抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種siRNA序列，具體為一種抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA序列，能抑制腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的遷移，是很好的治療腫瘤的藥物。
【專利說明】抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA
[0001]本申請是“一種抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA及其應(yīng)用”的分案申請，原申請的申請日為2010年11月24日，申請?zhí)枮?201010575237.4。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及siRNA雙鏈序列及其應(yīng)用，尤其是抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA及其抗腫瘤應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]RNAi是一種在生物體細胞內(nèi)，由特異的內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (doublestranded RNA, dsRNA)誘發(fā)其同源mRNA降解的基因沉默機制。RNAi現(xiàn)象是一種進化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機制。將與靶基因mRNA存在同源互補序列的dsRNA導入細胞后，能特異性地降解該mRNA，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。RNAi首先由Fire等發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中，他們發(fā)現(xiàn)將dsRNA注入線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達，并證實這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后，所以又將RNAi稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGSKFire etal.，1998，F(xiàn)EBS Lett.2007Jul]。RNAi廣泛存在于生物界，從低等原核生物，到植物、真菌、無脊椎動物，甚至哺乳動物。研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細胞，最有效的是21~23個堿基大小，3’端有兩個突出堿基的siRNA。RNAi是dsRNA介導的轉(zhuǎn)錄后沉默，具有強大的細胞穿透能力，可在不同細胞間長距離傳遞和維持。RNAi效應(yīng)具有兩個明顯的特征，特異性和高效性。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。因此，有效的RNAi依賴于siRNA的準確設(shè)計。siRNA的基因沉默效應(yīng)取決于其靶基因序列的選擇，任一堿基的錯配都會導致RNAi效率減弱甚至喪失，這種高度的序列特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因沉默具有明顯的藥理作用。siRNA主要通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射以及質(zhì)粒、病毒載體導入。RNAi技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)超過10年，其在腫瘤中的研究也已經(jīng)展開，RNAi的靶基因包括癌基因、甲基化相關(guān)基因、旁分泌/自分泌環(huán)、抗凋亡基因、血管形成相關(guān)基因、組織基質(zhì)金屬蛋白酶家族、細胞周期調(diào)控相關(guān)基因、癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、多藥耐藥相關(guān)基因等[Phalon et al.Expert Rev Mol Med.2010Augl8; 12:e26;Vazquez-Vega et al.Rev Invest Clin.2010;62(I):81-90]?
[0004]Hmga2是人Hmga基因家族的3個主要成員之一。HMGA蛋白家族是一類以AT-hooks的高度保守的DNA結(jié)合基序和一個酸性拖尾為特征的小分子非組蛋白染色體蛋白。它們通過識別特定的DNA結(jié)構(gòu)而不是一種特異的核苷酸序列來優(yōu)先地結(jié)合到DNA中AT豐富的小溝內(nèi)。由于HMGA蛋白家族具有通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)而調(diào)節(jié)很多目的基因表達的能力，使其通常被認為是結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子[Reeveset al.Environ Health Perspect, 2000,108(Suppl5):803-809]。HMGA參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、胚胎形成、分化、致瘤性轉(zhuǎn)化、病毒基因組的整合和表達等不同的生物學過程。
