一種報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法、位點(diǎn)及用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法，重組位點(diǎn)是目的基因的最后一個(gè)外顯子的終止密碼子后，把IRES-報(bào)告基因重組在目的基因的最后一個(gè)外顯子的終止密碼子后。重組后，目的基因和報(bào)告基因一起轉(zhuǎn)錄成融合的mRNA，目的基因mRNA各外顯子剪接正確，并分別翻譯成報(bào)告基因蛋白和目的基因蛋白，報(bào)告基因蛋白可以定時(shí)檢測(cè)，通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)變化反映目的基因表達(dá)調(diào)控。該重組方法為目的基因的表達(dá)調(diào)控研究提供完全天然染色體環(huán)境。
【專利說(shuō)明】—種報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法、位點(diǎn)及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種報(bào)告基因插入染色體完整目的基因位點(diǎn)、構(gòu)建方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]基因打祀技術(shù)(gene targeting)是一項(xiàng)新興的分子生物學(xué)技術(shù),是利用外源DNA與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生重組，將外源DNA定點(diǎn)整合入受體細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)?；虼虬屑夹g(shù)在研究基因的結(jié)構(gòu)和功能、表達(dá)與調(diào)控、轉(zhuǎn)基因及基因治療等方面已經(jīng)成為有力的工具。
[0003]利用報(bào)告基因可有效地研究目的基因的表達(dá)調(diào)控。目前多數(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物報(bào)告基因的表達(dá)是由目的基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，可以研究目的基因啟動(dòng)子的調(diào)控。由于基因增強(qiáng)子、位點(diǎn)控制區(qū)域(locus control region, LCR)及絕緣子(insulators)等調(diào)控元件對(duì)于基因的表達(dá)和調(diào)控十分重要，但這些元件常常距基因有約50 kb之遙，而且目的基因所包含的天然內(nèi)含子可能帶有影響mRNA剪接和調(diào)控蛋白表達(dá)的信號(hào)，目的基因所處的天然的染色體環(huán)境也是調(diào)控基因表達(dá)的重要因素。但目前，報(bào)告基因重組在“天然”染色體目的基因上的研究報(bào)道較少。因此，迫切需要建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，為目的基因的表達(dá)調(diào)控研究提供基本完全天然的染色體環(huán)境。因此，本發(fā)明確定了報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的位點(diǎn) ，利用基因打靶技術(shù)構(gòu)建報(bào)告基因重組在目的基因上的報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，為在完全天然染色體背景下研究完整目的基因表達(dá)和調(diào)控建立了研
口 o

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開一種報(bào)告基因重組在染色體完整目的基因上的方法。
[0005]也就是說(shuō)，本發(fā)明目的是提供一種建立報(bào)告基因重組在染色體完整目的基因上的方法，確定報(bào)告基因插入目的基因的位點(diǎn)，利用基因打靶技術(shù)構(gòu)建報(bào)告基因重組在目的基因上的報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該位點(diǎn)報(bào)告基因的插入，為目的基因表達(dá)和調(diào)控研究提供了完全天然染色體環(huán)境。
[0006]一種建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法，其特征在于重組位點(diǎn)是目的基因的最后一個(gè)外顯子的終止密碼子后，把IRES-報(bào)告基因重組在目的基因的最后一個(gè)外顯子的終止密碼子后。
[0007]重組后，目的基因和IRES-報(bào)告基因一起轉(zhuǎn)錄成融合的mRNA，目的基因mRNA各外顯子剪接正確。
