專利名稱：一種針對結(jié)核病具有免疫原性的融合蛋白及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領域，尤其涉及一種針對結(jié)核病具有免疫原性的融合蛋白及其應用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(TB)是一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染，每年新出現(xiàn)結(jié)核病患者約800-1000萬，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約為200-300萬。目前我國患結(jié)核病人數(shù)居世界第二位，僅次于印度年發(fā)病人數(shù)約為130萬，是全球22個結(jié)核病流行嚴重的國家之一，同時也是全球27個耐多藥結(jié)核病流行嚴重的國家之一，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)每年達13萬，超過其它傳染病死亡人數(shù)的總和。因此結(jié)核病是我國重點控制的重大疾病之一。結(jié)核病的病原菌主要是分枝桿菌屬中的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,以下簡寫為M.tb)和牛分支桿菌(Mycobacterium bovis,以下簡寫為Mb)。分枝桿菌是一類典型的細胞內(nèi)寄生細菌，它在被宿主細胞吞噬后能長期存活于吞噬體，并以吞噬體作為自己的“避風港”，這就極大地限制了機體對它產(chǎn)生免疫應答的能力。當宿主感染分枝桿菌時，少部分的宿主會直接形成活動性結(jié)核病，而大部分的宿主則由于自身的免疫反應，迫使細菌進入一種休眠狀態(tài)，從而控制疾病的進一步發(fā)展。但是當處于潛伏感染狀態(tài)的宿主年老或者免疫能力下降時，細菌就會再度活化，繼而發(fā)展為活動性結(jié)核病。目前預防結(jié)核病唯一能用于臨床的疫苗是卡介苗(BCG)，而BCG由于其不能較好的為成人提供保護，其他新發(fā)展的結(jié)核病疫苗大多數(shù)都是基于結(jié)核菌感染早期表達抗體的預防性疫苗，由于這些疫苗選擇生長早期和對數(shù)生長期表達的抗原，不能誘導機體產(chǎn)生針對結(jié)核分枝桿菌休眠期(靜止生長期或低氧狀態(tài))表達的潛伏抗原的免疫應答。而潛伏感染狀態(tài)是結(jié)核病復發(fā)的主要來源，是結(jié)核不能被徹底清除的原因之一，針對這些潛伏抗原開發(fā)新型疫苗勢在必行。

根據(jù)數(shù)篇文獻的研究表明，DosR (Dormancy Survival Regulator)調(diào)控系統(tǒng)在分枝桿菌在由活化狀態(tài)轉(zhuǎn)向潛伏狀態(tài)的過程中起到了至關重要的作用。它能夠控制48個基因的誘導表達，而這些基因的表達是分枝桿菌在面對體內(nèi)低氧、CO、NO等條件時，適應并持留所必須的條件，Rv2626c就是DosR調(diào)控編碼的潛伏期抗原。目前尚無利用Rv2626c制備的結(jié)核病疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種具有結(jié)核病免疫原性的融合蛋白及其應用。本發(fā)明一方面提供了一種融合蛋白，為含有分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白。所述融合蛋白中，Ag85a的氨基酸序列為SEQ ID NO:1:
FSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGAo所述融合蛋白中，Rv2626c的氨基酸序列為SEQ ID N0:2:TTARDMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREHDIGALPIC ⑶ DDRLHGMLTDRDIVIKGLAAGLDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLNVMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARHLPEHAIVQFVKAICSPMALASo所述融合蛋白中，Ag85a蛋白和Rv2626c蛋白之間可選擇地含有連接肽。所述Ag85a蛋白可連接于Rv2626c蛋白的N端或C端，較佳的，連接于Rv2626c蛋白的N端。進一步的，所述融合蛋白還含有單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LL0。進一步的，所述融合蛋白為單 核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白。所述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的氨基酸序列為SEQ ID NO:3:KIMLVFITLILISLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVS⑶VELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEINYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEffffRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNSVDNPIE所述融合蛋白中，Ag85a蛋白和Rv2626c蛋白的融合蛋白插入于前述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的第37位和第38位氨基酸殘基(相當于野生型LLO的第37位和第52位氨基酸殘基)之間。進一步的，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:4:KIMLVFITLILISLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDffYQPACGKAGCQTYKffETFLTSELPGffLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGAGGGGSGGGGSTTARDIMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREHDIGALPICGDDDRLHGMLTDRDIVIKGLAAGLDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLNVMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARHLPEHAIVQFVKAICSPMALASEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERffNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVS⑶VELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEINYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEffffRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNSVDNPIE所述融合蛋白針對結(jié)核病具有較強的免疫原性。
