植物低磷應(yīng)答調(diào)控單元及表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了一種植物低磷應(yīng)答調(diào)控單元PSS(PHR1-35S-SIZ1)表達(dá)載體pX6-PHR1-35S-SIZ1的構(gòu)建技術(shù)。該表達(dá)載體的構(gòu)建方法是，從擬南芥中克隆得到SIZ1基因，將35S啟動子插入到SIZ1基因的上游，構(gòu)建35S-SIZ1表達(dá)單元，將該表達(dá)單元插入植物表達(dá)載體pX6，構(gòu)建載體pX6-35S-SIZ1，再將PHR1基因插入該載體中，得到表達(dá)載體pX6-PHR1-35S-SIZ1。用表達(dá)載體pX6-PHR1-35S-SIZ1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，得到同時含有PHR1基因和SIZ1基因的工程農(nóng)桿菌菌株NK-314。
【專利說明】植物低磷應(yīng)答調(diào)控單元及表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物低磷應(yīng)答調(diào)控單元及表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)，屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]磷元素是植物生長發(fā)育不可或缺的營養(yǎng)元素之一，它不僅是生物體內(nèi)ATP、核酸、磷脂分子的組成成分，而且在能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。但是，磷主要以h2po4_和hpo42_可溶的形式被植物吸收，這部分磷元素被稱為“有效磷”。在土壤中，雖然磷元素含量較高，但大部分磷元素被Ca2+、Fe2+、Al3+固定或以有機(jī)態(tài)磷形式存在，無法被植物直接吸收利用，從而造成土壤速效磷匱乏(Smith F ff, Mudge S R, Rae A L, etal.Phosphate transport in plants.Plant and Soil,2003,248 (1-2):71-83)。
[0003]PHRl是一類保守的MYB類轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合到一些磷饑餓應(yīng)答基因(如AtIPSl, AtRNSl)的啟動子上促進(jìn)這些基因的表達(dá)，在植物低磷適應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮中心作用。Franco-Zorrilla等研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥中，PHRl可以通過與磷轉(zhuǎn)運蛋白Phtl家族基因啟動子上的PIBS相互作用，調(diào)節(jié)其表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)植物對磷的吸收和轉(zhuǎn)運能力。Schunmann等分析了大麥磷轉(zhuǎn)運蛋白Phtl-1啟動子序列，發(fā)現(xiàn)其中的PIBS序列發(fā)生突變后，低磷脅迫對Phtl-1的誘導(dǎo)作用明顯減弱，這表明PHRl在Phtl-1的誘導(dǎo)表達(dá)中起著重要的作用。Bari等發(fā)現(xiàn)在擬南芥phrl突變體中，miRNA399的表達(dá)在低磷環(huán)境下受到明顯的抑制,揭示了 PHR1、miRNA399和PH02/UBC之間存在著相互關(guān)系。綜上所述，PHRl可以通過直接或間接的作用調(diào)控一些磷轉(zhuǎn)運蛋白和磷饑餓應(yīng)答基因的表達(dá)，以促進(jìn)植物對磷的吸收利用(Schunmann PHD, Richardson A E, Vickers C E, et al.Promoter analysis of thebarley Phtl ；lphosphate transporter gene identifies reg1ns controlling rootexpress1n and responsiveness to phosphate deprivat1n.Plant Phys1logy,2004,136(4):4205-4214 ；Bari R,Pant B D,Stitt M,et al.PH02,microRNA399,and PHRldefinea phosphate-signaling pathway in plants.Plant Phys1logy,2006,141 (3):988-999)。