[0008]IRES-報(bào)告基因與目的基因融合的mRNA，分別翻譯成報(bào)告基因蛋白和目的基因蛋白。報(bào)告基因蛋白可以定時(shí)檢測(cè)。由于報(bào)告基因與目的基因一起轉(zhuǎn)錄成融合的mRNA，報(bào)告基因的表達(dá)能相對(duì)定量目的基因的表達(dá)。[0009]重組方法中的IRES，報(bào)告基因可以從市售報(bào)告基因質(zhì)粒獲得。其中市售報(bào)告基因質(zhì)?？梢允菬晒馑孛赶盗袌?bào)告基因質(zhì)粒，熒光蛋白系列報(bào)告基因質(zhì)粒，分泌性堿性磷酸酶系列報(bào)告基因質(zhì)粒。
[0010]在建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物前，需要先進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，確定報(bào)告基因重組在染色體完整目的基因上的位點(diǎn)，考察此位點(diǎn)的重組，是否會(huì)引起目的基因mRNA剪接錯(cuò)誤，影響目的基因mRNA完整性，以及報(bào)告基因能否反映目的基因表達(dá)調(diào)控。
[0011]然而，目前由于完整目的基因?yàn)榇笃蜠NAOlO kb)，在技術(shù)上，研究比較困難，長(zhǎng)期限制了報(bào)告基因在完整目的基因的表達(dá)調(diào)控研究上的應(yīng)用。細(xì)菌人工染色體(BacterialArtificial Chromosome, BAC)為目的基因研究提供了基本完整的染色體DNA背景。BAC同源重組，為報(bào)告基因與完整目的基因重組提供了簡(jiǎn)便、可行的實(shí)驗(yàn)工具。
[0012]本發(fā)明通過(guò)BAC同源重組，選擇報(bào)告基因插入目的基因的位點(diǎn)，考察此位點(diǎn)的重組，是否會(huì)引起目的基因mRNA剪接錯(cuò)誤，影響目的基因mRNA完整性，以及報(bào)告基因能否反映目的基因表達(dá)調(diào)控。體外實(shí)驗(yàn)確定報(bào)告基因插入目的基因的位點(diǎn)后，構(gòu)建報(bào)告基因重組在染色體原位目的基因上的報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在整體水平，為在完全天然染色體背景下研究目的基因表達(dá)和調(diào)控提供了研究平臺(tái)。
[0013]體外BAC同源重組基因工程方法基于3個(gè)X Red-encoded基因(Red,recombination deficient mutant of phage 卩遼菌體重組缺陷型)exo, bet 和 gam 介導(dǎo)的同源重組。Exo編碼5’-3’核酸外切酶產(chǎn)生待插入雙鏈DNA3’懸端，bet編碼一對(duì)蛋白，該蛋白綁定在待插入雙鏈DNA3’懸端，并介導(dǎo)退火以及與BAC上互補(bǔ)DNA發(fā)生同源重組。Gam編碼RecB⑶核酸外切酶抑制蛋白，保護(hù)待重組的DNA不被RecB⑶降解。Exo，bet和gam的表達(dá)由溫度敏感的抑制物控制，細(xì)菌在32°C培養(yǎng)時(shí)，這三個(gè)基因不表達(dá)。細(xì)菌42°C，15分鐘，exo, bet和gam被快速誘導(dǎo)至高表達(dá)水平，同源重組得以有效進(jìn)行。
[0014]體外BAC同源重組基因工程方法選擇系統(tǒng)為galK陽(yáng)性選擇和陰性選擇。E.coli半乳糖操縱子由四個(gè)結(jié)構(gòu)基因 組成，四個(gè)結(jié)構(gòu)基因依次排列:galE(編碼半乳糖差向異構(gòu)酶)、galT(編碼半乳糖轉(zhuǎn)移酶)和galK(編碼半乳糖激酶)和galM。當(dāng)半乳糖作為唯一碳源時(shí)，這些基因是細(xì)菌生長(zhǎng)必須的。galK編碼的半乳糖激酶催化半乳糖降解第一步，磷酸化半乳糖。半乳糖激酶也可以有效催化2-脫氧-半乳糖(DOG) —一半乳糖類似物的磷酸化。磷酸化的DOG不能被代謝，導(dǎo)致毒性蓄積。這樣就形成了以galK為基礎(chǔ)的陽(yáng)性選擇和陰性選擇。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1 BAC重組和galK陽(yáng)性選擇和陰性選擇流程示意圖。
[0016]圖2 分段 PCR 初步證實(shí) 3’ mDAT-1RES-G-luc 插入得到 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc重組子菌落。其中
泳道 1:templte: pBACe3.6-AC154547, primer: 1-F 和 2-R ;
泳道 2:templte: pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc, primer: 1_F 和 2-R ；
泳道 3:templte: pBACe3.6-AC154547, primer: 2_F 和 2-R ；
