一種多溴聯(lián)苯同系物半抗原及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法，尤其是涉及一種多溴聯(lián)苯同系物半抗原及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 溴系阻燃劑是目前世界上產(chǎn)量最大的有機(jī)阻燃劑之一，其中主要是多溴聯(lián)苯醚 (PBDEs)和多溴聯(lián)苯（PBBs)類物質(zhì)。其中，四溴雙酚A(簡(jiǎn)稱TBBPA)是由雙酚A溴化所得， 它是我國(guó)目前有機(jī)溴系阻燃劑的主要產(chǎn)品，屬于多溴聯(lián)苯類中對(duì)人體危害較小的新型溴系 阻燃劑。TBBPA常作為阻燃劑添加入樹脂、聚苯乙烯和聚氨酯泡沫等高分子合成材料中，廣 泛地應(yīng)用于塑料制品、紡織品、電路板和建筑裝潢材料等各種制造業(yè)產(chǎn)品和材料領(lǐng)域，并隨 著這些產(chǎn)品的使用，慢慢逸散到環(huán)境中。
[0003]國(guó)內(nèi)外廣大環(huán)境學(xué)者對(duì)各種環(huán)境介質(zhì)和生物樣品中TBBPA的濃度和毒性效應(yīng) 做了大量研究。研究表明，TBBPA可以在各種水體、底泥、土壤、大氣等各種環(huán)境介質(zhì)中存 在，并可以隨氣溶膠遠(yuǎn)距離迀移。在不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物體內(nèi)含量變化表現(xiàn)出明顯的生物富 集性，并對(duì)生物體有毒性和內(nèi)分泌干擾性。TBBPA的污染能力有很高的持久性，主要危害 有三點(diǎn)：首先，長(zhǎng)期接觸會(huì)妨礙大腦和骨骼發(fā)育；其次，被焚化處理時(shí)，會(huì)釋放出有高致癌 性的溴化二惡英和呋喃。因此，研究認(rèn)為TBBPA是潛在的具有持久性、生物累積性和毒性 (PBT-persistentbioaccumulativetoxie)的化合物。早在2003年，TBBPA就已經(jīng)引起世 界綠色和平組織的重視。歐盟關(guān)于環(huán)保的"2個(gè)指令"起初計(jì)劃限制所有溴代阻燃劑的使 用，并設(shè)想以磷、氮替代，但因氮、磷資源缺乏，個(gè)別性能遠(yuǎn)不能滿足需求以及可能造成水體 的富營(yíng)養(yǎng)化的潛在風(fēng)險(xiǎn)，而未將TBBPA納入。目前，TBBPA已作為危害物質(zhì)被列入《東北大 西洋海洋環(huán)境保護(hù)條例》0SPAR的名錄中。
[0004] 目前對(duì)TBBPA的檢測(cè)手段主要為氣相色譜和高效液相色譜等儀器檢測(cè)方法，這些 方法雖然準(zhǔn)確可靠，但對(duì)樣品的預(yù)處理方法和操作人員的專業(yè)性有很高的要求。正因?yàn)檫@ 些方法的處理復(fù)雜、耗時(shí)、儀器價(jià)格昂貴而不適合推廣使用，也不利于在環(huán)境污染事故現(xiàn)場(chǎng) 快速檢測(cè)。為克服這些缺點(diǎn)，尋求一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分析方法就成為環(huán)境 監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的主要研究方向。
[0005] 20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特異 性、可逆性結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)。免疫分析具有常規(guī)理化分析技術(shù)無(wú)可比擬的選擇性和高 靈敏性，非常適合復(fù)雜介質(zhì)中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強(qiáng)、靈敏度高、 方法快捷簡(jiǎn)單、分析通量大、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，使得該類方法可以滿足簡(jiǎn)單、快速、靈敏地 檢測(cè)持久性有機(jī)污染物的要求。1985年美國(guó)Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等發(fā) 明了一種特異性DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，成為PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱PCR，即聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。1992年Sano等將免疫分析技術(shù)與PCR技術(shù)結(jié)合，發(fā)展出免疫PCR技術(shù)。免 疫PCR技術(shù)兼具了免疫分析的特異性強(qiáng)和PCR技術(shù)的靈敏度高的特點(diǎn)，可用于檢測(cè)環(huán)境中 痕量污染物。隨著生物條形碼技術(shù)的發(fā)展，免疫PCR技術(shù)與生物條形碼相結(jié)合發(fā)展的免疫 PCR生物條形碼方法可以解決步驟繁瑣、有機(jī)溶劑干擾過(guò)多的問(wèn)題，此外還可以大大提高檢 測(cè)方法的靈敏度。