[0004] 近年來的研究表明，SIZl對植物的低磷適應(yīng)也具有重要的調(diào)節(jié)作用。在磷饑餓的情況下，SIZl可以使PHR1SUM0化來提高PHRl的活性，更進(jìn)一步提高植物對磷的利用效率。研究發(fā)現(xiàn)，PHRl有兩個類泛素化修飾位點，有研究者在體外將T7-PHR1與酵母的ScAosl (El)、ScUb2 (El)、ScUbc9 (E2)、ScSmt (SUMO)和擬南芥的 SIZl (E3)組成的混合物進(jìn)行反應(yīng)，然后利用抗T7的抗體檢測到PHRl被SUMO化修飾，但類泛素化位點突變的PHRl被檢測到無SUMO化修飾，表明PHRl可以直接被SIZI識別和修飾，在植物的磷調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，SIZl位于PHRl的上游，通過調(diào)節(jié)PHRl的活性來調(diào)節(jié)下游與磷饑餓應(yīng)答有關(guān)的基因的表達(dá)。Duan等研究證明，在擬南芥sizl突變體中，PHRl的下游基因SPX1、SPX2的表達(dá)都明顯下降(Duan K,Yi K K,Dang L,et al.Characterizat1n of a sub-family of Arabidopsisgenes with the SPX domain reveals their diverse funct1ns in plant tolerance tophosphorus starvat1n.Plant Journal,2008,54 (6):965-975)。
[0005]鑒于SIZl和PHRl對植物低磷應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用以及它們之間的相互作用，本發(fā)明通過將PHRl基因和SIZl基因串聯(lián)構(gòu)建成一個獨立的調(diào)控單元插入表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化植物，實現(xiàn)其在植物體內(nèi)的表達(dá)，提高植物體內(nèi)PHRl的含量并通過SIZl提高PHRl的活性，從而提高植物對磷的利用效率。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)將PHRl基因和SIZl基因作為獨立調(diào)控單元構(gòu)建于同一載體轉(zhuǎn)化植物以提高植物磷吸收利用效率的文獻(xiàn)和專利報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是:
[0007]I)克隆擬南芥中的SUMO化E3連接酶SIZl基因。
[0008]2)構(gòu)建含有PHRl基因和SIZl基因的低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體。
[0009]3)構(gòu)建一種含有低磷應(yīng)答調(diào)控單元的植物表達(dá)載體和攜帶該載體的農(nóng)桿菌。
[0010]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0011]首先，本發(fā)明從擬南芥中克隆得到SUMO化E3連接酶基因SIZ1。
[0012]本發(fā)明提供的SIZl基因的編碼序列總長2658bp，編碼885個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由三個結(jié)構(gòu)域組成，分別是N端的PINIT結(jié)構(gòu)域，中部含有鋅離子的SP-RING結(jié)構(gòu)域和C端的SP-CTD結(jié)構(gòu)域。
[0013]SIZl基因的克隆過程:
[0014]根據(jù)AtSIZl基因序列設(shè)計上下游引物，提取擬南芥總RNA，運用RT-PCR的方法克隆得到預(yù)期片段，插入克隆載體PMD19-T simple vector中構(gòu)建載體pMD19-T_SIZl，測序正確。
[0015]其次，本發(fā)明提供了一個低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含一個SUMO化E3連接酶基因SIZl和一個保守的MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因PHRl。
[0016]在本發(fā)明提供的低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體中，所述的PHRl基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子PHRl在低磷脅迫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著中心調(diào)節(jié)的作用，可以通過多種途徑增強(qiáng)植物對磷的轉(zhuǎn)運和吸收；所述的SIZl基因編碼的蛋白SIZl能夠SUMO化PHRl，提高PHRl的活性。因此，該低磷應(yīng)答調(diào)控單元可以更進(jìn)一步的提高植物對磷的吸收利用效率。
[0017]低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體構(gòu)建過程:
[0018]運用PCR的方法克隆得到35S啟動子并插入克隆載體pMD19_T simple vector中，構(gòu)建載體PMD19-T-35S，通過酶切將35S啟動子插入pMD19_T_SIZl載體中，構(gòu)建克隆載體PMD19-T-35S-SIZ1。再將克隆載體pMD19_35S_SIZl中的35S-SIZ1片段用Spe I單酶切回收后插入植物表達(dá)載體PX6中，構(gòu)建植物表達(dá)載體pX6-35S-SIZl，PCR和酶切鑒定其插入正反向；最后，將植物表達(dá)載體PX6-PHR1載體中的PHRl基因用Asc I單酶切回收后插入植物表達(dá)載體PX6-35S-SIZ1中，構(gòu)建植物表達(dá)載體pX6-PHRl-35S-SIZl，PCR和酶切鑒定其插入正反向，構(gòu)建得到低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1。
