一種利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法，該方法將促進劑SRpf添加至聯(lián)苯降解菌的富集培養(yǎng)過程中，經(jīng)不斷馴化，獲得具有高效聯(lián)苯降解性能的富集液；促進劑SRpf的添加能顯著提高菌體生長量、菌群多樣性，及聯(lián)苯降解率，具體為：菌體生長量提高30-50%、聯(lián)苯降解率提高20-70%、香農(nóng)多樣性指數(shù)由1.56-1.70提高至2.10-2.34。本發(fā)明所涉及的促進劑SRpf具有復(fù)蘇VBNC菌群，促進菌體生長的功能。因此，促進劑SRpf不僅可以用于富集高效聯(lián)苯降解菌群，亦可用于促進其它有機污染物降解菌群的生長，為探索PCBs、PAHs等污染環(huán)境中潛在降解菌群，提供一種安全、廉價、高效的方法。
【專利說明】—種利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于污染物微生物降解領(lǐng)域，尤其涉及一種利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]聯(lián)苯(Biphenyl)天然存在于煤焦油、天然氣、原油中，通過化石燃料的燃燒進入環(huán)境中。在工業(yè)生產(chǎn)中，聯(lián)苯經(jīng)單質(zhì)碘和氯化鐵催化，可產(chǎn)生209種同系物，這一類化合物稱為多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls,簡稱PCBs)。PCBs因具有較好的阻燃性、高絕緣性及熱穩(wěn)定性，曾被廣泛應(yīng)用于變壓器、電容器絕緣油、燃料分散劑、潤滑劑、增塑劑和涂料等。PCBs作為12種持久性有機污染物(POPs)之一，由于環(huán)境持久性及“三致”效應(yīng)而成為目前廣泛關(guān)注的一種典型異生型有機污染物。由于PCBs屬于難降解的異生型有機物，可在自然環(huán)境中存在數(shù)十年以上，因此，雖然PCBs已禁用多年，但它所造成的環(huán)境污染問題隨著研究的深入而日益突出。由于PCBs獨特的化學(xué)穩(wěn)定性，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法因存在低效、二次污染等問題而成為應(yīng)用瓶頸，微生物作為大量存在的自然資源，且微生物降解治理技術(shù)具有安全、高效、經(jīng)濟等特點，因此，PCBs污染環(huán)境的微生物修復(fù)技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景。
[0003]PCBs污染環(huán)境的微生物修復(fù)以礦化或共代謝兩種方式進行。一些低氯PCBs可以作為微生物自身生長和繁殖所需的碳源及能源而進行好氧降解。而對于高氯(氯取代數(shù) 5)?088，需經(jīng)厭氧脫氯轉(zhuǎn)化為低氯？088，才能進行好氧降解。其降解途徑為:由雙加氧酶對2，3位進行氧化，脫氫得到鄰苯二酚，再由開環(huán)反應(yīng)的得到苯甲酸。這種代謝途徑類似于其他芳香族化合物，如甲苯，聯(lián)苯。且聯(lián)苯降解菌在PCBs共代謝中發(fā)揮重要作用，大多數(shù)聯(lián)苯降解菌已被證實同樣具有降解PCB同系物的作用。另外，在篩選PCBs降解菌時，一般以聯(lián)苯為唯一碳源，先篩選能利用聯(lián)苯的菌株，然后再檢驗其對PCB同系物的降解性能。
`[0004]雖然微生物修復(fù)PCBs具有很大的潛力，且進行了大量的研究工作，但目前大多仍限于實驗室研究階段。PCBs高效降解功能菌種資源匱乏成為其推廣應(yīng)用的最大瓶頸。另外，實驗室獲得的高效降解菌往往在實際修復(fù)場地呈現(xiàn)低降解活性，甚至失活的現(xiàn)象。現(xiàn)今，構(gòu)建PCBs降解工程菌及固定化降解酶雖然是構(gòu)建高效PCBs降解菌的途徑，但存在很多問題，如宿主細胞的選擇、基因水平轉(zhuǎn)移及固定化成本高等。