[0006] 目前尚沒(méi)有免疫PCR生物條形碼檢測(cè)方法檢測(cè)TBBPA的相關(guān)報(bào)道。對(duì)于TBBPA免 疫監(jiān)測(cè)方法的建立，高純度合適的半抗原是制備具有高靈敏度和特異性免疫原和高效價(jià)抗 體的根本，更是建立TBBPA免疫檢測(cè)方法的關(guān)鍵。因此，TBBPA半抗原的制備是采用免疫方 法測(cè)定TBBPA的基礎(chǔ)，對(duì)于建立多溴聯(lián)苯單體的監(jiān)測(cè)方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和理論研 究意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是首次提供一種步驟簡(jiǎn)單，速度快，產(chǎn)率高 的多溴聯(lián)苯同系物半抗原及其制備方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明提供了一種多溴聯(lián)苯同系物半抗原，結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0010]
式I。
[0011] 所述式I化合物為淡黃色針狀結(jié)晶體，熔點(diǎn)為167~170°C。
[0012] 本發(fā)明還涉及一種多溴聯(lián)苯同系物半抗原的制備方法，包括步驟：
[0013]TBBPA
t溴乙酸在堿性環(huán)境中反應(yīng)，在TBBPA分子酚羥基基 團(tuán)末端引入一個(gè)羧基基團(tuán)。引入的羧基基團(tuán)可與載體蛋白偶聯(lián)。
[0014] 優(yōu)選地，所述TBBPA與溴乙酸在堿性環(huán)境中反應(yīng)具體包括：
[0015]A1、將TBBPA和堿金屬氫氧化物溶解在非質(zhì)子性有機(jī)溶劑中，得溶液A，逐漸升溫；
[0016]A2、將溶解于非質(zhì)子性有機(jī)溶劑的溴乙酸逐滴加入到步驟A1中升溫后的溶液A 中，隨后保持恒溫回流反應(yīng)，直至原料點(diǎn)消失為止。
[0017] 其化學(xué)反應(yīng)方程式如下：
[0018]
[0019] 優(yōu)選地，所述非質(zhì)子性有機(jī)溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜或丙酮。
[0020] 優(yōu)選地，所述的TBBPA、堿金屬氫氧化物和溴乙酸的摩爾比為1:2~4:1~2。如 化學(xué)反應(yīng)方程所示，理想狀態(tài)下TBBPA、堿金屬氫氧化物的摩爾比是1:2,但為了反應(yīng)順利 進(jìn)行，一般堿金屬氫氧化物可以過(guò)量一些，但不能超過(guò)2倍；理想狀態(tài)下TBBPA與堿金屬氫 氧化物反應(yīng)生成的半抗原前體物與溴乙酸的摩爾比是1:1，為確保反應(yīng)順利向右進(jìn)行，溴乙 酸要過(guò)量，但不能超過(guò)理想摩爾量的2倍。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述堿金屬氫氧化物為氫氧化鈉或氫氧化鉀。
[0022] 優(yōu)選地，步驟A2中，所述溶液A溫度為80~85°C，恒溫回流反應(yīng)時(shí)間為4~6小 時(shí)。該溫度更有利于反應(yīng)的進(jìn)行，且用薄層層析檢測(cè)，4~6小時(shí)可反應(yīng)完全。
[0023] 優(yōu)選地，還包括以下步驟：
[0024]B、反應(yīng)結(jié)束后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH終止反應(yīng)；
[0025] C、向反應(yīng)液中加入乙酸乙酯，分離并用水洗、干燥有機(jī)相；
[0026] D、將干燥后的有機(jī)相去溶劑，過(guò)層析柱分離純化，最終得到純化后的淡黃色針狀 結(jié)晶體TBBPA半抗原2- (2, 6-二溴-4- (2- (3, 5-二溴-4-羥苯基）異丙酯））乙酸，即式I 化合物。TBBPA半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;恪點(diǎn)：167-170°C。
[0027] 優(yōu)選地，步驟B中，所述pH為2. 0~4. 0。偏酸性的溶液，有利于終止反應(yīng)，也防止 逆反應(yīng)的發(fā)生。