泳道 4:templte: pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc，primer: 2_F 和 2-R ;
泳道 5:templte: pBACe3.6-AC154547, primer: 3_F 和 3-R ；泳道 6:templte: pBACe3.6-AC154547-3> mDAT-1RES-G-luc, primer: 3_F 和 3-R。
[0017]圖3 SmaI 酶切，證實(shí) pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc 重組子正確。左圖為0.25v/cm, 12 h ;右圖為20 h。其中
泳道 A:pBACe3.6-AC154547 SmaI digestion ；
泳道 B:pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc SmaI digestion。
[0018]圖4 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G_luc 轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞，測(cè)定培養(yǎng)液和細(xì)胞G-1uc表達(dá)。其中
VAP:丙戊酸(終濃度5 PM)；
BAC-9k:指 pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc ；
BAC-Pac:指 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc 經(jīng) PacI 酶切，自連后，仍然包含mDAT全基因。
[0019]圖5 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc 轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄 PCR 證實(shí)G-1uc與DAT 一起轉(zhuǎn)錄成融合的mRNA。其中，泳道I~5:引物:mouse-DAT RT-F 881和mouse-DAT RT-R 1149 擴(kuò)增子為 mDATc 881bp_1149 bp,長(zhǎng)度 269 bp ;泳道 6~10:引物:RT-BAC-1uc-1-F 1710 和 RT-BAC-luc-1-R 擴(kuò)增子長(zhǎng)度 893 bp。
泳道I HEK293 (無(wú)轉(zhuǎn)染)丙戊酸+，
泳道 2 HEK 293T 轉(zhuǎn)染 pBACe3.6-AC154547-3，mDAT-1RES-G-luc，
泳道 3 HEK 293T 轉(zhuǎn)染 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc，丙戊酸+，
泳道 4 HEK 293T 轉(zhuǎn)染 BAC-Pac，
泳道5 HEK 293T轉(zhuǎn)染BAC-Pac，丙戊酸+，
泳道6 HEK 293丙戊酸+，
泳道 7 HEK 293 轉(zhuǎn)染 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc，
泳道 8 HEK 293 轉(zhuǎn)染 pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc，丙戊酸+，
泳道 9 HEK 293 轉(zhuǎn)染 BAC-Pac，
泳道10 HEK 293轉(zhuǎn)染BAC-Pac，丙戊酸+，
其中 BAC-Pac:pBACe3.6-AC154547-3’mDAT-1RES-G-luc 經(jīng) PacI 酶切，自連后，仍然包含mDAT全基因。
圖6原位mDAT-1RES-G-luc報(bào)告基因轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，不限制本發(fā)明的范圍。
[0021]本發(fā)明實(shí)施例中所使用的限制性內(nèi)切酶為商業(yè)產(chǎn)品。質(zhì)粒載體、菌株均為商業(yè)產(chǎn)品，本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0022]實(shí)施例1構(gòu)建PgalK質(zhì)粒
1、通過(guò)兩步PCR,克隆galK開放閱讀框ORF至pBluescript SK(-)的EcoRI和BamHI位點(diǎn)。引物:
galK ORF I F:
5，-CCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGT-3，；galK ORF 2 F: AAATMGAATTCCTGTTGACMTTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCCAGGAGGCAGATCATG ； (EcoRI site 下劃線)
galK ORF R: AATAAAGGATCCTCAGCACTGTCCTGCTCCTT-3J (BamHI 位點(diǎn)下劃線)。