[0005]因此，如何從作為自然環(huán)境中絕大部分(90%?99%)微生物資源的活的但非可培養(yǎng)的狀態(tài)(“viable but non-culturable”,簡稱VBNC)菌群中，尋找潛在PCBs和聯(lián)苯降解菌群，提高菌株的降解效能成為打破微生物修復(fù)技術(shù)在PCBs污染環(huán)境中應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵所在。藤黃球菌復(fù)蘇促進因子(resuscitation-promoting factor, Rpf )的發(fā)現(xiàn)是VBNC狀態(tài)菌復(fù)蘇的重要突破。藤黃球菌Rpf不僅可以復(fù)蘇多種近緣的高GC革蘭氏陽性菌，如:結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii),恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)和鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)等。同時,對低GC革蘭氏陽性菌及部分革蘭氏陰性菌(Curvibacter fontana sp.)也有較好的復(fù)蘇促進功能。目前,對于Rpf復(fù)蘇及促進作用的關(guān)注，主要集中于醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)流域，而未從微生物資源及環(huán)境功能角度展開研究。
[0006]綜上所述，利用含Rpf 的促進劑 SRpf (Supernant from Micrococcus Iuteuscontaining Rpf)不僅可以用于富集高效聯(lián)苯降解菌群，提高菌群的降解效能，成為獲得高效聯(lián)苯降解菌群的關(guān)鍵突破。另外，促進劑SRpf亦可用于促進其它有機污染物降解菌群的生長，為探索PCBs、PAHs等污染環(huán)境中潛在降解菌群，提供一種安全、廉價、高效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有PCBs污染環(huán)境的微生物修復(fù)技術(shù)中存在的菌種降解效能低、生長速度慢，耐受濃度低的不足，提供一種利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法。該方法操作簡便、高效、無二次污染。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法，包括以下步驟:
[0009](I)將藤黃球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接種于LMM液體培養(yǎng)基，使其培養(yǎng)液 OD6tltol 為 0.05-0.2 ;LMM 液體培養(yǎng)基組成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02g/L 的 L-蛋氨酸，0.04g/L 的維生素 BI,0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的 L-乳酸鋰鹽，1.5-3.0ml/L 的礦質(zhì)鹽溶液(0.375g/LCuSO4.5Η20，0.785g/L MnCl2.4Η20，0.18g/LFeS04.7Η20，0.029g/L Na2MoO4.2Η20，0.089g/L ZnSO4.7Η20)，pH 為 6.5-8.0，培養(yǎng) 24_36h，獲得種子培養(yǎng)液；
`[0010](2)將步驟I獲得的種子培養(yǎng)液按3-5%(v/v)的接種量接種至LMM液體培養(yǎng)基中，160r/min,培養(yǎng) 48_60h，將發(fā)酵液離心(8000-10000r/min) 10_15min 去除菌體，經(jīng) 0.22 μ m過濾膜進行無菌過濾，所獲得的上清液即為促進劑SRpf，其蛋白含量為23.96-25.34mg/L，保存于_20°C條件下備用；
