帶報告基因的bac-oc43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構建及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明為帶報告基因的BAC-OC43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構建及應用。所屬【技術領域】為1.分子生物學2.病毒學。更具體涉及一種攜帶綠色熒光蛋白的BAC-OC43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構建方法及應用。通過該方法，我們可以快速準確的對OC43基因組進行改造，同時也能方便的對病毒進行半定量分析，為深入研究該病毒的復制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗奠定了基礎。
【專利說明】帶報告基因的BAC-0C43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構建及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學和病毒學領域。更具體涉及一種攜帶綠色熒光蛋白的BAC-0C43冠狀病毒載體系統(tǒng)的構建方法及應用。通過該方法，我們可以快速準確的對0C43基因組進行改造，同時也能方便的對病毒進行半定量分析，為深入研究該病毒的復制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗奠定了基礎。
【背景技術】
[0002]冠狀病毒屬于巢狀病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，因電鏡下病毒顆粒形似王冠而得名。冠狀病毒是病毒界的一個大家族，能感染從哺乳動物到禽類等一大批脊椎動物。根據(jù)國際病毒分類學委員會的最新規(guī)定，冠狀病毒分為α、β、Y和δ 4組，分別對應I組、2組和3組冠狀病毒和新假定的一個屬。α冠狀病毒組包括人冠狀病毒229E(HCoV-229E)、NL63 (HCoV-NL63)以及一些動物冠狀病毒如豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissiblegastroenteritis virus, TGEV)和犬冠狀病毒(canine coronavirus, CCoV)等；β 冠狀病毒包括人冠狀病毒0C43、SARS> HKul以及新近發(fā)現(xiàn)的HCoV-EMC等人冠狀病毒，還包括鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus, MHV)和牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)等動物冠狀病毒；Y冠狀病毒組包括禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitisvirus, IBV)和火雞冠狀病毒(turkey Coronavirus, TCoV)等。表皮細胞是冠狀病毒感染的主要靶細胞，巨噬細胞等分布廣泛的細胞也可被感染。冠狀病毒的宿主范圍相對比較局限，只感染它們的天然宿主以及密切相關的宿主。冠狀病毒主要與呼吸道、腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及肝臟疾病有關，具有胃腸道、呼吸道或神經(jīng)系統(tǒng)嗜性。冠狀病毒感染人體后，還與胃腸炎、上呼吸道和下呼吸道感染有關。
[0003]1981年，Racaniello和Baltimore將包含脊髓灰質(zhì)炎病毒全長cDNA的質(zhì)粒DNA轉染宿主細胞，成功構建了首個RNA病毒的全長cDNA克?。浑S后，該技術得到了廣泛的應用和發(fā)展，獲得了許多RNA病毒的感染性克隆，包括正鏈和負鏈RNA病毒、分節(jié)段的和不分節(jié)段的RNA病毒。獲得cDNA感染性克隆后`，可以在DNA水平上通過突變、插入、缺失和互補等手段研究RNA病毒，具有非常廣泛的應用前景。冠狀病毒龐大的基因組以及攜帶其復制酶序列的質(zhì)粒在細菌中的不穩(wěn)定性長期阻礙了冠狀病毒反向遺傳學的發(fā)展，直到2000年Almazan等首次利用D1-RNA和BAC質(zhì)粒系統(tǒng)成功構建了 TGEV的全長cDNA感染性克隆。此后，通過體外將全場cDNA克隆到BAC載體、體外連接覆蓋基因組全長的cDNA以及痘苗病毒載體等相繼獲得多個冠狀病毒的感染性克隆。冠狀病毒感染性克隆的構建成功為我們研究冠狀病毒蛋白和基因組功能、致病機理、毒力關鍵位點、病毒載體的開發(fā)提供了一個非常好的平臺。
