專利名稱：一種旋毛蟲重組蛋白及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，主要是旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因TsSerpin重組蛋白用于免疫診斷及疫苗研制，具體設計包括旋毛蟲基因TsSerpin的cDNA克隆及其在大腸桿菌BL21 (DE3)中的原核表達和反應原性的鑒定，并對TsSerpin進行分段克隆及原核表達和反應原性的鑒定表達，篩選反應原性比較好的片段用于免疫診斷。將重組蛋白用于小鼠免疫保護實驗，確定其免疫保護性。
背景技術：
旋毛蟲病(Trichinellois)是由旋毛蟲(7>icAi/ e77a spp.)引起的一種危害嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病，可在包括人類在內(nèi)的150多種動物之間廣泛傳播，人主要因為生食或半生食含有旋毛蟲肌幼蟲包囊的肉品而感染，嚴重時可致人死亡。旋毛蟲病是一個非常重要的公共衛(wèi)生問題，不僅給人類健康造成威脅，而且給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。由于旋毛蟲病病原傳播途徑復雜，宿主地理分布廣泛，給該病的防制造成了極大的困難，至今仍然未得到有效的控制，而且流行范圍繼續(xù)擴大，已被列為再度肆虐的疾病。衛(wèi)生部2001 2004年的全國人體重要寄生蟲現(xiàn)狀調(diào)查資料顯示，在調(diào)查的旋毛蟲病流行區(qū)的10個省(區(qū)、市)中，旋毛蟲病血清陽性率為3.38%，但是西部地區(qū)的感染率要比東部地區(qū)高69.44%，該病已經(jīng)成為影響我國食品安全和人民健康的重要因素之一。旋毛蟲的抗原成份極其復雜，且不能進行體外的大量培養(yǎng)和繁殖，因此給該病的免疫診斷及預防帶來了困難。隨著分子生物學技術在寄生蟲病研究中的應用，基因重組抗原成了當前研究的焦點。目前通過基因工程方法獲得的旋毛蟲抗原主要有46 kDa、49 kDa、53 kDa等，其重組抗原具有反應原性，可以被感染動物血清識別，但在旋毛蟲感染早期診斷仍然不理想。解決診斷抗原的途徑之一就是篩選鑒定旋毛蟲不同發(fā)育時期的抗原表位進行融合表達以獲得特異、敏感的診斷抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服當前旋毛蟲病免疫診斷技術中的不足，即旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌(ES)抗原大量制備相對較難，從旋毛蟲肌幼蟲中獲得TsSerpin基因，對TsSerpin進行反應原性分析，并確定TsSerpin的抗原表位區(qū)域。同時對TsSerpin進行免疫診斷和保護性試驗研究，為旋毛蟲的診斷和預防奠定基礎。本發(fā)明提供 了旋毛蟲TsSerpin基因的原核表達、蛋白純化以及反應原性鑒定的方法，其特征在于，包括:
(1)設計引物——設計的TsSerpin表達引物分別為:上游引物SEQID Na 1:(5，-GGO 刈77TATGGAAACAGAAATTGCAA-3，斜體加黑部分為&oR I酶切位點);下游引物SEQ ID Na 2:5’ -CaTTG^TTAATTACCAGAAAA ACGTCCA-3 (斜體加黑部分為通ο I 酶切位點)；
(2)RT-PCR反應——以旋毛蟲肌幼蟲RNA為模板，進行RT-PCR擴增，PCR反應條件為反應條件為:94°C 5 min ；94°C I min，55°C I min，72°C I min，35 個循環(huán)；72°C 10 min。
(3)重組表達菌株的構建——將目的基因與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到萬.coliDH5a感受態(tài)細胞中，并進行鑒定陽性菌株。將陽性菌株送于測序公司測序，將測序正確的菌株提取質(zhì)粒，經(jīng)I和通ο I雙酶切后，純化酶切產(chǎn)物，將目的基因連接到pET30a表達載體上，轉(zhuǎn)化到萬.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取單個菌斑，提取質(zhì)粒，得到TsSerpin基因的陽性重組表達質(zhì)粒pET30a-TsSerpin。(4)重組表達質(zhì)粒pET30a_TsSerpin在大腸桿菌中的表達-取
pET30a-TsSerpin/BL21 (DE3)菌液加入到卡那霉素(100 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C，200 rpm過夜培養(yǎng)。第二天轉(zhuǎn)接至新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基(1:50)，繼續(xù)培養(yǎng)至0D_為0.6左右。在其它條件不變的前提下，分別在28°C、32°C、37°C和42°C等不同溫度誘導表達；同樣以0.1 mmol/L、0.3 mmol/L>0.5 mmol/L>0.8 mmol/L>1.0 mmol/L>1.2 mmol/L>1.5mmol/L IPTG誘導表達；收集誘導后I h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h及過夜表達菌液，最后通過SDS-PAGE鑒定表達產(chǎn)物，來確定該重組蛋白的最佳表達條件。(5)重組蛋白的純化——采用切膠后電洗脫法純化重組蛋白。并用紫外分光光度計測定蛋白含量。(6) Western-blot方法檢測重組表達蛋白反應原性-將純化的重組蛋白進行
SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以旋毛蟲感染豬血清(20000條肌幼蟲經(jīng)口感染160d)和健康豬血清中作為一抗、堿性磷酸酶標記羊抗豬IgG為二抗,進行Western-blot分析。(7)按照以上方法將旋毛蟲基因TsSerpin進行分段克隆表達，并進行反應原性的分析。(8)將有反應原性的TsSerpin重組蛋白和分段表達的TsSerpin重組蛋白分別命名為TsSerpinl和TsSerpin5。對TsSerpinl和TsSerpin5分別進行免疫診斷的研究。
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(9)將110只健康昆明小鼠隨機的分為四組，分別為TsSerPINl免疫組(30只)、TsSerPIN5免疫組(30只)、佐劑組(25只)和感染對照組(25只)。TsSerPINl免疫組用TsSerPINl重組蛋白(200 Pg/mL)加入等體積ISA206油佐劑乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2mL ；TsSerPIN5免疫組用TsSerPIN5重組蛋白(200 Pg/mL)加入等體積的ISA206油佐劑乳化后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL0佐劑組用PBS加入等體積的ISA206油佐劑乳化后每只小鼠腹腔注射0.2 mL。感染對照組用PBS代替免疫原直接進行腹腔注射，每只小鼠0.2 mL。各組均進行3次免疫注射，每周I次，第3次免疫后I周攻擊感染，每只小鼠經(jīng)口攻擊感染旋毛蟲肌幼蟲200條。其中TsSerPINl免疫組和TsSerPIN5免疫組各有10只小鼠作為免疫對照(即只進行免疫而不攻擊感染旋毛蟲)。本發(fā)明人以旋毛蟲為研究對象，從旋毛蟲肌幼蟲中克隆到旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因TsSerpin。完成了該基因全長序列的克隆及序列分析，并對其進行原核表達及反應原性的鑒定，同時對TsSerpin進行了分段克隆及原核表達和反應原性鑒定，并對反應原性較好的重組蛋白進行免疫診斷與免疫保護性的研究，以篩選鑒定旋毛蟲TsSerpin基因的抗原表位，獲得特異性，敏感性好的診斷用抗原及疫苗研制候選抗原，為旋毛蟲病的診斷和預防奠定基礎。本發(fā)明的優(yōu)點在于克隆到了旋毛蟲肌幼蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因TsSerpin，western-blot檢測結果顯示TsSerpin重組蛋白具有很好的反應原性,分段表達TsSerpin,western-blot檢測結果顯示TsSerpin5重組蛋白具有很好的反應原性,動物實驗證明該重組蛋白具有一定的保護性。選擇TsSerpin5重組蛋白做為旋毛蟲病的診斷抗原和疫苗研制候選抗原，為旋毛蟲基因重組抗原的研制奠定了基礎。


圖1 TsSerpin基因RT-PCR擴增產(chǎn)物，其中:
M:DNA分子質(zhì)量標準(DL2000) ；1:RT_PCR擴增產(chǎn)物；2:空白對照。圖2重組質(zhì)粒pET30a_TsSerpin的鑒定,其中:
M =DNA分子質(zhì)量標準(DL2000) ；1:重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；
2:pET30a空質(zhì)粒；3:pET30a空質(zhì)粒的雙酶切結果；4:pET30a-TsSerpin重組質(zhì)粒；5:pET30a-TsSerpin重組質(zhì)粒的雙酶切結果。圖3重組表達質(zhì)粒誘導表達產(chǎn)物定性分析的SDS-PAGE電泳結果，其中:
M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:未加誘導劑的菌體蛋白；2 =IPTG終濃度為1.0 mmol/L誘導4h的菌體蛋白；3:表達菌體裂解液的上清液；4:表達菌體裂解液2 mol/L尿素溶解沉淀；5:表達菌體裂解液2 mol/L尿素溶解沉淀；6:表達菌體裂解液8 mol/L尿素溶解沉淀。圖4純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳結果，其中:
M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:誘導表達產(chǎn)物；2:純化后的重組蛋白。圖5重組蛋白的Western-blot分析,其中:
M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:旋毛蟲感染豬血清；2:健康豬血清。圖6 TsSerpin基因片段PCR擴增產(chǎn)物的鑒定，其中:
M:DNA分子質(zhì)量標準DL2000 ；1:TsSerpinl號PCR擴增產(chǎn)物；2:TsSerpin2號PCR擴增產(chǎn)物；3 =TsSerpin 3 號 PCR 擴增產(chǎn)物；4:TsSerpin4 號 PCR 擴增產(chǎn)物；5:TsSerpin5 號 PCR擴增產(chǎn)物；6:空白對照。圖7 pET30a_TsSerpin5重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定，其中:
M =DNA分子質(zhì)量標準；1:PCR產(chǎn)物；2:pET30a空質(zhì)粒；3:pET30a空質(zhì)粒的雙酶切結果；4:pET30a-TsSerpin5 重組質(zhì)粒；5:pET30a-TsSerpin5 重組質(zhì)粒的I/Xho I 雙酶切結果O圖8 TsSerpin2、TsSerpin3 和 TsSerpin4 表達產(chǎn)物的 SDS-PAGE 電泳結果，其中: M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:1PTG終濃度為1.0 mmol/L誘導4 h的TsSerpin2菌體