[0011](3)將步驟2獲得的促進劑SRpf按體積分數(shù)為15%添加到以聯(lián)苯為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，混勻后得富集培養(yǎng)基，其中無機鹽培養(yǎng)基的組成是:l_2g/L的KH2PO4,2.5-3.5g/L 的 K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4,0.02g/L 的 FeSO4.7Η20，I g/L 的 NaCl，2_4g/L的(NH4)2SO4, (λ OI g/L 的 CaCl2, 2mL/L 的微量鹽溶液(4mg/L 的 Mo03，28mg/L 的 ZnSO4.5Η20，0.02mg/L 的 CuSO4.5H20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20), pH為 7.3-7.5，聯(lián)苯為 500-3000mg/L ；
[0012](4)取PCBs污染土壤加入至步驟3獲得的富集培養(yǎng)基中，PCBs污染土壤與富集培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比為35-65g/L ；30°C、180-200r/min搖床培養(yǎng)，每代培養(yǎng)3_5d，傳代培養(yǎng)5-6次，初始聯(lián)苯濃度為500mg/L，以500mg/L遞增，富集培養(yǎng)基中聯(lián)苯濃度達2500_3000mg/L ；
[0013](5)將步驟4獲得的培養(yǎng)液按4-6% (v/v)的接種量接種至含500_4500mg/L聯(lián)苯的無機鹽培養(yǎng)基中，300C、180-200r/min,培養(yǎng)24_64h。
[0014]將步驟5獲得的發(fā)酵液進行聯(lián)苯降解率和菌體生長量測定，結(jié)果表明添加促進劑SRpf的效果顯著，具體為:菌體生長量提高30-50%、聯(lián)苯降解率提高20-70%、香農(nóng)多樣性指數(shù)由 1.56-1.70 提高至 2.10-2.34。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有的聯(lián)苯降解菌富集方法相比，其有益效果是:[0016]1、本發(fā)明所用促進劑SRpf由藤黃球菌分泌，具有成本低廉、原料易得、安全無毒、操作簡便等特點。
[0017]2、本發(fā)明利用促進劑SRpf的復(fù)蘇促進作用，不僅可以復(fù)蘇PCBs污染土壤中的VBNC菌群，而且可以促進低降解效能菌群的生長。從而富集高效聯(lián)苯降解菌群，充分發(fā)揮PCBs污染土壤中土著微生物的作用。
[0018]3、本發(fā)明中將促進劑SRpf添加至聯(lián)苯降解菌群的富集培養(yǎng)基中，通過與添加失活的SRpf (促進劑SRpf經(jīng)121°C，高壓滅菌20min)進行對比，表明促進劑SRpf的添加能顯著提高菌體生長量、菌群多樣性，及聯(lián)苯降解率。
[0019]4、本發(fā)明按體積分數(shù)為15%添加促進劑SRpf，30°C、180-200r/min，培養(yǎng)24h，對1500mg/L聯(lián)苯，降解率為95.7-98.2%，可知促進劑SRpf能有效提高聯(lián)苯降解率，同時具有快速、無二次污染等特點，充分體現(xiàn)出實用性、經(jīng)濟性、環(huán)保性的循環(huán)經(jīng)濟特征，極具推廣應(yīng)用價值。
[0020]5、本發(fā)明中的促進劑SRpf不僅可以用于富集高效聯(lián)苯降解菌群，亦可用于促進其它有機污染物降解菌群的生長，為探索PCBs、PAHs等污染環(huán)境中潛在降解菌群，提供一種安全、廉價、高效的方法。
[0021]綜上所述，本發(fā)明符合綠色安全的環(huán)保理念，實現(xiàn)了微生物資源化，能有效發(fā)揮PCBs污染環(huán)境中土著微生物的降解特性，為促進微生物修復(fù)技術(shù)的推廣應(yīng)用提供一種安全無毒、成本低廉的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是添加促進劑SRpf對菌體生長量和聯(lián)苯降解率的影響圖。
【具體實施方式】.
