiosporiw? paeofliae)，屬半知菌亞門，絲孢菌綱，叢梗孢目，枝孢菌屬。病原以菌絲體 或分生孢子在枯葉或土壤里越冬，借助風雨傳播夏初開始發(fā)生，秋季、危害嚴重，高溫高濕、 光照不足、通風不良、連作等均有利于病害發(fā)生。
[0003] 牡丹褐斑病的防治目前主要依賴化學藥物的使用，這不僅對人體健康和生態(tài)環(huán)境 安全有害，而且易引起病原抗藥性。生物防治是利用生物或其產物控制農林病蟲發(fā)生危害 的防治方法，由于其具有對人畜安全，對環(huán)境無污染，不易產生抗藥性，高效廣譜，能夠促進 作物生長等特點，日益受到人們的重視，然而生物防治在牡丹病害防御上的研究和應用還 很少。為了加快我國牡丹產業(yè)的快速發(fā)展，研制對人體健康和生態(tài)環(huán)境安全無害、不易引起 病原抗藥性、高效廣譜的生物防治劑迫在眉睫。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠抑制牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉的枯草芽孢桿 菌。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術方案是：一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢 桿菌UaciBm 該菌株于2012年5月9日保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC No. 6088。
[0006] 所述枯草芽孢桿菌HS5B5菌株在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 上菌落呈白色，桿狀，表面干燥有皺褶，鞭毛中生，菌落直徑0. 8-2. 3 μ m，革蘭氏染色陽性。
[0007] 所述枯草芽抱桿菌(ifeciBws HS5B5菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO :1所示。
[0008] 所述枯草芽孢桿菌) HS5B5菌株通過對峙培養(yǎng)法篩選獲得。 [0009] 所述枯草芽孢桿菌) HS5B5菌株對牡丹褐斑病病原菌牡丹枝 孢霉的拮抗抑菌作用。
[0010] 所述枯草芽孢桿菌HS5B5菌株制劑在防治牡丹褐斑病中的 應用。
[0011] 所述枯草芽孢桿菌 sMiihdHSSBS菌株對菊花黃萎病、蘋果白粉病、 油茶葉枯病菌、月季黑斑病中的應用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是： 1、本發(fā)明枯草芽孢桿菌HS5B5對牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢 霉具有很強的抑制作用，能夠有效的預防和治療牡丹褐斑病。
[0013] 2、本發(fā)明枯草芽孢桿菌UaciBm sMiiBWHSSBS對生態(tài)環(huán)境無害，不會引起病 原的抗藥性。
[0014] 3、本發(fā)明枯草芽孢桿菌 sMiiBWHSSBS的培養(yǎng)條件簡單，容易保存， 易于工業(yè)化生產，具有良好的開發(fā)應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為枯草芽孢桿菌UaciBm sMii/is) HS5B5的抑菌圈； 圖2為枯草芽孢桿菌 sMiiBWHSSBS的菌落特征。

【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明篩選分離了枯草芽孢桿菌(ifeciBm 5·?6?27Υ5·)Η55Β5,該菌株保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為：CGMCC No. 6088。該菌株對牡丹褐 斑病的病原菌牡丹枝孢霉具有很強的抑制作用，可用于制備防治牡丹褐斑病的生物制劑。
[0017] 一、菌株的篩選分離方法 1、樣品中芽孢桿菌的分離 (1)在洛陽國際牡丹園牡丹栽培區(qū)，采集牡丹根部表層土壤，在不同地點采集100個樣 本，裝袋帶回實驗室風干。風干后的各樣品經研磨后，從每個樣品中稱取l〇g分別加入到裝 有90mL無菌水和5顆玻璃珠的三角瓶中，充分搖動20?30min，使得樣品與無菌水混合均 勻，制得樣品懸液。
[0018] (2)將制得的樣品懸液置于溫度為80°C的水浴中加熱lOmin，以殺死不產芽孢的 細菌和其他微生物，然后在無菌條件下吸取lmL的樣品懸液加入到裝有9mL無菌水的試管 中，振蕩混勻，制得1〇_ 2樣品稀釋液。
[0019] 按上述方法依次制得10_3、10_4、10_5、10_ 6、10_7的稀釋液，分別吸取10_5、10_6、10_ 7濃 度梯度的各樣品稀釋液〇. lmL涂布相應的牛肉膏蛋白胨平板上，30°C倒置培養(yǎng)48h。根據菌 落特征挑取形態(tài)等性狀差異比較明顯的菌落，反復平板劃線純化，編號后保存?zhèn)溆谩?br> [0020] 2、牡丹褐斑病拮抗菌的篩選 拮抗芽孢桿菌的篩選采用牡丹褐斑病的病原菌牡丹枝孢霉（C/at/iosporiw? paeofliae) 為靶標，方法采用對峙培養(yǎng)篩選法。
[0021] 用于篩選的牡丹枝孢霉paeofliae)購自中國農業(yè)微生物菌種保藏 管理中心，菌株保藏號為ACCC 36063。