蛋白；2:未加誘導劑的TsSerpin2菌體蛋白；3:1PTG終濃度為1.0 mmol/L誘導4h的TsSerpin3菌體蛋白；4:未加誘導劑的TsSerpin3菌體蛋白；5:IPTG終濃度為1.0 mmol/L誘導4h的TsSerpin4菌體蛋白；6:未加誘導劑的TsSerpin4菌體蛋白。

圖9 TsSerpin5表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳結果，其中:
M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:未加誘導劑的TsSerpin5菌體蛋白；2 =IPTG終濃度為1.0mmol/L誘導4 h的TsSerpin5菌體蛋白。圖10 TsSerpin重組菌體蛋白的Western-blot鑒定,其中:
I, 8:TsSerpinl 重組蛋白;2，9:TsSerpin2 重組蛋白；3，10:TsSerpin3 重組蛋白；4，11:TsSerpin4 重組蛋白；5，12:TsSerpin5 重組蛋白；6，13 =IPTG 誘導的 BL21 (DE3)菌液；7，14 =IPTG誘導的pET30a空載體菌液；1_7:旋毛蟲感染豬血清；8_14:健康豬血清。
圖11 ES抗原和TsSerpin5重組蛋白檢測感染200條旋毛蟲豬血清結果。圖12 ES抗原和TsSerpin5重組蛋白檢測感染2000條旋毛蟲豬血清結果。圖13 ES抗原和TsSerpin5重組蛋白檢測感染20000條旋毛蟲豬血清結果。
具體實施方式
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實施例1旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因TsSerpin的克隆 1.旋毛蟲總RNA的提取
用Trizol (invitrogen)提取,操作如下:
(1)將感染旋毛蟲35d后的小鼠剖殺，取骨骼肌攪碎，人工消化法回收旋毛蟲肌幼蟲，取新鮮的蟲體約100 mg，置于微型勻漿器中，同時加入ImL的Trizol，在冰浴中迅速超聲至無可見組織塊。(2)轉(zhuǎn)移液體至DEPC處理的微量離心管中，室溫靜置5 min ;加0.2 mL酚-氯仿抽提液，劇烈震蕩約15 S，室溫孵育2 3 min。(3)12 000Xg,4 °C離心15 min后，將上層液體轉(zhuǎn)至另一干凈離心管中，加入200μ L氯仿再抽提一次。(4)將抽提后的上層液體轉(zhuǎn)至干凈離心管中，加入500 μ L異丙醇，室溫靜置10min，吸去上清液體，加入I mL 75%乙醇洗滌、混勻樣品。(6) 7 500Xg,4 °C離心 5 min,徹底吸棄上清。(7)真空干燥 RNA沉淀5 min,用100 μ L無核酸酶水溶解RNA，置56 °C孵育10min后,進行反轉(zhuǎn)錄。 2.反轉(zhuǎn)錄
按照Roche公司的Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit,操作如下:(1)依次加入表I的試劑:
權利要求
1.TsSerpin重組蛋白的制備方法,其特征是: O從豬旋毛蟲肌幼蟲中提取總RNA ； 2)以Oligo(ClT)18Primer為引物，總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄； 3)用上述2)所得到的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用SEQID Na I和SEQ ID Na 2為引物進行PCR擴增，得到豬旋毛蟲TsSerpin基因； 4)將所得到的旋毛蟲TsSerpin基因與pMD18_T克隆載體連接，構建pMD18_TsSerpin重組質(zhì)粒； 5)測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)過AcoRI和通ο I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行純化后與載體pET30a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，構建原核表達重組質(zhì)粒pET30a_TsSerpin ； 6)將旋毛蟲pET30a-TsSerpin重組質(zhì)粒進行誘導表達； 7)對經(jīng)誘導表達的旋毛蟲TsSerpin重組蛋白進行純化處理。
2.權利要求1所述方法制備的TsSerpin重組蛋白。
3.權利要求2的TsSer·pin重組蛋白用于制備檢測旋毛蟲病的抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組蛋白的制備方法，特別是一種TsSerpin重組蛋白，以及這種蛋白和它的用途。本發(fā)明的TsSerpin重組蛋白的制備方法是以豬旋毛蟲肌幼蟲中提取總RNA為模板，以Oligo(dT)18Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄；再用上述所得到的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用SEQID№1和SEQID№2為引物進行PCR擴增，得到豬旋毛蟲TsSerpin基因；再經(jīng)構建重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化大腸桿菌等處理得到目標蛋白。本發(fā)明的重組蛋白可用于制備檢測旋毛蟲病的抗原。
文檔編號C12N15/70GK103243105SQ20131018405
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月19日 優(yōu)先權日2013年5月19日
發(fā)明者付寶權, 蓋文燕, 李文卉, 曲自剛, 謝志宙, 劉靜宜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所