[0023]本發(fā)明利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法，包括以下步驟:
[0024](I)將藤黃球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接種于LMM液體培養(yǎng)基，使其培養(yǎng)液 OD6tltol 為 0.05-0.2 ;LMM 液體培養(yǎng)基組成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02g/L 的 L-蛋氨酸，0.04g/L 的維生素 BI,0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的 L-乳酸鋰鹽，1.5-3.0ml/L 的礦質(zhì)鹽溶液(0.375g/LCuSO4.5Η20，0.785g/L MnCl2.4Η20，0.18g/LFeS04.7Η20，0.029g/L Na2MoO4.2Η20，0.089g/L ZnSO4.7Η20,溶劑為水)，pH為6.5-8.0,培養(yǎng)24_36h，獲得種子培養(yǎng)液；
[0025](2)將步驟I獲得的種子培養(yǎng)液按3-5%(v/v)的接種量接種至LMM液體培養(yǎng)基中，160r/min,培養(yǎng) 48_60h，將發(fā)酵液離心(8000-10000r/min) 10_15min 去除菌體，經(jīng) 0.22 μ m過濾膜進行無菌過濾，所獲得的上清液即為促進劑SRpf，其蛋白含量為23.96-25.34mg/L,保存于_20°C條件下備用；
[0026](3)將步驟2獲得的促進劑SRpf按體積分數(shù)為15%添加到以聯(lián)苯為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，混勻后得富集培養(yǎng)基，其中無機鹽培養(yǎng)基的組成是:l_2g/L的KH2PO4,2.5-3.5g/L 的 K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4,0.02g/L 的 FeSO4.7Η20，I g/L 的 NaCl，2_4g/L的(NH4)2SO4, (λ OI g/L 的 CaCl2, 2mL/L 的微量鹽溶液(4mg/L 的 Mo03，28mg/L 的 ZnSO4.5Η20，0.02mg/L 的 CuSO4.5H20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20，溶劑為水)，pH 為 7.3-7.5，聯(lián)苯為 500-3000mg/L ；
[0027](4)取PCBs污染土壤加入至步驟3獲得的富集培養(yǎng)基中，PCBs污染土壤與富集培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比為35-65g/L ；30°C、180-200r/min搖床培養(yǎng)，每代培養(yǎng)3_5d，傳代培養(yǎng)5-6次，初始聯(lián)苯濃度為500mg/L，以500mg/L遞增，富集培養(yǎng)基中聯(lián)苯濃度達2500_3000mg/L ；
[0028](5)將步驟4獲得的培養(yǎng)液按4-6% (v/v)的接種量接種至含500_4500mg/L聯(lián)苯的無機鹽培養(yǎng)基中，300C、180-200r/min,培養(yǎng)24_64h。
[0029]將步驟5獲得的發(fā)酵液進行聯(lián)苯降解率和菌體生長量測定，結(jié)果表明添加促進劑SRpf的效果顯著，具體為:菌體生長量提高30-50%、聯(lián)苯降解率提高20-70%、香農(nóng)多樣性指數(shù)由 1.56-1.70 提高至 2.10-2.34。
[0030]下面根據(jù)實施例詳細描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯:
[0031]本發(fā)明利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法，包括以下步驟:
[0032]1、促進劑SRpf的制備
[0033]藤黃球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)可購于日本理化學(xué)研究所微生物菌種
保藏中心。
[0034]LMM 培養(yǎng)基組成為:4.0g/L NH4Cl, 1.4g/L KH2PO4,0.005g/L 生物素，0.02g/LL-蛋氨酸，0.04g/L 維生素 BI, 1.0g/L 肌苷，0.03g/L MgSO4,8.0I g/L L-乳酸鋰鹽，2.0ml/L 礦質(zhì)鹽溶液(0.375g/L CuSO4.5Η20，0.785g/L MnCl2.4Η20，0.18g/LFeS04.7Η20，0.029g/LNa2MoO4.2Η20，0.089g/L ZnSO4.7Η20), pH 為 7.5。