[0019]第三方面，本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌工程菌株NK-314，該菌株是用植物低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后獲得的工程菌株。
[0020]本發(fā)明的有益效果:
[0021]構(gòu)建的植物低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1能夠在植物體內(nèi)過表達(dá)SIZl和PHRl，提高植物體內(nèi)PHRl的含量并通過SIZl提高PHRl的活性，從而提高植物對磷的利用效率，可以減少磷肥的使用，降低資源的浪費和環(huán)境污染，具有很大的應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1低磷應(yīng)答調(diào)控單元植物表達(dá)載體pX6-PHRl-35S-SIZl的構(gòu)建流程。
[0023]圖2SIZ1基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。泳道M:1kb DNA ladder ;泳道1、2:PCR產(chǎn)物；泳道3:陰性對照。
[0024]圖335S啟動子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。泳道1、2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道]?:200bpDNA ladder。
[0025]圖4載體pMD19-T-35S-SIZl的鑒定結(jié)果。A35S啟動子PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。泳道M:200bp DNA ladder ;泳道1-5:PCR產(chǎn)物;泳道6:陽性對照;泳道7:陰性對照。BSpe I單酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果。泳道M:lkb DNAladder ;泳道1:酶切產(chǎn)物；泳道2:質(zhì)粒對照。
[0026]圖5載體pMD19-T-35S-SIZl中35S啟動子插入正反向的鑒定結(jié)果。A Nco I和Spe I雙酶切電泳結(jié)果。泳道M:200bp DNA ladder ;泳道1、3:酶切產(chǎn)物；泳道2、4:質(zhì)粒對照。B35S插入正反向的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(35S上游引物和SIZl基因下游引物)。泳道M:1kb DNA ladder ;泳道 1:PCR 產(chǎn)物。
[0027]圖6pX6-35S-SIZl 重組子的鑒定結(jié)果。泳道 M:200bp DNA ladder ;泳道 1-6:PCR產(chǎn)物；泳道7:陰性對照；泳道8:陽性對照。
[0028]圖7pX6-35S_SIZl中35S-SIZ1片段插入正反向的鑒定結(jié)果(Asc I和Nco I雙酶切)。泳道M:200bp DNA ladder ;泳道1、3、5、7:雙酶切產(chǎn)物；泳道2、4、6、8:質(zhì)粒對照。
[0029]圖8pX6-PHRl-35S_SIZl重組子的鑒定結(jié)果。A PCR鑒定電泳檢測結(jié)果。泳道M:1kbDNA ladder ;泳道1:陽性對照；泳道2:陰性對照；泳道3-6:PCR產(chǎn)物。B AscI酶切鑒定電泳檢測結(jié)果。泳道M:lkb DNA ladder ;泳道1、3、5、8:酶切產(chǎn)物；泳道2、3、6、7:質(zhì)粒對照。
[0030]圖9載體pX6-PHRl-35S-SIZl中PHRl基因插入正反向的鑒定結(jié)果。泳道M:1kbDNA ladder ;泳道1-4:PCR產(chǎn)物；泳道5:陰性對照。
[0031]圖10pX6-PHRl-35S-SIZl 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101 的 PCR 鑒定結(jié)果。泳道 M:lkb DNAladder ;泳道 1、2:PCR 產(chǎn)物。

【具體實施方式】
[0032]實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆手冊中所述的條件，或按照具體制造廠商所建議的條件。
[0033]實施例1
[0034]擬南芥SIZl基因的克隆。包括如下步驟:
[0035](I)用TRIZOL試劑法提取擬南芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA。
[0036](2)以cDNA為模板PCR克隆得到SIZl基因(圖2)，將其克隆到pMD19_T simplevector，構(gòu)建載體pMD19-T-SIZl進(jìn)行測序，測序正確。PCR所用引物是根據(jù)擬南芥AtSIZl基因序列設(shè)計的:
[0037]Pl:5, ~GAATTCATGGATTTGGAAGCTAATTGTAAGGAAAAAC~3/