[0005]人的Hmga2基因位于12號染色體的ql5區(qū),5個外顯子的跨度接近160kb,蛋白結(jié)構(gòu)由109個氨基酸組成，其中外顯子1、2、3編碼的序列中各含一個AT hook。外顯子4和5分別編碼連接區(qū)和酸性區(qū)。這三個堿性八肽的DNA結(jié)合基序都能與DNA分子小溝內(nèi)的AT豐富區(qū)結(jié)合，因而稱為AT hook,其核心結(jié)構(gòu)是BBXRGRXB (B代表堿性氨基酸K或R，X是甘氨酸或脯氨酸)。其中基序中間的保守RGR序列在HMGA2與DNA結(jié)合中至關(guān)重要。盡管單個DNA結(jié)合基序的結(jié)合特異性不高，但是如果結(jié)合其上的DNA存在間隔一定序列的AT豐富區(qū)，則由于多個基序與一個DNA分子結(jié)合而使親和力大大提高。
[0006]HMGA2在正常生理活動中發(fā)揮著重要作用，當它出現(xiàn)異常時，就會導致疾病發(fā)生。1985年，在被病毒轉(zhuǎn)化的大鼠甲狀腺細胞株中，Giancotti發(fā)現(xiàn)了 HMGA2，并首次將它與腫瘤聯(lián)系起來[Giancotti et al.Cancer Res, 1985,45 (12Ptl):6051-6057]。后期研究認為，HMGA2基因重排產(chǎn)生的突變蛋白與良性腫瘤有關(guān)，如脂肪瘤、肺部軟骨錯構(gòu)瘤、多形性腺瘤、子宮平滑肌瘤；而全長蛋白過表達與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Hmga2在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病等大多數(shù)惡性腫瘤中均過表達，HMGA2蛋白的含量與腫瘤的進展相關(guān)。Hmga2是最近國內(nèi)外研究較多的一個基因，除了在多種腫瘤中過度表達外，還與--!分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等腫瘤事件息息相關(guān)，并被認為在表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中起到重要作用。它可以調(diào)控包括 Snaill、Snail2、Twist、Id2 等蛋白的轉(zhuǎn)錄從而影響 EMT 進程[Thuault et al.J CellBiol, 2006，174(2):175-183]。
[0007]目前，針對HMGA2的研究逐漸增多，HMGA2參與多個與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生理病理過程，因此，HMGA2有望成為腫瘤治療的一個新靶點。針對Hmga2展開治療的主要手段有反義核苷酸和RNAi干擾技術(shù)。Pentimalli等用腺病毒攜帶HMGA2反義核苷酸進入高分化脂肪肉瘤細胞，能夠引起HMGA2陽性細胞的生長抑制，并誘導其凋亡，但對HMGA2陰性的癌細胞則沒有相應(yīng)作用[Pentimalli et al.Cancer Res, 2003,63 (21):7423-7427.]。Malek等用siRNA沉默HMGA 2 (1146-1164)，能夠?qū)е侣殉舶┘毎曛芷谧铚c凋亡，還能夠抑制0vcar-3細胞在小鼠體內(nèi)移植瘤的生長[Malek et al.1nt J Cancer, 2008,123 (2):348-356.]。siRNA還被用于沉默胚胎干細胞中Hmga2基因的表達。此外，HMGA23’UTR具有眾多的microRNA結(jié)合位點，特別是7個保守的Let_7結(jié)合位點，為針對HMGA2的microRNA藥物開發(fā)提供了合適的靶點。Yu等就使用let-7來抑制HMGA2，從而抑制乳腺癌的發(fā)生[Yuet al.Cell,2007，131(6):1109-1123]。
[0008]本發(fā)明設(shè)計提供了一組針對Hmga2基因的siRNA，通過篩選得到Hmga2siRNAl(990-1008)、Hmga2siRNA2 (1051-1069 )、Hmga2siRNA3 (1113-1131)三對新的有效 siRNA 序列。所說三對針對Hmga2的siRNA，不但能直接抑制多種腫瘤細胞的增殖，還有削弱內(nèi)皮細胞的增殖和遷移的能力。因此，本發(fā)明提供的三對新的有效siRNA可以從抗腫瘤本身和抗血管形成兩個方面發(fā)揮治療作用，具有廣譜抗腫瘤功效。本發(fā)明提供的所述三對針對Hmga2的siRNA，迄今為止尚未見有國內(nèi)外的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供了一種抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA及其應(yīng)用。三對siRNAl、2、3序列都能抑制腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的遷移，是很好的治療腫瘤的藥物。