[0035]菌種活化與種子液的 培養(yǎng):從斜面試管將M.1uteus接種于培養(yǎng)皿中，30°C培養(yǎng)3d。挑取3環(huán)M.1uteus菌苔至裝有50mL LMM液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C，160r/min，培養(yǎng) 36h。
[0036]M.1uteus發(fā)酵培養(yǎng):取種子培養(yǎng)液按4% (v/v)的接種量將接入裝有15mLLMM培養(yǎng)液的50mL三角瓶中，300C，160r/min培養(yǎng)48h。
[0037]2、聯(lián)苯降解菌的富集培養(yǎng)
[0038]無機鹽培養(yǎng)基的組成為:lg/LKH2PO4, 3g/L K2HPO4.3H20，0.2g/L MgSO4,0.02g/L FeSO4.7H20,1 g/L NaCl, 3g/L (NH4) 2S04,0.0lg/L CaCl2,微量鹽溶液 2mL/L (4mg/LMoO3, 28mg/L ZnSO4.5H20,0.02mg/L CuSO4.5H20,4mg/L H3BO3,4mg/L MnSO4.5H20,4mg/LCoCl2.6H20), pH 為 7.3。
[0039]富集培養(yǎng)基:聯(lián)苯含量為:500-2500mg/L，處理組:無機鹽培養(yǎng)基中按15% (體積分數(shù))添加促進劑SRpf，對照組:無機鹽培養(yǎng)基中按15% (體積分數(shù))添加失活的SRpf。
[0040]富集培養(yǎng):取5g 土壤分別加到裝有IOOmL含500mg/L聯(lián)苯的處理組與對照組的富集培養(yǎng)基中，300C，180r/min培養(yǎng)6d后，將第一代的富集液按6%接種量接種至裝有50mL含1000mg/L聯(lián)苯的富集培養(yǎng)基的150mL三角燒瓶中，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)6d后，將第二代的富集液按4%接種量接種至裝有50mL含1500mg/L聯(lián)苯的富集培養(yǎng)基的150mL三角燒瓶中，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)4d后，將第三代的富集液按4%接種量接種至裝有50mL含2000mg/L聯(lián)苯的富集培養(yǎng)基的150mL三角燒瓶中，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)3d后，將第四代的富集液按4%接種量接種至裝有50mL含2000mg/L聯(lián)苯的富集培養(yǎng)基的150mL三角燒瓶中，300C，180r/min搖床培養(yǎng)，經(jīng)5代富集培養(yǎng)后，富集液最終聯(lián)苯濃度達到2500mg/L，分別獲得對照組與處理組富集培養(yǎng)液。
[0041]3、促進劑SRpf添加對菌體生長和聯(lián)苯降解率的影響
[0042]將對照組和處理組的富集液按5%的接種量接種至裝有20mL分別含500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500mg/L聯(lián)苯的無機鹽培養(yǎng)液中，每個濃度均做三組平行實驗，30°C>200r/min,培養(yǎng)64h后,加入等體積的乙酸乙酯萃取,振蕩25min后,倒入50ml比色管中，靜置20min，取上層有機相逐級稀釋后，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測定聯(lián)苯的殘留量，取下層無機相進行菌體生長量的測定。
[0043]聯(lián)苯含量的測定:取上層有機相測定殘留的聯(lián)苯濃度。GC-MS測定的條件:GC條件:GC (Agilent7890)進行測定，DB-5石英毛細管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);檢測器放射源為63Ni ;進樣口溫度:270°C ;檢測器溫度:280°C ;載氣:高純氮氣，恒流1.0mL/min ;無分流進樣I μ L。升溫程序為:始溫70°C,保持Imin, 30°C /min升至280°C,保持7min,總運行時間8min。MS條件:MS (5975C inter MSD)EI離子源溫度為200°C，四級桿溫度150°C，檢測模式為選擇離子掃描，溶劑延遲3min。聯(lián)苯有三種選擇離子，m/z分別為152、153、154。TMX有四種選擇離子，m/z分別為207、209、242、244。
[0044]菌體生長量(OD6tltl)的測定:菌體生長是通過測定600nm下的光密度值(0D_)進行表示。取無機相發(fā)酵液，10000r/min離心IOmin,收集菌體,蒸懼水洗漆3次后稀釋至原體積，用UV-5500 (PC)型分光光度計在波長600nm處測定光密度值，以O(shè)D6tltl來表示菌體生長量。
[0045]經(jīng)分析測定，結(jié)果表明促進劑SRpf的添加能顯著提高菌體生長量和聯(lián)苯降解率，具體為:菌體生長量提高30-50%，聯(lián)苯的降解率提高20-70%，見圖1。4、促進劑SRpf添加對菌群多樣性的影響.