本發(fā)明第二方面提供了一種多核苷酸，其編碼所述融合蛋白。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。本發(fā)明第三方面提供了一種載體，其含有所述多核苷酸。本領域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建所述載體。這些方法包括重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)等。可將編碼所述融合蛋白的DNA有效連接到載體中的多克隆位點上，以指導mRNA合成進而表達蛋白，或者用于同源重組。較佳的，所述載體為原核載體或穿梭質(zhì)粒，如原核載體PMD-20T、穿梭質(zhì)粒pKSV7等。本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細胞，其被所述載體所轉(zhuǎn)化。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門菌、李斯特細菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0，COS.293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。其中，特別優(yōu)選單核細胞增生性李斯特細菌(Listeria monocytogenes,以下簡寫為 LM),如 yzuLM4 等。本發(fā)明五方面提供了一種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中，整合有編碼分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白的基因，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌能融合表達單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白。進一步的，所述編碼分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白的基因重組整合于野生型單核細胞增生李斯特菌基因組DNA中hly基因的111位與154位堿基之間。進一步的，所述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白中，Ag85a的氨基酸序列為SEQ ID N0:l,Rv2626c的氨基酸序列為SEQID NO:2，單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的氨基酸序列為SEQ ID N0:3。所述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白中，單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LL0、Ag85a蛋白和/或Rv2626c蛋白之間可選擇地含有連接肽。進一步的，所述分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白的氨基酸序列為SEQ IDNO:11:FSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAIYHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNVGKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFPDSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGAGGGGSGGGGSTTARDIMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREHDIGALPICGDDDRLHGMLTDRDIVIKGLAAGLDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLNVMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARHLPEHAIVQFVKAICSPMALASo進一步的，所述編碼分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白的基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO:5:AAAAGGGCCGGCCCGAACGGCCACCTCATGGACGTCCACGGCAGCGGCAGCTACCCGGCACTGTAGTTCCAGGTTAAGGTTTCACCACCACGGTTGAGCGGGCGGGACATGGACGAGCTGCCGGACGCGCGCGTCCTGCTGAAGTC
GCCGACCCTGTAGTTGTGGGGCCGCAAGCTCACCATGCTGGTCAGCCCGGACAGCCACCAGTACGGCCACCCACCGG
TCAGTTCGAAGATGAGGCTGACCATGGTCGGGCGGACGCCGTTCCGGCCAACGGTCTGAATGTTCACCCTCTGGAAG
GACTGGTCGCTCGACGGCCCCACCGACGTCCGGTTGTCCGTGCAGTTCGGGTGGCCTTCGCGGCAGCAGCCAGAAAG
CTACCGACGAAGAAGCCGCGACTGCGACCGCTAGATAGTGGGGGTCGTCAAGCAGATGCGCCCTCGCTACAGCCCGG
ACAACCTGGGGAGGGTCCGCTACCCAGGGTGGGACTAGCCGGACCGCTACCCACTGCGACCGCCGATGTTCCGGAGG
CTGTACACCCCGGGCTTCCTCCTGGGCCGCACCGTCGCGTTGCTGGGCGACAACTTGCAGCCCTTCGACTAGCGGTT
GTTGTGGGCGCAGACCCACATGACGCCGTTGCCGTTCGGCAGCCTAGACCCACCGTTGTTGGACGGCCGGTTCAAGG
AGCTCCCGAAGCACGCCTGGTCGTTGTAGTTCAAGGTTCTGCGGATGTTGCGGCCACCGCCGGTGTTGCCGCACAAG
CTGAAGGGCCTGTCGC CATGCGTGTCGACCCTCATGACCCCCCGCGTCGAGTTGCGATACTTCGGGCTGGACGTTGC
CCGTGACCCACGGTGCGGGTTGTGGCCCGGGCGCGGGGTCCCGCGGCCGCCACCGCCTAGGCCACCGCCACCGAGGT
GGTGGCGTGCGCTGTAGTACTTGCGTCCACACTGGACACAACCGCTTGTGCTCTGCGATTGGCGACGGCGAGTTATG
TACGCACTCGTGCTGTAGCCGCGCAACGGCTAGACGCCCCTGCTGCTGGCCGACGTGCCGTACGAGTGGCTGGCGCT
GTAACACTAGTTTCCGGACCGACGCCCGGATCTGGGCTTATGGCGGTGCCGACCGCTCAACCGGGCCCTGTCGTAGA
TGATGCAGCTACGCTTGCGTTCGTAGGTCCTCTACGAGTTGCAGTACCTTCTTGTAGTCCAGGCGGCACAAGGCCAG
TAGAGTCTCGTGGCGAACCAGCCTTAGCAGTGGCTTCGGCTGTAGCGGGCTGTGGACGGGCTCGTGCGGTAACACGT