[0028] 優(yōu)選地，步驟D中，所述層析柱分離純化的薄層層析展開劑采用體積比為1:4的丙 酮和正己烷組成的混合溶液。由于半抗原是有機(jī)相物質(zhì)，本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)采用該展開劑更 利于半抗原的純化，使獲得的半抗原純度更高。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種多溴聯(lián)苯同系物半抗原的用途，用于痕量溴代阻燃劑TBBPA 的檢測(cè)。
[0030] 優(yōu)選地，所述痕量溴代阻燃劑TBBPA的檢測(cè)方法，包括將式I化合物通過(guò)碳化二亞 胺法、混合酸酐法或活化酯法與載體蛋白偶聯(lián)制備TBBPA人工全抗原。
[0031] 優(yōu)選地，所述TBBPA人工全抗原為TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA
或TBBPA人工包被原TBBPA-OVA
其中，BSA為牛血清蛋白， OVA為卵清白蛋白。
[0032] 本發(fā)明涉及一種多溴聯(lián)苯同系物半抗原及其制備方法，由于TBBPA是小分子物 質(zhì)，只具有反應(yīng)原性而沒(méi)有免疫原性，而且該分子上沒(méi)有能與蛋白質(zhì)分子直接結(jié)合的氨基、 羧基等官能團(tuán)，因此需要對(duì)TBBPA分子衍生化使其分子上帶上一個(gè)兩個(gè)碳鏈長(zhǎng)的羧基。為 了免疫分析方法的實(shí)現(xiàn)，用碳化二亞胺法或活化酯法或混合酸酐法將這個(gè)含羧基的半抗原 與蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)制備人工全抗原（包括人工免疫原和人工包被原），其中人工免疫原免 疫新西蘭大白兔，通過(guò)生物體內(nèi)的免疫應(yīng)答進(jìn)而制備得到抗TBBPA的特異性抗體，而人工 包被原和TBBPA都能與抗TBBPA特異性抗體免疫球蛋白IgG發(fā)生特異性識(shí)別的反應(yīng)，即人 工包被原和TBBPA是直接競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，從而建立免疫分析方法用于水體、土壤、大氣等環(huán)境 樣品和電子產(chǎn)品、紡織印染品、建筑裝潢等產(chǎn)品中痕量溴代阻燃劑四溴雙酚A的檢測(cè)。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0034] (1)半抗原實(shí)用性強(qiáng)：TBBPA半抗原制備和抗體制備具有重要的實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí) 意義。該半抗原保留了TBBPA的結(jié)構(gòu)，再利用碳化二亞胺法、活化酯法或混合酸酐法偶聯(lián)蛋 白質(zhì)使其具有針對(duì)TBBPA的抗原決定簇，可成功制備TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA或TBBPA 人工包被原TBBPA-0VA，為制備特異性好、效價(jià)高的抗體和建立免疫PCR生物條形碼方法提 供了保障。
[0035] (2)半抗原穩(wěn)定性好：本發(fā)明首次制備獲得了TBBPA半抗原，且此法合成的TBBPA 半抗原結(jié)構(gòu)具有較好的穩(wěn)定性，在室溫狀態(tài)下可保存多年，幾乎不會(huì)失效。
[0036] (3)半抗原制備技術(shù)簡(jiǎn)便可行：半抗原的整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需特別的儀器設(shè)備，成 本低廉，且制備速度快，產(chǎn)率高，容易工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0038] 圖1為TBBPA的紅外光譜圖；
[0039] 圖2為TBBPA半抗原的紅外光譜圖；
[0040] 圖3為TBBPA半抗原的核磁共振譜圖；
[0041] 圖4為TBBPA半抗原TBBPA-hapten、載體蛋白BSA和人工全抗原TBBPA-BSA的紫 外光譜圖；
[0042] 圖5為TBBPA半抗原TBBPA-hapten、載體蛋白0VA和人工全抗原TBBPA-0VA的紫 外光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0044]實(shí)施例1多溴聯(lián)苯半抗原的制備
[0045]稱取 2g(3. 677mmol)TBBPA和 0? 294g(7. 354mmol)氫氧化鈉溶解在 8mLN,N-二甲 基甲酰胺中，逐漸升溫到80°C。稱取0. 5109g