[0046]將富集培養(yǎng)5代后的處理組與對照組富集液，分別提取總DNA，用細菌16SrDNA弓丨物F357-GC/R518對所提取的DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系50 μ L包括=EasyTaqMix: 25 μ L，引物 338F-GC(5’-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，)和 518R(5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)各 I μ L，模板 DNA2 μ L,去離子水:21 μ L。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸20s，進行30個循環(huán)，72°C終延伸5min，16°C保持。擴增片段約為200bp，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測進行變形梯度凝膠電泳(DGGE)，DGGE采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為30%?60%，PCR產(chǎn)物上樣量為45 μ L，加入20 μ L的6 X loading buffer, I X TAE, 160V電壓條件下電泳6h。電泳后染色30min，拍照。根據(jù)呈現(xiàn)的條帶數(shù)目和亮度來分析菌群的結(jié)構(gòu)變化及優(yōu)勢菌群。通過Quantity 0ne4.0軟件處理DGGE圖譜,分析每個泳道中各個條帶的峰值密度,計算香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon-Weaver diversity index, H):Η=_ Σ (rij/N) log (rij/N),其中 Iii 為每個條帶的峰值密度，N為所有條帶峰值總和，S為DNA條帶數(shù)。
[0047]富集液的外觀及DGGE分析結(jié)果顯示，對照組和處理組的香農(nóng)多樣性指數(shù)分別為
1.76和2.11，表明促進劑SRpf的添加使得菌體生長量與菌群多樣性得到明顯提高。
【權(quán)利要求】
1.一種利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法，其特征在于，包括以下步驟: (O將藤黃球菌接種于LMM液體培養(yǎng)基，使其培養(yǎng)液OD6tltol為0.05-0.2 ；LMM液體培養(yǎng)基組成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的 KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02 g/L 的L-蛋氨酸，0.04 g/L 的維生素 BI,0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的L-乳酸鋰鹽，1.5-3.0ml/L的礦質(zhì)鹽溶液，pH為6.5-8.0 ;培養(yǎng)24_36h，獲得種子培養(yǎng)液； (2)將步驟I獲得的種子培養(yǎng)液按3-5%(v/v)的接種量接種至LMM液體培養(yǎng)基中，160r/min,培養(yǎng) 48_60h，將發(fā)酵液離心(8000-10000r/min) 10_15min 去除菌體，經(jīng) 0.22 μ m過濾膜進行無菌過濾，所獲得的上清液即為促進劑SRpf，其蛋白含量為23.96-25.34 mg/L，保存于-20 C條件下備用； (3)將步驟2獲得的促進劑SRpf按體積分數(shù)為15%添加到以聯(lián)苯為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，混勻后得富集培養(yǎng)基，其中無機鹽培養(yǎng)基的組成是:l_2g/L的KH2PO4,2.5-3.5g/L 的 K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4, 0.02g/L 的 FeSO4.7Η20，I g/L 的 NaCl，2_4g/L 的(NH4)2SO470.01 g/L 的 CaCl2, 2mL/L 的微量鹽溶液，pH 為 7.3-7.5，聯(lián)苯為 500_3000mg/L ； (4)取PCBs污染土壤加入至步驟3獲得的富集培養(yǎng)基中，PCBs污染土壤與富集培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比為35-65g/L ；30°CU80-200r/min搖床培養(yǎng)，每代培養(yǎng)3_5d，傳代培養(yǎng)5_6次，初始聯(lián)苯濃度為500mg/L，以500mg/L遞增，富集培養(yǎng)基中聯(lián)苯濃度達2500_3000mg/L ； (5)將步驟4獲得的培養(yǎng)液按4-6%(v/v)的接種量接種至含500-4500mg/L聯(lián)苯的無機鹽培養(yǎng)基中，300C、180-200r/min,培養(yǎng) 24_64h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1.所述利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法，其特征在于，所述步驟I中，所述礦質(zhì)鹽溶液的組成為:0.375g/L的CuSO4.5H20，0.785g/L的MnCl2.4Η20，0.18g/L 的 FeSO4.7Η20，0.029g/L 的 Na2MoO4.2Η20，0.089g/L 的 ZnSO4.7H20,溶劑為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用促進劑SRpf富集高效聯(lián)苯降解菌群的方法，其特征在于，所述步驟I中，所述微量鹽溶液的組成為:4mg/L的Mo03，28mg/L的ZnSO4.5H20，0.02mg/L的 CuSO4.5H20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20，溶劑為水。
【文檔編號】C12R1/265GK103436460SQ201310254289
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月24日
【發(fā)明者】蘇曉梅, 沈超峰, 胡金星, 秦智慧, 黃榮浪 申請人:浙江大學(xué)