[0010]為了達成上述目的，本發(fā)明的解決方案是:
[0011]一種抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA，該序列為下列序列中的任意一條或一條以上；[0012]SiRNAl:正義鏈 5’ -UGGCCACAACAAGUUGUUCtt-3，，
[0013]反義鏈 5’-GAACAACUUGUUGUGGCCAtt-3’ ；
[0014]siRNA2:正義鏈 5’ _AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt_3 ’，
[0015]反義鏈 5’-UUCUCCAGUGGCUUCUGCUtt-3’ ；
[0016]siRNA3:正義鏈 5’ -GGAGGAAACUGAAGAGACAtt-3，，
[0017]反義鏈 5’ -U⑶CUCUUCAGUUUCCUCCtt-3，。
[0018]一種抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA用于制造治療腫瘤的藥物。
[0019]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明針對Hmga2(NM_003483)基因設(shè)計了一組siRNA，篩選出三對siRNA序列可以抑制Hmga2基因和蛋白的表達。通過脂質(zhì)體將合成的siRNA轉(zhuǎn)入A549、NC1-H446、SPC-Al等腫瘤細胞株以及HUEVC、EVC-304血管內(nèi)皮細胞株，設(shè)立對照組。經(jīng)過MTT法檢測siRNA雙鏈對腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞生長的抑制，用Hoechst33258染色檢測siRNA對腫瘤細胞凋亡的影響，用RT-PCR驗證siRNA對Hmga2表達的抑制作用。通過血管內(nèi)皮細胞遷移實驗檢測siRNA對HUEVC和EVC304遷移能力的影響。結(jié)果表明:MTT顯示Hmga2三對siRNAl、2、3對腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的抑制作用與對照組相比，均有顯著性差異(Ρ〈0.05)，其中以Hmga2siRNA3的抑制作用最為明顯。RT-PCR證實，Hmga2siRNAl、
2、3對A549、NC1-H44、HUEVC中的Hmga2mRNA都具有明顯的抑制作用，其中，Hmga2siRNA3對NC1-H446中Hmga2mRNA的干擾作用最為明顯。細胞遷移實驗表明，Hmga2siRNAl、2、3都能抑制腫瘤細胞和血管內(nèi)皮 細胞的遷移。本發(fā)明提供的Hmga2siRNA不但能用于體外培養(yǎng)細胞的RNAi，同時也能用于體內(nèi)實驗，是很好的治療腫瘤的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明Hgma2siRNA3轉(zhuǎn)染入細胞的熒光照片；
[0021]其中:A-A549細胞；B-NCI_H446 ；C-SPC-AI
[0022]圖2為本發(fā)明Hmga2siRNA對A549細胞數(shù)量的影響形態(tài)學觀察(結(jié)晶紫染色)；
[0023]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0024]圖3為本發(fā)明Hmga2siRNA對NC1-H446細胞數(shù)量的影響形態(tài)學觀察；
[0025]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0026]圖4為本發(fā)明Hmga2siRNA對SPC-Al細胞數(shù)量的影響形態(tài)學觀察；
[0027]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0028]圖5為本發(fā)明Hmga2siRNAl、2、3對EVC-304細胞數(shù)量的影響形態(tài)學觀察(結(jié)晶紫染色)；
[0029]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0030]圖6為本發(fā)明Hmga2siRNA對HUEVC細胞數(shù)量的影響形態(tài)學觀察(結(jié)晶紫染色)；
[0031]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0032]圖7為本發(fā)明Hmga2siRNA對A549細胞增殖能力的影響；
[0033]其中:1-對照；2-siRNAI;3_siRNA2 ;4_siRNA3 ；
[0034]
E3 — 72h 國，—96h
[0035]圖8為本發(fā)明Hmga2siRNA對NC1-H446細胞增殖能力的影響(96h)；[0036]其中:l-siRNAl;2_siRNA2 ;3_siRNA3 ；4-對照
[0037]圖9為本發(fā)明Hmga2siRNA對SPC-A1細胞增殖能力的影響(96h)；