[0023]PCR反應(yīng)體系:第一步模板為W3110細(xì)菌DNA，第二步PCR模板為第一步PCR產(chǎn)物。 H2O 42 u I
IOXPfu Buffer 5 U I IOmM dNTPI U I
Template100 ng
Primers0.2 u I
PfuI u I
Total50 u I
PCR條件采用程序:
95°C 5 min ； 95°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 30 sec，30 循環(huán)；72°C 2min 延伸。
PCR產(chǎn)物取2 u I凝膠電泳，條帶清晰單一。
[0024]2、純化步驟I第二步PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物加5 M NH4Ac 5 U 1，混合后，加125 U I100% 乙醇，一80°C 4 h，14，000 rpm,4°C,30 min。棄上清，沉淀加 70% 乙醇 0.3 ml, 14, 000rpm,4°C, 15 min。棄上清,沉淀溶解在ddH20。
`[0025]3、EcoRI和BamHI雙酶切步驟2純化的DNA片段。
酶切體系為:
步驟3純化的DNA片段0.4 ii g (I ill)
BSA0.5 u I
EcoRI0.5 u I
BamHI0.5 u I
IOXNEBBuffer 25 u I
H2O42.5 u I
37V, 2 ho
[0026]4、1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用QIAquick Gel Extraction Kit,進(jìn)行膠回收DNA片段。
[0027]5、EcoRI 和 BamHI 雙酶切 pBluescript SK (-)，酶切體系為: pBluescript SK (-)0.4 Hg (I U I)
BSA0.5 u I
EcoRI0.5 u I
BamHI0.5 U I
10XNEBBuffer25 U I
H2O42.5 u I
37。。，2 ho
[0028]6、回收步驟 4 得到的 EcoRI 或 BamHI 線性 pBluescript SK(_)質(zhì)粒。加 5 M NH4Ac5 yl，混合后，加 125 u I 100% 乙醇，一80°C，4 h ；14, 000 rpm，4°C，30 min。棄上清，沉淀加70%乙醇0.3 ml, 14, 000 rpm，4°C，15 min。棄上清，沉淀溶解在ddH20。[0029]7、T4DNA連接酶連接步驟4 EcoRI單酶切DNA片段和步驟6 DNA片段，連接反應(yīng)體系20 yl，T4DNA連接酶I yl，16°C過(guò)夜。
[0030]8、連接產(chǎn)物 Iii I 和 10 ill 電轉(zhuǎn)感受態(tài)(One Shot? TOPlO Electrocomp E.coli, Cat# C404050, Invitrogen, CA, USA)混合，混合物轉(zhuǎn)到冰冷的 2 mm 電轉(zhuǎn)杯(Cat#4307 000.593, Eppendorf, Hamburg, Germany)。電轉(zhuǎn)裝置 Gibco BRL Cell PoratorElectroporation System (cat# 71600-050 和 11609-039，Gibco BRL)。設(shè)置:4 k 歐，330 u F, fast charge 400 kV電擊。電擊后，混合物轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0.3 ml中，225 rpm,37°C，1 h。取適量，接種氨芐抗性培養(yǎng)皿，37°C，12-16h。
[0031]9、鑒定。菌落PCR粗步鑒定含正確插入子菌落，得到含pgalK質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子菌落。細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。保存轉(zhuǎn)化PgalK菌種。
[0032]實(shí)施例2-4以小鼠多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體DAT基因(mDAT)為例，應(yīng)用BAC重組技術(shù)，把IRES-G-1uc重組在小鼠染色體DAT基因的第15個(gè)外顯子的終止密碼子后。構(gòu)建mDAT完整基因和IRES-G-1uc BAC重組體。BAC重組和galK陽(yáng)性選擇和陰性選擇流程示意圖見圖1o
[0033]實(shí)施例2 構(gòu)建 pBACe3.6_AC154547_galK
I)pBACe3.6-AC154547 轉(zhuǎn)化 SW102。
①抽提 pBACe3.6-AC154547 QIAGEN Large-Construct Kit (Cat# 12462 QIAGEN 德國(guó))試劑盒，按操作步驟進(jìn)行。
[0034]②制備SW102電轉(zhuǎn)感受態(tài)