[0022] 將牡丹枝孢霉接種于PDA平板中央，28°C培養(yǎng)8d后，接入初篩得到的芽孢桿菌菌 株，28°C恒溫培養(yǎng)3d后觀察抑菌情況，測量抑菌圈直徑，每組實驗重復3次。根據抑菌直徑 的大小選取抑菌效果較為明顯的菌株，轉移至牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?br> [0023] 3、細菌鑒定方法 (1)形態(tài)特征觀察 形態(tài)特征觀察包括對菌落形態(tài)的觀察和細菌個體形態(tài)的觀察兩方面，主要采用《常見 細菌系統鑒定手冊》中的實驗方法進行。
[0024] ①菌落形態(tài)的觀察 將菌種于平板上劃線培養(yǎng)24h，對其菌落形態(tài)、菌落質地、菌落的顏色、菌落邊緣、光學 特性及是否分泌可溶性色素等進行觀察記錄。
[0025] ②個體形態(tài)的觀察 革蘭氏染色：采用菌齡為10?14h的菌種。涂片后先用結晶紫初染，再用碘液媒染，經 95%乙醇脫色后再用番紅復染，水洗，吸干。鏡檢菌體為紫色的是革蘭氏陽性菌，菌體為紅色 的是革蘭氏陰性菌。
[0026] 芽孢染色：涂片后，先用孔雀綠染15min,經水沖洗，風干后用番紅復染2min,水 洗，吸干。鏡檢為芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。
[0027] 菌體大小的測量：用顯微測微尺對革蘭氏染色涂片進行菌體大小的測量，每個菌 株測量10個以上菌體的寬度和長度，平均值即為菌體一般大小。
[0028] (2)生理生化鑒定 生理生化鑒定按照《常見細菌系統鑒定手冊》及《芽抱桿菌屬》中的方法，對各菌株進 行包括接觸酶反應、好氧性試驗、甲基紅反應、V. P反應試驗、硝酸鹽還原試驗、糖醇發(fā)酵試 驗、吲哚產生試驗、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗、酪素水解試驗、硫化氫產生試驗及耐 鹽性試驗等生理生化特征的鑒定。
[0029] (3) 1防rDNA序列分析 用細菌基因組提取試劑盒進行細菌基因組DNA提取，作為PCR反應的模板。引物用16S rDNA全長擴增通用引物。PCR擴增反應體系30μ L :PCR預混料15μ L、模板DNA 1 μ L、引物 各 0.5yL、雙蒸水 nyLoPCR 反應條件：95°C 3min;95°C 50s，52°C 50s，72°C 2min，30 個 循環(huán)；72°C延伸lOmin。用PCR膠回收試劑盒回收PCR產物，經1. 5%的凝膠電泳檢測后，與 克隆載體pGM-Τ在T4連接酶作用下于16°C過夜連接，并轉化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細 胞。引物及陽性克隆菌測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。利用Blast將菌株的 16S rDNA的序列與GenBank數據庫中已知的序列進行比較，分析其同源性。
[0030] 二、篩選分離結果 1、樣品中芽孢桿菌的分離純化 從樣品中，經稀釋分離、純化共獲得79株細菌，分別編號、保存，用于拮抗菌的篩選。用 顯微鏡初步鏡檢觀察發(fā)現其中有68株為芽孢桿菌，占獲得細菌總數的86. 1%，這說明試驗 中采用的在稀釋分離前，將樣品懸液先在80°C水浴中加熱lOmin的處理方法，能夠有效殺 死樣品中的微生物細胞，從而最大限度的獲得芽孢桿菌，適于芽孢桿菌的分離。
[0031] 2、牡丹褐斑病病原菌拮抗菌的篩選 以牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉(CVat/iosporiw? paeofliae)作為祀標，采用對峙培養(yǎng) 法，以抑菌效果即抑菌圈大小為標準，進行拮抗芽孢桿菌的篩選。結果表明，從樣品中分離 得到的68株芽孢桿菌中，對牡丹褐斑病有抑制作用的有11株，約占總數的16. 2%，其中抑菌 圈直徑在6mm以上的有1株，抑菌圈直徑為6. 18mm，見圖1，命名為HS5B5,進行微生物菌株 鑒定。
[0032] 3、個體及菌落形態(tài)觀察結果 可以看出，菌株HS5B5的菌體形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色陽性，中生芽孢，周生鞭毛，同時 從菌落所顯示的不規(guī)則、干燥、不透明等特征可以初步推斷菌株HS5B5可能屬于芽孢桿菌 雇i (Bacillus')。
[0033] 表1菌株HS5B5的形態(tài)特征

【權利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌 sMii/is) HS5B5,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 為：CGMCC No. 6088。
2. 如權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌在抑制牡丹褐斑病病原菌牡丹枝孢霉中的 應用。
3. 如權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌在制備用于防治牡丹褐斑病制劑中的應用。
4. 如權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌在抑制菊花黃萎病、蘋果白粉病、油茶葉枯 病菌、月季黑斑病中的應用。
【文檔編號】A01P3/00GK104195061SQ201410163640
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權日:2014年4月23日
【發(fā)明者】宋鵬, 劉領, 馬占強, 趙杏利, 劉曉亮, 劉晨洲, 楊敏 申請人:河南科技大學