[0038]其中:1-siRNAl;2_siRNA2 ;3_siRNA3 ；4-對照
[0039]圖10為本發(fā)明Hmga2siRNA對EVC-304細胞增殖能力的影響(96h)；
[0040]其中:1-siRNAl;2_siRNA2 ;3_siRNA3 ；4-對照
[0041]圖11為本發(fā)明Hmga2siRNA對HUEVC細胞增殖能力的影響(96h)；
[0042]其中:1-siRNAl;2_siRNA2 ;3_siRNA3 ；4-對照
[0043]圖12為本發(fā)明Hmga2siRNA對A549腫瘤細胞遷移能力的影響；
[0044]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0045]圖13為本發(fā)明Hmga2siRNA對NC1-H446細胞遷移能力的影響；
[0046]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0047]圖14為本發(fā)明Hmga2siRNA對HUEVC血管內(nèi)皮細胞遷移能力的影響；
[0048]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0049]圖15為本發(fā)明Hmga2siRNA 對肺腺癌細胞系A(chǔ)549 (左)和NC1-H446 (右)Hmga2mRNA水平的影響；
[0050]其中:1-siRNAl;2_siRNA2 ;3_siRNA3 ；C-對照；A-Hmga2 ;B_18S RNA
[0051]圖16為本發(fā)明Hmga2siRNA3對血管內(nèi)皮細胞系HUEVC Hmga2mRNA水平的影響；
[0052]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
[0053]圖17為本發(fā)明Hmga2siRNA對EVC-304細胞小管形成能力的影響。
[0054]其中:A-對照；B-siRNAl;C_siRNA2 ;D_siRNA3
【具體實施方式】
[0055]實施例1
[0056]抑制Hmga2基因表達的siRNA設(shè)計
[0057]siRNA 米用 Clontech 公司軟件，
[0058](http: //bioinf0.clontech.com/rnaidesigner/)。人 Hmga2 (NM_003483)基因編石馬序列由 Entrez Gene (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/
[0059]entrez/query.(fcRi?db=Rene)查找獲得,輸入編碼區(qū)并選擇限定條件,得到目的序列后進行BLAST分析，確定無同源序列的siRNA作為目的序列。siRNA序列中的A、G、C、U分別表示腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和鳥嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸。陰性對照序列由上海吉瑪公司提供。篩選得到針對Hmag2基因的3對Hmga2siRNA以及對照siRNA如下:
[0060]Hmga2siRNA 處理 96h 后，細胞培養(yǎng)液中加入 10 μ 15mg/ml MTT，
[0061]Hmga2siRNAl 正義鏈5，-UGGCCACAACAA⑶UGUUCtt-3，seq.1
[0062]反義鏈5’-GAACAACUUGUUGUGGCCAtt-3，seq.2
[0063]Hmga2siRNA2 正義鏈5，-AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt-3’ seq.3
[0064]反義鏈5’-UUCUCCAGUGGCUUCUGCUtt-3，seq.4
[0065]Hmga2siRNA3 正義鏈5，-GGAGGAAACUGAAGAGACAtt-3J seq.5
[0066]反義鏈5’-U⑶CUCUUCAGUUUCCUCCtt-3，seq.6[0067]Control siRNA 正義鏈5，_UUCUCCGAACGUGUCACGUtt_3，seq.7
[0068]反義鏈5，-ACGUGACACUGGCGGAGAAtt-3，seq.8
[0069]_
[0070]
[0071]繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μ I DMSO,震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標儀490nm處測OD值，以630nm作為參比波長，按下列公式計算相對增殖率。
[0072]
【權(quán)利要求】
1.抑制Hmga2基因表達的雙鏈siRNA，其特征是:其核苷酸序列如下:siRNA3:正義鏈 5’ -GGAGGAAACUGAAGAGACAtt-3’，
反義鏈 5’ -UG UCUCUUCAGUUUCCUCCtt-3’。
【文檔編號】C12N15/113GK103540593SQ201310200575
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月24日
【發(fā)明者】王啟釗, 刁勇, 許瑞安 申請人:華僑大學