a.用槍頭挑新鮮單克隆SW102菌落，接種至盛有Iml LB (含12.5 u g/ml四環(huán)素)液體培養(yǎng)基的15 ml離心管中。
b.32°C, 220 rpm，培養(yǎng) 14_16h。
c.第二天，以1:100的比例，將取0.5 ml菌液至50 ml LB (含12.5 u g/ml四環(huán)素)液體培養(yǎng)基中，32 °C，220 rpm，振搖2_3h，當(dāng)OD值達(dá)到0.5-0.6時(shí)，停止培養(yǎng)。
d.將菌液在冰上預(yù)冷lOmin，隨后將菌液分裝到25ml預(yù)冷的離心杯中，4°C，5000 rpm離心IOmin0
e.棄上清，離心管中加入少量冰ddH20，冰上，使沉淀懸浮后，再將水注滿離心杯，4°C，4000 rpm離心5min。重復(fù)一次。
f.棄上清，每個(gè)離心管中加入冰50u I ddH20。
[0035]③電轉(zhuǎn)化25 U I感受態(tài)加5 U I (2u g) pBACe3.6-AC154547，溫和混勻，混合物轉(zhuǎn)到冰冷的2 mm電轉(zhuǎn)杯。電轉(zhuǎn)裝置和設(shè)置同實(shí)施例1步驟8。電擊后，混合物轉(zhuǎn)入300 U I的LB液體培養(yǎng)基，32 0C，220-250 rpm復(fù)蘇Ih。接種在含32 u g/ml氯霉素和12.5 y g/ml四環(huán)素的培養(yǎng)皿上，32°C培養(yǎng)，18-24h。保存轉(zhuǎn)化pBACe3.6-AC154547的SW102。
[0036]2) PCR擴(kuò)增含同源臂galK雙鏈DNA。
以實(shí)施例1得到的PgalK為模板，根據(jù)NCBI genebank數(shù)據(jù)庫(kù)所示目的基因序列設(shè)計(jì)擬插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含同源臂hF (50 bp)和hR (50 bp)，用于擴(kuò)增galK的引物，PCR獲得含目的基因DAT同源臂hF和載體同源臂hR的galKDNA片段。
設(shè)計(jì)含同源臂hF和hR，用于擴(kuò)增galK的引物:
homology arm F-F: CTC AAG GCT CAG CCC AAC TCT GCA ACT GTT CTC TTC TGC TCTGTC CTG CAC CTG TTG ACA ATT AAT CAT CGG CA (同源臂 hF，下劃線)
homology arm R-R: TGC TGC TGT TTA GGG ATC TGC AGC ATA TCA TGG CGT GTA ATATGA GAG ACT CAG CAC TGT CCT GCT CCT T (同源臂 hR，下劃線) PCR反應(yīng)體系:
Fermentals fast PCR mix10 u I
Primers (50 mM)0.2 u I
pgalK 100 ng0.1 u I
H2O9.7 u I
Total20 u I
PCR反應(yīng)程序:
95°C 5 min,95°C I sec,60°C 5sec,72°C 20 sec,40 cycle。72°C 3min。
[0037]3) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用QIAquick Gel Extraction Kit,進(jìn)行膠回收DNA片段。
[0038]4)制備步驟I)得到的轉(zhuǎn)化pBACe3.6-AC154547的SW102電轉(zhuǎn)感受態(tài)。方法步驟同I)②。
[0039]5 ) BAC重組和galK陽(yáng)性選擇。
步驟3)得到的DNA片段2 Ul,電轉(zhuǎn)化步驟4)得到的電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)化操作同步驟
I)③。電轉(zhuǎn)化后，混合物轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0.3 ml中，細(xì)菌42°C，15min，225 rpm, 32°C I h。M9鹽溶液洗2次后，接種galK陽(yáng)性選擇培養(yǎng)皿，32 °C，72h。galK陽(yáng)性選擇培養(yǎng)皿制備:
陋:........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................]丨—^..........................................................................................1
—11 Bg I
A itilodaweect|
5k M63 (autoclai/ed)20 ml
IM MgSCV.7HjO (autodaved)0 I ml
[***...........................................................................................................................................................................................................*][***Frn1..............................................*]