CAAGCAGTTCCGTTAGACGAGCGGGTACCGGGAGCGGTCG進一步的，相比野生型單核細胞增生李斯特菌，本發(fā)明將野生型單核細胞增生李斯特菌hly基因的第112-153位堿基替換為SEQ ID NO: 5。亦即，本發(fā)明的重組減毒單核細胞增生李斯特菌中，野生型的hly編碼基因被替換成了序列為SEQ ID N0:4的融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明第六方面公開了所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的構(gòu)建方法，包括下列步驟:I)從結(jié)核分枝桿菌株的基因組中擴增出Ag85a(又稱Ag85A，F(xiàn)bpA, Rv3804c)和Rv2626c的編碼基因片段；從單核細胞增生李斯特菌株中擴增出待插入位點的上游同源臂片段hlya和下游同源臂片段hlyb ；2)將步驟I)獲得的Ag85a和Rv2626c的編碼基因及上下游同源臂片段拼接成hlya-Ag85a-Rv2626c-hlyb融合片段并連接入穿梭質(zhì)粒獲得重組穿梭質(zhì)粒；3)將步驟2)獲得的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單核細胞增生性李斯特細菌，經(jīng)過抗性和溫度雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。進一步的，步驟I)中，擴增獲得的上游同源臂片段hlya的序列為SEQ ID N0:6:AGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGCGGACATCCATTGTTTTGTAGTTACAGAGTTCTTTATTGGCTTATTCCAGTTATTAAGCGAATATGCTTTTCCGCCTAATGGGAAAGTAAAAAAGTATAAAATAAAACAGAGTAATAAAACTAATGTGCGTTGCAAATAATTCTTATACAAAATGGCCCCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTGACTTTTATGTTGAGGCATTAACATTTGTTAACGACGATAAAGGGACAGCAGGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCA(525bp)下游同源臂片段hlyb的序列為SEQ ID NO: 7:CCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGT (732bp)Ag85a 基因為 SEQ ID NO:8:TTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGTGACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGACGGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCCGACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGCGCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCCCAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGTCCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGGGGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTGATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGTGGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTCCAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGTACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGGGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGGGCACTGGGTGCCACGCCCAACA CCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCRv2626c 基因為 SEQ ID NO:9:ACCACCGCACGCGACATCATGAACGCAGGTGTGACCTGTGTTGGCGAACACGAGACGCTAACCGCTGCCGCTCAATACATGCGTGAGCACGACATCGGCGCGTTGCCGATCTGCGGGGACGACGACCGGCTGCACGGCATGCTCACCGACCGCGACATTGTGATCAAAGGCCTGGCTGCGGGCCTAGACCCGAATACCGCCACGGCTGGCGAGTTGGCCCGGGACAGCATCTACTACGTCGATGCGAACGCAAGCATCCAGGAGATGCTCAACGTCATGGAAGAACATCAGGTCCGCCGTGTTCCGGTCATCTCAGAGCACCGCTTGGTCGGAATCGTCACCGAAGCCGACATCGCCCGACACCTGCCCGAGCACGCCATTGTGCAGTTCGTCAAGGCAATCTGCTCGCCCATGGCCCTCGCCAGCo進一步的，步驟I)中，結(jié)核分枝桿菌株為標準株H37Rv。步驟I)和3)中所述單核細胞增生李斯特菌株為單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4。進一步的，步驟2)可采用重疊衍生PCR技術(shù)(SOEing PCR)拼接各片段，再利用酶切位點將拼接片段插入穿梭載體中。進一步的,步驟2)中，穿梭質(zhì)粒可為pKSV7。進一步的，步驟2)中 ，拼接成的hlya-Ag85a-Rv2626c_hlyb融合片段的序列為SEQID NO:10:
AGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGCGGACATCCATTGTTTTGTAGTTACAGAGTTCTTTATTGGCTTATTCCAGTTATTAAGCGAATATGCTTTTCCGCCTAATGGGAAAGTAAAAAAGTATAAAATAAAACAGAGTAATAAAACTAATGTGCGTTGCAAATAATTCTTATACAAAATGGCCCCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTAAAGTGACTTTTATGTTGAGGCATTAACATTTGTTAACGACGATAAAGGGACAGCAGGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCAAAAAGGGCCGGCCCGAACGGCCACCTCATGGACGTCCACGGCAGCGGCAGCTACCCGGCACTGTAGTTCCAGGTTAAGGTTTCACCACCACGGTTGAGCGGGCGGGACATGGACGAGCTGCCGGACGCGCGCGTCCTGCTGAAGTCGCCGACCCTGTAGTTGTGGGGCCGCAAGCTCACCATGCTGGTCAGCCCGGACAGCCACCAGTACGGCCACCCACCGGTCAGTTCGAAGATGAGGCTGACCATGGTCGGGCGGACGCCGTTCCGGCCAACGGTCTGAATGTTCACCCTCTGGAAGGACTGGTCGCTCGACGGCCCCACCGACGTCCGGTTGTCCGTGCAGTTCGGGTGGCCTTCGCGGCAGCAGCCAGAAAGCTACCGACGAAGAAGCCGCGACTGCGACCGCTAGATAGTGGGGGTCGTCAAGCAGATGCGCCCTCGCTACAGCCCGGACAACCTGGGGAGGGTCCGCTACCCAGGGTGGGACTAGCCGGACCGCTACCCACTGCGACCGCCGATGTTCCGGAGGCTGTACACCCCGGGCTTCCTCCTGGGCCGCACCGTCGCGTTGCTGGGCGACAACTTGCAGCCCTTCGACTAGCGGTTGTTGTGGGCGCAGACCCACATGACGCCGTTGCCGTTCGGCAGCCTAGACCCACCGTTGTTGGACGGCCGGTTCAAGGAGCTCCCGAAGCACGCCTGGTCGTTGTAGTTCAAGGTTCTGCGGATGTTGCGGCCACCGCCGGTGTTGCCGCACAAGCTGAAGGGCCTGTCGCCATGCGTGTCGACCCTCATGACCCCCCGCGTCGAGTTGCGATACTTCGGGCTGGACGTTGCCCGTGACCCACGGTGCGGGTTGTGGCCCGGGCGCGGGGTCCCGCGGCCGCCACCGCCTAGGCCACCGCCACCGAGGTGGTGGCGTGCGCTGTAGTACTTGCGTCCACACTGGACACAACCGCTTGTGCTCTGCGATTGGCGACGGCGAGTTATGTACGCACTCGTGCTGTAGCCGCGCAACGGCTAGACGCCCCTGCTGCTGGCCGACGTGCCGTACGAGTGGCTGGCGCTGTAACACTAGTTTCCGGACCGACGCCCGGATCTGGGCTTATGGCGGTGCCGACCGCTCAACCGGGCCCTGTCGTAGATGATGCAGCTACGCTTGCGTTCGTAGGTCCTCTACGAGTTGCAGTACCTTCTTGTAGTCCAGGCGGCACAAGGCCAGTAGAGTCTCGTGGCGAACCAGCCTTAGCAGTGGCTTCGGCTGTAGCGGGCTGTGGACGGGCTCGTGCGGTAACACGTCAAGCAGTTCCGTTAGACGAGCGGGTACCGGGAGCGGTCGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTo本發(fā)明第七方面，提供了所述的融合蛋白或其編碼基因或所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌在制備結(jié)核病疫苗上的用途。進一步的,所述結(jié)核病疫苗為針對休眠期結(jié)核分枝桿菌的疫苗。 本發(fā)明第八方面，提供了一種疫苗，包括所述融合蛋白或所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
所述疫苗中還可進一步包括佐劑。本發(fā)明利用單核細胞增生李斯特菌能在細胞吞噬體內(nèi)存活，同時也能從細胞吞噬體中“逃逸”出來，進入細胞質(zhì)繁殖，誘發(fā)機體產(chǎn)生強烈的CD8+T細胞免疫應答的特性。利用同源重組技術(shù)，將外源融合蛋白基因定點插入到載體生物基因組中。由此提供的融合表達早期分泌蛋白Ag85a和DosR調(diào)控的潛伏期抗原Rv2626c的疫苗能有效提高宿主對分枝桿菌的免疫保護效應，為新型結(jié)核病疫苗提供了新的思路。


圖1-pKSV7-hlya-Ag85a 的 Xba I 與 BamH I 雙酶切電泳圖；1:DL2000Marker2:pKSV7-hlya-Rv2626c 雙酶切結(jié)果圖 2-pKSV7-hlya-Ag85a-Rv2626c-hlyb 的 Xba I 與 Sal I 雙酶切電泳圖；Μ: λ -14Marker1: pKSV7-Ag85a-Rv2626c-hly 雙酶切結(jié)果

圖3——重組細菌的鑒定結(jié)果；1: λ -14Marker2: LM4PCR 產(chǎn)物3，4:rLM4PCR 產(chǎn)物5:DL2000Marker圖4—蛋白水平檢測目的基因的表達M:預染 marker1: rLm4的分泌蛋白2:LM4的分泌蛋白圖5——LLO表達情況驗證I:DL2000Marker2: yzuLM4RTPCR 結(jié)果3:rLM4RTPCR 結(jié)果4: λ _14Marker圖6——分泌融合蛋白LL0-Ag85a_Rv2626c的溶血活性檢驗PBS = PBS 對照組LM4:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4組rLm4:重組減毒菌 LM Ahly:: Ag85a-Rv2626c 組圖7——重組菌對C57BL/6小鼠誘導產(chǎn)生的細胞因子的結(jié)果。Control:陰性對照BCG:卡介苗Ck:空白對照LM4:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4組rLm4:重組減毒菌 LMAhly:: Ag85a-Rv2626c 組
具體實施例方式本發(fā)明實施例采用了下列技術(shù)方案:首先，從結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv的基因組中擴增出Ag85a (又稱Ag85A，F(xiàn)bpA，Rv3804c)和Rv2626c片段，以及單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4中擴增出hly上游片段和下游片段，經(jīng)膠回收后得到的hlya-Ag85a-RV2626c-hlyb融合片段與pMD_20T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR與雙酶切驗證正確的陽性克隆送至南京金斯瑞公司并測序；將測序正確的陽性克隆進行提取質(zhì)粒，進而雙酶切，回收目的片段，再與穿梭載體PKSV7連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR與雙酶切驗證正確，將陽性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至yzuLM4感受態(tài)細胞，通過抗性和溫度雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的同源重組單核細胞增生李斯特菌。該菌為一種重組減毒菌LMAhly:: Ag85a-Rv2626c0該菌可在正常生活情況下表達Ag85a-Rv2626c_LL0蛋白。構(gòu)建重組減毒菌具體方法主要包括下列步驟:1.用PCR技術(shù)擴增出目的基因Ag85a、Rv2626c以及hly基因待插入位點的上下游同源片段hlya、hlyb。 所用到的引物如下:正義:5，-ATAAAGAAAATTCAATTTCATTTTCCCGGCCGGGCTTG-3’(SEQ ID NO: 12)反義:5，-AATGCTGGATCCGCCACCGCCGGCGCCCTGGGGCGCGGGCA-3’(SEQ ID NO: 13)回收長為888bp的Ag85a基因。正義:5，-ATTGGATCCGGTGGCGGTGGCTCCACCACCGCACGCACAT-3，(SEQID NO: 14)反義:5，-CGTGTTTCTTTTCGATTGGCTGGCGAGGGCATG-3’(SEQ ID NO: 15)回收長為420bp的Rv2626c基因。正義:5，-AACCTGAGCTCAGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGC-3(SEQ ID NO: 16)反義:5，-CAAGCCCGGCCGGGAAAATGAAATTGAATTTTCTTTAT-3，(SEQID NO: 17)回收長為525bp的hlya片段。正義:5，-GCCCTCGCCAGCCAATCGAAAAGAAACACG-3’(SEQ ID NO: 18)反義:5’ -AATCAGTCGACACTTGAGATATATGCAGGAGG-3’ (SEQ ID NO: 19)回收長為732bp的hlyb片段。