[0004]相對其他病毒載體，冠狀病毒載體有獨特的優(yōu)勢:(I)冠狀病毒為單股正鏈RNA病毒，復制過程發(fā)生在細胞質(zhì)內(nèi)，并且不經(jīng)過DNA中間過程，避免了病毒基因組與宿主細胞DNA的整合。(2)冠狀病毒作為目前已知的最大的RNA病毒，有足夠的空間來容納較大的外源基因。(3)冠狀病毒主要感染呼吸道和腸道粘膜表面，能刺激腸相關淋巴組織誘導多效的分泌型免疫反應。(4)通過對冠狀病毒S蛋白基因的操作可以改變其組織嗜性，從而對載體的組織嗜性進行改造。(5)我們可以獲得能夠感染多數(shù)我們感興趣的物種的非病原株來開發(fā)表達系統(tǒng)；同時還可以獲得冠狀病毒的感染性cDNA克隆來設計表達系統(tǒng)。(6)我們可以獲得能夠感染多數(shù)我們感興趣的物種的非致病性的冠狀病毒株以及感染性cDNA克隆來設計表達系統(tǒng)。(7)基于冠狀病毒獨特的非連續(xù)轉錄模式，理論上只要將合適的TRS (轉錄調(diào)節(jié)序列)和外源基因一起插入病毒基因組就可以表達。目前，已經(jīng)開發(fā)出了兩類基于冠狀病毒的表達載體，即輔助病毒依賴的表達載體系統(tǒng)和單基因組表達載體系統(tǒng)。輔助病毒依賴的表達載體系統(tǒng)主要包括兩個部分:輔助病毒以及攜帶外源基因的微型基因組。首先通過對D1-RNA的改造，然后轉染感染有輔助病毒的細胞，在輔助病毒的作用下，D1-RNA得以轉錄、表達。利用該系統(tǒng)，研究者們成功表達了 β_葡萄糖醒酸酶(β-glucuronidase,⑶S)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV的0RF5 (PRRSV主要的保護性抗原)。輔助病毒依賴的表達載體系統(tǒng)在穩(wěn)定性方面有一定的局限性。比如表達HE蛋白的MHV D1-RNA系統(tǒng)只能穩(wěn)定傳代3次，基于TGEV的表達外源基因的微型基因組也只能穩(wěn)定傳代10次，同時該系統(tǒng)只能應用于能產(chǎn)生D1-RNA的冠狀病毒，如TGEV、229E、MHV、IBV等。
[0005]2006年，加拿大的一個研究團隊成功了構建了基于BAC系統(tǒng)的HCoV_0C43全長cDNA感染性克隆，為我們利用HCoV-0C43表達外源基因、研究基因功能打下了基礎。在該感染性克隆的基礎上，對HCoV-0C43基因組進行改造，構建一種能夠表達綠色熒光蛋白的重組HCoV-0C43病毒載體系統(tǒng)，為深入研究該病毒的復制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗奠定了基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶綠色熒光蛋白的BAC-0C43載體系統(tǒng)以及構建方法，具體步驟如下:
[0007](I)酶切位點的`選擇和引物設計所有HCoV-0C43相關的核酸序列均參考ATCC株(Genbank編號AY585228)。根據(jù)文獻報導，結合對HCoV_0C43基因組ORF的分析，選擇了 2個外源GFP基因的插入位點:取代NS2和NS12.9基因；然后根據(jù)插入位點，在其兩端選擇了兩個特異性的酶切位點用于攜帶GFP的外源片段的引入，如表1。然后根據(jù)選定的外源基因插入位點和酶切位點，設計引物分別擴增GFP以及插入位點與酶切位點之間的基因，用于后續(xù)的Overlapping PCR,如表2、表3所示。
[0008]表1酶切位點的選擇及位置
[0009]
功能酶切位點位置
取代 NS2Nrf18587
PmeI 23916取代 NS 12.9 SacII 24070_SanDI_29571_
[0010]表2GFP取代NS2引物列表
[0011]
【權利要求】
1.一種新型的BAC-0C43冠狀病毒載體系統(tǒng)，將帶報告基因的PBAC-0C43質(zhì)粒轉染宿主細胞后，凍融裂解細胞即可獲得能表達報告基因的重組病毒。
2.如權利要求1所述BAC-0C43病毒載體系統(tǒng)，其特征在于，利用HCoV_0C43重組病毒的復制表達外源基因。
3.如權利要求2所述BAC-0C43病毒載體系統(tǒng)，優(yōu)選HCoV_0C43基因組NS2和NS12.9基因位置作為外源基因插入位點，其他結構基因之間的合適位置亦可采用。
4.如權利要求3所述，其構建方法包括以下步驟: (1)外源基因插入位置的選擇 以GFP基因取代HCoV-0C43基因組的2個附屬基因:NS2和NS12.9。 (2)酶切位點的選擇和引物設計 所有HCoV-0C43相關的核酸序列均參考ATCC株(Genbank編號AY585228)。在選定外源基因插入位點后，在其兩端選擇了兩個特異性的酶切位點用于攜帶GFP的外源片段的引入，如表1 ;根據(jù)選定的外源基因插入位點和酶切位點，設計引物分別擴增GFP以及插入位點與酶切位點之間的基因，引物序列如表2、表3所示。 表1酶切位點的選擇及位置
5.如權利要求1所述，該病毒載體系統(tǒng)用于深入研究該病毒的復制機制、致病機理、感染譜以及開發(fā)新型疫苗。
【文檔編號】C12N7/01GK103805636SQ201310201244
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年5月28日 優(yōu)先權日:2013年5月28日
【發(fā)明者】譚文杰 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所