[SO mg/iri L4ajtcifie(Sltarile filteiieil)~|| 45cT|J|
32 mg/M Chlorainphetu col100 ti_
6)galK陽(yáng)性選擇培養(yǎng)皿得到的克隆，MacConkey培養(yǎng)板劃線，再次選擇取紅色克隆1，2,3,4.鑒定。細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，PCR初步證實(shí)得到pBACe3.6_AC154547_galK重組子菌落。測(cè)序驗(yàn)證。保存含pBACe3.6-AC154547-galK重組子菌種。
[0040]實(shí)施例3 構(gòu)建打靶質(zhì)粒 pNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc。
由于 AC154547 上 mDAT 缺少 3’ mDAT (8 kb)。AC158359.2 含 mDAT 3’ 8 kb。以AC158359.2為模板，克隆同源臂HR和3’mDAT (8 kb、同源臂HF位于mDAT，同源臂R位于載體)入pNEB193，并在mDAT第15外顯子終止密碼子(taa)后，克隆入IRES和G-luc。構(gòu)建 PNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc 質(zhì)粒。
[0041]I)以AC158359.2為模板，克隆終止密碼子taa前3’mDAT (2 kb，含同源臂HF 420bp)入 pNEB193 的 AscI 位點(diǎn)(引物 Fl，Rl )。引物 Fl:AAATAAGGCGCGCCTTTCACTATGTAATTCTGGC(Ascl.下劃線)
引物 Rl =AAATAAGGCGCGCCg^rCTTTACACCAACAGCCAATGGC (Ascl,下劃線斜
體)
2)以pBACe3.6_AC154547_galK為模板，克隆同源臂HR (420 bp)入步驟I)得到的質(zhì)粒的PacI位點(diǎn)。
引物 F2:ttttttTTAATTAAg61?ga7ga}AGCGACTCAAGCCTTCGCG (Pacl.下劃線；Not I,斜
體)
引物 R2:ttttttTTAATTAA ATTCTTGCGTCTGATCTTTC (Pacl,下劃線)。
[0042]3)以pIRES2-EGPF為模板，克隆IRES，入步驟2)得到的質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)。
引物 F3 AtttttGfi^CTGCCCC TCTCCCTCCC CCCCCCCTAA (BamHI,斜體)
引物 R3:ttttttg^ra7CCATGGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGG (BamHI,斜體；NcoI,下劃
線)
4)以AC158359.2為模板，克隆終止密碼子taa后3’mDAT (7.4 kb)入步驟3)得到的質(zhì)粒的NcoI和NotI位點(diǎn)(引物F3, R3)。
引物 F4:ttttttCCATGGAGTGGAAGGAGACAGCTGCC (Ncol,下劃線)
引物 R4:ttttttGCGGCC GCGAAAACGAATTCGCCCTTGGCCG (Notl,下劃線)。
[0043]5)以 pMCS-Gaussia-Luc 載體(ThermoFisher)為模板，克隆 G-luc 入步驟 4)得到質(zhì)粒的 NcoI 位點(diǎn)，形成 pNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc 打靶質(zhì)粒(12 kb)。
引物 F5:ttttttCCATGGGAGTCAAAGTTCTG (Ncol,下劃線)
引物 R5:ttttttCCATGGTTAGTCACCACCGGCCCCCT (Ncol,下劃線)。
[0044]實(shí)施例4 構(gòu)建重組體 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc。
1)AscI/PacI 雙酶切 pNEB193-HFR-3’ mDAT-1RES-G-luc 打靶質(zhì)粒(12 kb)，得到含同源臂 HFR-3’mDAT-1RES-G-luc 片段(9 kb)。
2)制備實(shí)施例2得到的含pBACe3.6_AC154547_galK重組子菌種SW102電轉(zhuǎn)感受態(tài)。方法步驟同實(shí)施例2，步驟I)②。
3)步驟I)得到的DNA片段5Ul,電轉(zhuǎn)化步驟2)得到的電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)化操作同實(shí)施例2，步驟I)③。電轉(zhuǎn)化后，混合物轉(zhuǎn)入LB培養(yǎng)液0.3 ml中，細(xì)菌42°C，15min。225rpm, 32°C 4 h。M9鹽溶液洗2次后，接種galK陰性選擇培養(yǎng)皿，32°C，72h。