[0038]P2:5/ ~ACTAGTCAAATCTTGTTTAAACTCCGGTGTCT~3/
[0039]上游引物PI添加EcoR I酶切位點，下游引物P2添加Spe I酶切位點，均用下劃線表示。
[0040]實施例2
[0041]一種低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)植物載體的構(gòu)建。包括如下步驟:
[0042](l)pMD19-T_35S 載體的構(gòu)建。
[0043]將35S 啟動子(圖 3)克隆到 pMD19-T simple vector 中，構(gòu)建載體 pMD19_T_35S。所用的PCR引物是根據(jù)35S啟動子的DNA序列設(shè)計的:
[0044]P3:5/ -GAATTCACTAGTCCCACAGATGGTTAG-3'
[0045]P4:5/ -GAATTCCGTGTTCTCTCCAAATGAAAT-3'
[0046]上游引物P3添加EcoR I和Spe I酶切位點，下游引物P4添加EcoR I酶切位點，均用下劃線表示。
[0047](2)pMD19-T-35S-SIZl 載體的構(gòu)建。
[0048]以pMD19-T-SIZ l為基本載體，將35S啟動子從載體pMD19_T_35S中用EcoR I單酶切后回收，插入載體PMD19-T-SIZ1中，進(jìn)行PCR和酶切鑒定(圖4)及其插入正反向的鑒定(圖 5)，構(gòu)建載體 pMD19-T-35S-SIZl。
[0049](3)pX6-35S_SIZl 載體的構(gòu)建。
[0050]用Spe I 單酶切載體 pMD19-T-35S-SIZl 得到 35S-SIZ1 片段，將 35S-SIZ1 片段插入植物表達(dá)載體PX6中，進(jìn)行PCR鑒定(圖6)及其插入正反向的鑒定(圖7)，構(gòu)建植物表達(dá)載體 PX6-35S-SIZ1。
[0051](4)pX6-PHRl-35S-SIZl 載體的構(gòu)建。
[0052]用Asc I單酶切得到PHRl基因，將PHRl基因插入植物表達(dá)載體pX6-35S-SIZl中，進(jìn)行PCR和酶切鑒定(圖8)及其插入正反向的鑒定(圖9)，構(gòu)建植物表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1。即為本發(fā)明所述的低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體。
[0053]將上述表達(dá)載體pX6-PHRl-35S-SIZl轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，構(gòu)建同時含有SIZl基因和PHRl基因的工程菌株NK-314。從工程農(nóng)桿菌中提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定(圖10)。
【權(quán)利要求】
1.一種羽扇豆中編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因PHR1，其特征在于，能夠編碼調(diào)節(jié)植物磷饑餓應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，該基因總長1230bp，編碼409個氨基酸。
2.一種擬南芥中編碼類泛素化(SUMO) E3連接酶的基因SIZl，其特征在于，能夠SUMO化PHRl，提高PHRl的活性，從而更進(jìn)一步提高PHRl對磷饑餓應(yīng)答因子的調(diào)節(jié)作用，該基因總長2658bp，編碼885個氨基酸。
3.一種低磷應(yīng)答調(diào)控單元表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體包含SIZl基因和PHRl基因，具體是指抗生素選擇標(biāo)記刪除型植物表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1。
4.一種工程農(nóng)桿菌菌株，其特征在于，是將植物表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101所獲得的工程農(nóng)桿菌菌株NK-314。
5.一種含有植物表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1的工程農(nóng)桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，通過PCR擴(kuò)增和酶切連接的方法獲得SIZl基因和PHRl基因，將其依次克隆到pX6質(zhì)粒中構(gòu)建植物表達(dá)載體PX6-PHR1-35S-SIZ1，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。
6.一種如權(quán)利要求4所述工程農(nóng)桿菌菌株的用途，其特征在于，用其轉(zhuǎn)化不同植物可獲得能高效利用土壤中磷元 素的轉(zhuǎn)基因植物。
【文檔編號】C12N15/52GK104178496SQ201310200002
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月27日
【發(fā)明者】李明剛, 郝軍鳳, 喬坤艷, 馬超, 馬百成, 王宇, 李寵, 張耀方, 馬志華, 姬艷麗, 董震, 屠培培, 李曉丹 申請人:南開大學(xué)