2.然后利用SOEing PCR技術(shù)將四者拼接起來，再利用酶切位點將拼接片段插入穿梭載體PKSV7中。hlya片段和Ag85a基因SOEing PCR拼接為hlya_Ag85a的方法:采用正義、反義引物對純化的hlya片段、Ag85a基因進行SOEing PCR拼接。正義:5，-AACCTGAGCTCAGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGC-3(SEQ ID NO: 16)反義:5’ -AATGCTGGATCCGCCACCGCCGGCGCCCTGGGGCGCGGGCA-3’ (SEQ ID NO: 13)回收長為1208bp 的 hlya_Ag85a 片段。Rv2626c片段和hlyb片段SOEing PCR拼接為Rv2626c_hlyb的方法:采用正義、反義引物對純化的Rv2626c片段、hlyb進行SOEing PCR拼接。正義:5，-ATTGGATCCGGTGGCGGTGGCTCCACCACCGCACGCACAT-3，(SEQID NO: 14)反義:5’-GGGTCTAGAACTTGAGATATATGCAGGAGG-3’ (SEQ ID NO: 19)回收長為1125bp 的 Rv2626c_hlyb 片段。
hlya_Ag85a片段插入穿梭載體pKSV7的方法:將回收的hlya_Ag85a片段用Xba1、BamH I酶雙酶切，同時用Xba 1、BamH I雙酶切穿梭載體pKSV7，然后將hlya_Ag85a片段與載體進行連接。將Rv2626c-hlyb片段插入穿梭載體pKSV7-hlya_Ag85a的方法:將回收的Rv2626c-hlyb片段用BamH 1、Sal I酶雙酶切，同時用BamH 1、Sal I雙酶切穿梭載體pKSV7-hlya-Ag85a，然后將Rv2626c-hlyb片段與載體進行連接。3.經(jīng)電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-Ag85a-Rv2626c_hlyb導入單核細胞增生李斯特菌，在抗生素和溫度雙重選擇壓力下實現(xiàn)同源重組，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。其次，將獲得的重組減毒菌LMAhly:: Ag85a_Rv2626c分泌蛋白進行Western-blotting實驗。一抗為鼠免蛋白Ag85a和Rv2626c陽性血清,二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，顯色劑為DAB和ECL，結(jié)果顯示LMAhly:: Ag85a_Rv2626c分泌的蛋白Ag85a-Rv2626c與Ag85a和Rv2626c陽性血清發(fā)生特異性的免疫學反應。同時，對獲得的重組減毒菌LM Λ hly:: Ag85a_Rv2626c的安全性進行初步評價，結(jié)果表明所獲得的重組減毒菌LM Λ hly:: Ag85a-Rv2626c與yzuLM4菌株相比較，其毒性明顯下降，表明其在安全性方面是可靠的。進一步的，對獲得的重組減毒菌LMAhly:: Ag85a_Rv2626c的免疫保護性方面進行了評價，結(jié)果表明所獲得的重組減毒菌LMAhly:: Ag85a-Rv2626c能夠誘導小鼠對結(jié)核分枝桿菌蛋白Ag85a-Rv2626c產(chǎn)生較強的免疫保護效應，且更傾向于Thl型的免疫應答。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式
加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。在進一步描述本發(fā)明具體實施方式
之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本技術(shù)領域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關領域的常規(guī)技術(shù)。這些技 術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見SambiOOk等 MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYM0L0GY，Academic Press，San Diego ；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.) ,Academic Press,San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。實施例1基因工程菌的構(gòu)建1.1引物的設計根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv的基因組DNA的Ag85a和Rv2626c序列分別設計一對特異性的引物，引物由北京六合華大基因合成，采用引物如下:Ag85aF:5’ -ATAAAGAAAATTCAATTTCATTTTCCCGGCCGGGCTTG-3’ (SEQ ID NO:12)Ag85aR:5 -AATGCTGGATCCGCCACCGCCGGCGCCCTGGGGCGCGGGCA-3> (SEQ ID NO:13)說明:下劃線代表BamH I酶切位點Rv2626cF:5 ~ATTGGATCCGGTGGCGGTGGCTCCACCACCGCACGCACAT~3 (SEQ ID NO:14)說明:下劃線代表BamH I酶 切位點Rv2626cR:5’ -CGTGTTTCTTTTCGATTGGCTGGCGAGGGCATG-3’ (SEQ ID NO:15)根據(jù)單核細胞增生李斯特菌yzuLM4的基因組DNA的LLO上下游序列分別設計一對特異性的引物，引物由北京六合華大基因合成，采用引物如下:hIyaF:5J ~AACCTGAGCTCAGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGC~3J (SEQ ID NO:16)說明:下劃線代表Xba I酶切位點hlyaR:5’ -CAAGCCCGGCCGGGAAAATGAAATTGAATTTTCTTTAT-3’ (SEQ ID NO:17)hlybF:5，-GCCCTCGCCAGCCAATCGAAAAGAAACACG-3’(SEQ ID NO:18)hlvbR:5’ -AATCAGTCGACACTTGAGATATATGCAGGAGG-3’ (SEQ ID NO:19)說明:下劃線代表Sal I酶切位點1.2目的基因的PCR擴增、產(chǎn)物回收以及克隆載體的構(gòu)建采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv基因組DNA和單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4基因組DNA，分別以其為模板，以Ag85aF、Ag85aR ；Rv2626cF、Rv2626cR ;hlyaF、hlyaR ;hlybF、hlybR 為引物進行 PCR 擴增。PCR 反應體系為50 μ L:滅菌超純水:37.5 μ L10XPCR Buffer:5 μ L上游引物(ΙΟΟμπιοΙ/L):lyL下游引物(ΙΟΟμπιοΙ/L):lyLTaq 酶(3U/y L):0.5μ LdNTP (2.5mmol/L):4μ L細菌基因組模板:I μ LPCR 反應條件為:94°C預變性 5min，94°C變性 40s，58°C退火 40s，72°C延伸 lmin，40s，40s，50s，30個循環(huán)，72°C再延伸IOmin。PCR產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收888bp，420bp，525bp，732bp的DNA片段后，分別以 Ag85a、hlya, Rv2626c、hlyb 回收片段為模板，hlyaF、Ag85aR 和 Rv2626cF、hlybR 作為引物進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μ L:
滅菌超純水:34.5μ L10XPCR Buffer:5μ L上游引物(100ymol/L):lyL下游引物(100ymol/L):lyLTaq 酶(3U/y L):0.5μ LdNTP (2.5mmol/L):4 μ L回收片段模板:4 μ LPCR 反應條件為:94°C預變性 5min，94°C變性 40s，55°C退火 lmin，72°C延伸 80s，30個循環(huán)，72°C再延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收1208bp，1125bp的DNA片段后分別與pMD_20T載體在16°C金屬浴條件下連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，通過PCR與雙酶切驗證來篩選陽性克隆。將得到的陽性克隆送至南京金斯瑞測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pMD-20T-hlya-Ag85a和pMD-20T-Rv2626c_hlyb。其中，pMD-20T-hlya_Ag85a的測序結(jié)果為 SEQ ID NO:20:ACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTACTAGTCATATGGATAATGCTGGATCCGCCACCGCCGGCGCCCTGGGGCGCGGGCCCGGTGTTGGGCGTGGCACCCAGTGCCCGTTGCAGGTCGGGCTTCATAGCGTTGAGCTGCGCCCCCCAGTACTCCCAGCTGTGCGTACCGCTGTCCGGGAAGTCGAACACGCCGTTGTGGCCGCCACCGGCGTTGTAGGCGTCTTGGAACTTGATGTTGCTGGTCCGCACGAAGCCCTCGAGGAACTTGGCCGGCAGGTTGTTGCCACCCAGATCCGACGGCTTGCCGTTGCCGCAGTACACCCAGACGCGGGTGTTGTTGGCGATCAGCTTCCCGACGTTCAACAGCGGGTCGTTGCGCTGCCACGCCGGGTCCTCCTTCGGGCCCCACATGTCGGAGGCCTTGTAGCCGCCAGCGTCACCCATCGCCAGGCCGATCAGGGTGGGACCCATCGCCTGGGAGGGGTCCAACAGGCCCGACATCGCTCCCGCGTAGACGAACTGCTGGGGGTGATAGATCGCCAGCGTCAGCGCCGAAGAAGCAGCCATCGAAAGACCGACGACGGCGCTTCCGGTGGGCTTGACGTGCCTGTTGGCCTGCAGCCACCCCGGCAGCTCGCTGGTCAGGAAGGTCTCCCACTTGTAAGTCTGGCAACCGGCCTTGCCGCAGGCGGGCTGGTACCAGTCGGAGTAGAAGCTTGACTGGCCACCCACCGGCATGACCACCGACAGGCCCGACTGGTCGTACCACTCGAACGCCGGGGTGTTGATGTCCCAGCCGCTGAAGTCGTCCTGCGCGCGCAGGCCGTCGAGCAGGTACAGGGCGGGCGAGTTGGCACCACCACTTTGGAATTGGACCTTGATGTCACGGCCCATCGACGGCGACGGCACCTGCAGGTACTCCACCGGCAAGCCCGGCCGGGAAAATGAAATTGAATTTTCTTTATTGAATGCAGATGCATCCTTTGCTTCAGTTTGTTGCGCAATTGGTAGACTAACTAATATAAGTGTAATAAAAACTAGCATTATTTTTTTCATGGGTTTCACTCTCCTTCTACATTTTTTAACCTAATAATGCCAAATACCGTTTGCCACCCCTCTCTTTTGATAATTATAATATTGGCGAAATTCGCTTCTAAAGATGAAACGCAATATTATATGCTTGCTTTATAGCTTTATTCTAGTCCTGCTGTCCCTTTATCGTCGTTAACAAATGTTAATGCCTCAACATAAAAGTCACTTTAAGATAGGAATATACTAATCAAAGGAGGGGGCCATTTTGTATAAGAATTATTTGCAACGCACATTAGTTTTATTACTCTGTTTTATTTTATACTTTTTTACTTTCCCATTAGGCGGAAAAGCATATTCGCTTAATAACTGGAATAAGCCAATAAAGAACTCTGTAACTACAAAACAATGGATGTCCGCTCTACCTGACACAACAAACCTGAGCTCAGGTATCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCpMD-20T-Rv2626c_hlyb 的測序結(jié)果為 SEQ ID N0:21::AGCTCGGTACCCGGGGATCCGATTGGATCCGGTGGCGGTGGCTCCACCACCGCACGCGACATCATGAACGCAGGTGTGACCTGTGTTGGCGAACACGAGACGCTAACCGCTGCCGCTCAATACATGCGTGAGCACGACATCGGCGCGTTGCCGATCTGCGGGGACGACGAC CGGCTGCACGGCATGCTCACCGACCGCGACATTGTGATCAAAGGCCTGGCTGCGGGCCTAGACCCGAATACCGCCACGGCTGGCGAGTTGGCCCGGGACAGCATCTACTACGTCGATGCGAACGCAAGC
ATCCAGGAGATGCTCAACGTCATGGAAGAACATCAGGTCCGCCGTGTTCCGGTCATCTCAGAGCACCGCTTGGTCGG
AATCGTCACCGAAGCCGACATCGCCCGACACCTGCCCGAGCACGCCATTGTGCAGTTCGTCAAGGCAATCTGCTCGC
CCATGGCCCTCGCCAGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATA
AAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAA
TATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAG
CCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAAC
GTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATCGTTGTAAAAAATGCCACT AAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGT
AAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTA
AAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTT
AAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGA
GCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTTCTAGATGATATCCATATGACT
AGTAGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTTCCCCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAAT均符合預期。1.3 穿梭載體 pKSV7-hlya-Ag85a-Rv2626c_hlyb 的構(gòu)建與鑒定pMD-20T-hlya-Ag85a經(jīng)Xba I與BamH I雙酶切后，酶切產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收1208bp的DNA片段后，與PKSV7載體在16°C金屬浴條件下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，通過PCR與雙酶切驗證來篩選陽性克隆，結(jié)果見圖1。驗證正確的質(zhì)粒命名為pKSV7-hlya-Ag85a。pMD-20T-Rv2626c-hlyb經(jīng)BamH I與Sal I雙酶切后，酶切產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收112 5bp的DNA片段后，與pKSV7-hlya_Ag85a載體在16°C金屬浴條件下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，通過PCR與雙酶切驗證來篩選陽性克隆pKSV7-hlya-Ag85a-Rv2626c-hlyb，結(jié)果見圖2。1.4 重組菌 LM ^ hly:: Ag85a_Rv2626c 的構(gòu)建采用電轉(zhuǎn)化的方法(2200v、5ms)將重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-hlya-Ag85a-Rv2626c-hlyb 轉(zhuǎn)化感受態(tài) yzuLM4。接種于 BHI 培養(yǎng)基，在溫度(42°C )和氯霉素(10yg/ml)雙重選擇壓力下連續(xù)傳過8代以實現(xiàn)同源重組，使目的基因定點整合進細菌基因組DNA中。再在無選擇壓力條件下傳10代以脫去穿梭質(zhì)粒。將菌液稀釋后涂布到BHI平板上30°C培養(yǎng)長出單菌落，再將單菌落轉(zhuǎn)種至含有氯霉素(10 μ g/ml)的BHI平板上30°C培養(yǎng)。挑取在BHI平板上生長、轉(zhuǎn)種后不再生長的單菌落，提取基因組后進行PCR鑒定，鑒定為陽性的克隆即為重組菌LM4 Λ hly:: Ag85a_Rv2626c。PCR反應的引物為:hlyaF:同上hlyb+:5-GTTCTACATCACCTGAGACAGATTTTCCGC-3SEQ ID NO:22:PCR 反應體系(50 μ I)為:滅菌超純水:37.5μ LIOXPCR Buffer:5μ L上游引物(100ymol/L):lyL
下游引物(100ymol/L):lyLTaq 酶(3U/y L):0.5μ LdNTP (2.5mmol/L):4μ L細菌基因組模板:I μ LPCR 反應條件為:94 °C 5min ；94 °C 50s, 62 °C 30s, 72 °C 2min，25 個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測大小應為2680bp，見圖3。由圖3結(jié)果可知，目的基因片段成功的定點整合到單核細胞增生李斯特菌yzuLM4基因組中，且在無抗壓力傳代下，成功脫去了質(zhì)粒，得到了無抗性的重組減毒菌LMAhly:: Ag85a- Rv2626c0實施例2蛋白水平檢測目的基因的表達接種實施案例I中所構(gòu)建的LMAhly:: Ag85a-Rv2626c至BHI液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)15小時后取Iml菌液，離心去除菌體、收集培養(yǎng)上清液。用TCA沉淀法得到的分泌的蛋白并進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠，量出長與寬，并剪出比膠的長與寬各短0.5cm的NC膜，剪出比膠的長與寬各短Icm的濾紙，將它們浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，按濾紙一濾紙一凝膠一NC膜一濾紙一濾紙的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)儀中，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取出NC膜，置于1%BSA — PBS封閉液中，封閉過夜。用含0.05%Tween20的PBS (PBST)室溫振蕩洗3次，用封閉液按1:1000分別稀釋鼠免蛋白Ag85a和Rv2626c陽性血清作為一抗，室溫振搖3h ；用PBST洗5次，每次5min ;用封閉液按1:3000稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫振搖Ih ;用PBST洗5次，每次5min ;最后將NC膜分別浸于DAB (3，3—二氨基聯(lián)苯胺)溶液中顯色和ECL (化學發(fā)光底物)顯色，用蒸餾水沖洗終止反應，結(jié)果見圖4。由圖4結(jié)果可以看出，分別用鼠免蛋白Ag85a和Rv2626c陽性血清作為一抗均有70kDa左右的目的條帶，表明目的片段Ag85a和Rv2626c均得到了正確的表達。為了證明LLO得到了正確的表達，分別提取LMAhly:: Ag85a_Rv2626c和yzuLM4細菌的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄PCR，設計一對從hly基因起始密碼子開始的跨度為1372bp的序列，包括了 hly基因大部分序列，且下游引物在同源重組用的hlybR引物的外圍:F:ATGAAAAAAATAATGCTAGT(SEQ ID NO:23):R:GACGATGTGAAATGAGCTAGC(SEQ ID NO:24)。PCR 反應體系(20 μ I)為:滅菌超純水:11.8μ L10XPCR Buffer:2μ L上游引物(100ymol/L):lyL下游引物(ΙΟΟμπιοΙ/L):lyLTaq 酶(3U/y L):0.2μ LdNTP (2.5mmol/L):2 μ L細菌RNA反轉(zhuǎn)錄模板:2 μ L結(jié)果見圖5。由圖5結(jié)果可以看出，LM Ahly:: Ag85a_Rv2626c在2600bp左右有一條帶，其中包括了 1359bp的hly基因的部分片段和1308bp的融合基因Ag85a_Rv2626c的序列，而yzuLM4則只有大小為1359bp的條帶。由圖4和圖5結(jié)果可知，LLO得到了正確的表達，且融合基因獲得定點整合。實施例3重組菌安全性評價3.1分泌融合蛋白LL0-Ag85a_Rv2626c的溶血活性檢驗分別接種實施案例I中所構(gòu)建的LMAhly:: Ag85a_Rv2626c、yzLM4至定量體積的BHI液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)15小時后取Iml菌液，離心去除菌體、收集培養(yǎng)上清液。調(diào)整上清液0D600至相同大小后，取60 μ I上清液用PBS (ρΗ6.0)從原液到27等倍梯度稀釋后加入到加入到V形96孔血凝板中，再向各孔中加入20 μ LI %山羊紅細胞懸液，混勻，置于37°C溫箱作用I小時后觀察溶血情況，以50%紅細胞發(fā)生溶血的孔的稀釋度判為溶血效價。以PBS作為對照組。結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，單核細胞增生李斯特菌yzuLM4組的溶血活性在25左右，具有較強的溶血活性，而重組減毒菌LMAhly:: Ag85a-Rv2626c則并喪失了溶血活性。使其在安全性上得到了保障。為該重組減毒菌后續(xù)的發(fā)展提供了安全基礎。3.2重組菌對C57BL/6小鼠LD50的測定取新鮮培養(yǎng)的重組菌菌液，先用PBS洗滌2次后測定0D600并調(diào)整0D600為0.80。將重組菌做10倍梯度稀釋，取適宜稀釋度感染6周齡雄性C57BL/6小鼠。感染方法是:每一稀釋度靜脈注射5只實驗小鼠，100 μ L/只，做5個連續(xù)稀釋度。同時將細菌適度稀釋后涂布BHI培養(yǎng)板進行菌落計數(shù)。感染后連續(xù)觀察14天，記錄各組動物死亡數(shù)目，采用Reed-Muench方法計算LD50,結(jié)果見下表。表I重組菌對C57BL/6小鼠LD50的測定