galK陰性性選擇培養(yǎng)皿制備:
fT^0.......................................................................................................................................................................................................................................................................................................................[[......160M......................................1 A評(píng)Il 3 g
Auiodavg-1
5>: M6J (autoclaired)40 ml
IM MgSQig-THaO (aiiiodaveci)_ 0 2 ml
20% 2 -decixy- g^tacios e (amio clave c
50%g}ycerol (aulodaved)800 ul





I ml
L-toanelrsteite"
[34mgtei~~] | 2:0 0(il~galK陰性選擇培養(yǎng)皿得到的克隆，細(xì)菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，分段多步PCR初步證實(shí)得到pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc 重組子菌落。見圖 2。
[0045]分段PCR引物如下:
第一對(duì)引物 1-F 5’ -tgttgatgcaaaccccagag _3 ’(位于 HF 前 199 bp 處)和 1-R5’ -gcaacagcaatgaggacagc-3’ (位于插入子 5’)。擴(kuò)增子 1227 bp。
第二對(duì)引物 2_F 5’ tggaagatccagcaatacgg-3 ’(位于插入子 3’ 端)和 2~R5’ -ccgttcgctaactcagcatc-3’(位于載體 HR 后 445 bp)，擴(kuò)增子 1488 bp。
第三對(duì)引物 3-F 5 ’ gggctgaactcaggttgtgg-3 ’ 3-R 5 ’-aggccaggcatcattcttga-3 ’ 位于插入子，擴(kuò)增子 1926 bp。
SmaI酶切，證實(shí)重組正確。
pBACe3.6-AC154547 和 pBACe3.6-AC154547-3’ mDAT-1RES-G-luc SmaI 酶切預(yù)測(cè)見下表。
【權(quán)利要求】
1.一種建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法，其特征在于重組位點(diǎn)是目的基因的最后一個(gè)外顯子的終止密碼子后，把IRES-報(bào)告基因重組在目的基因的最后一個(gè)外顯子的終止密碼子后，該重組方法為目的基因的表達(dá)調(diào)控研究提供完全天然的染色體環(huán)境。
2.權(quán)利要求1所述的一種建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法，其特征在于重組后，目的基因和報(bào)告基因一起轉(zhuǎn)錄成融合的mRNA，目的基因mRNA各外顯子剪接正確。
3.權(quán)利要求2所述的一種建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法，其特征在于報(bào)告基因與目的基因融合的mRNA，分別翻譯成報(bào)告基因蛋白和目的基因蛋白。
4.權(quán)利要求1所述的一種建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法，其特征在于重組方法中的IRES，報(bào)告基因可以從市售報(bào)告基因質(zhì)粒獲得。
5.權(quán)利要求4所述的一種建立報(bào)告基因重組在染色體目的基因上的方法，其特征在于市售報(bào)告基因質(zhì)?？梢允菬晒馑孛赶盗袌?bào)告基因質(zhì)粒，熒光蛋白系列報(bào)告基因質(zhì)粒，分泌性堿性磷酸酶系列報(bào)告基因質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103484496SQ201310327687
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】趙營(yíng), 翟德勝, 武俊芳, 宋向鳳, 許重潔, 趙德安, 李嵩箕, 谷爭(zhēng), 袁會(huì)峰, 趙繁榮, 王小引 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院