權(quán)利要求
1.一種針對結(jié)核病具有免疫原性的融合蛋白，為含有分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，Ag85a的氨基酸序列為SEQ ID NO:1 ；Rv2626c 的氨基酸序列為 SEQ ID NO: 2。
3.如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，所述Ag85a蛋白連接于Rv2626c蛋白的N端或C端。
4.如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白。
5.如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的氨基酸序列為SEQ ID NO:3。
6.如權(quán)利要求5所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中，Ag85a蛋白和Rv2626c蛋白的融合蛋白插入于所述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的第37位和第38位氨基酸殘基之間。
7.如權(quán)利要求5所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQIDN0:4。
8.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述融合蛋白。
9.一種載體,其含有權(quán)利要求8所述多核苷酸。
10.如權(quán)利要求9所述載體，其特征在于，所述載體為原核載體或穿梭質(zhì)粒。
11.一種宿主細胞 ，其被權(quán)利要求9或10所述載體所轉(zhuǎn)化。
12.—種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中，整合有編碼分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白的基因，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌能融合表達單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白。
13.如權(quán)利要求12所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特征在于，所述編碼分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白的基因重組整合于野生型單核細胞增生李斯特菌基因組DNA中hly基因的111位與154位堿基之間。
14.如權(quán)利要求12所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特征在于，所述分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白中，Ag85a的氨基酸序列為SEQ ID NO:1, Rv2626c的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
15.如權(quán)利要求12所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特征在于，所述編碼分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:5。
16.如權(quán)利要求12所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特征在于，相比野生型單核細胞增生李斯特菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌中，野生型單核細胞增生李斯特菌的hly編碼基因被替換成了序列為SEQ ID N0:4的融合蛋白的編碼基因。
17.如權(quán)利要求12-16任一權(quán)利要求所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的構(gòu)建方法，包括下列步驟: 1)從結(jié)核分枝桿菌株的基因組中擴增出Ag85a和Rv2626c的編碼基因片段；從單核細胞增生李斯特菌株中擴增出待插入位點的上游同源臂片段hlya和下游同源臂片段hlyb ； 2)將步驟I)獲得的Ag85a和Rv2626c的編碼基因及上下游同源臂片段拼接成hlya-Ag85a-Rv2626c-hlyb融合片段并連接入穿梭質(zhì)粒獲得重組穿梭質(zhì)粒； 3)將步驟2)獲得的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單核細胞增生性李斯特細菌，經(jīng)過抗性和溫度雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
18.如權(quán)利要求17所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟I)中，擴增獲得的上游同源臂片段hlya的序列為SEQ ID N0:6 ;下游同源臂片段hlyb的序列為SEQ ID NO: 7 ；Ag85a的編碼基因為SEQ ID NO:8 ；Rv2626c的編碼基因為SEQID N0:9。
19.如權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述的融合蛋白或其編碼基因或權(quán)利要求12-16任一權(quán)利要求所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌在制備結(jié)核病疫苗上的用途。
20.—種疫苗,包括權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述融合蛋白或權(quán)利要求12-16任一權(quán)利要求所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種針對結(jié)核病具有免疫原性的融合蛋白及其應用，本發(fā)明的針對結(jié)核病具有免疫原性的融合蛋白，為含有分枝桿菌Ag85a和Rv2626c的融合蛋白，本發(fā)明還進一步公開了一種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中整合有本發(fā)明融合蛋白的編碼基因。本發(fā)明的融合蛋白或其編碼基因或重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌可用于制備結(jié)核病疫苗。
文檔編號C12N1/19GK103214582SQ20131011353
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月2日
發(fā)明者焦新安, 殷月蘭, 付紅, 陳祥, 孫林, 潘志明, 黃金林, 耿士忠, 李求春 申請人:揚州大學