專利名稱：用于結(jié)核病血清學診斷的特異電化學免疫傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)涉及特異性電化學免疫傳感器和結(jié)核病免疫學診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴重威脅人類健康的重要慢性傳染病。據(jù)WHO最新發(fā)布的研究報告 2008年度，全球新增結(jié)核病感染者940萬(其中15%為HIV陽性)，結(jié)核病患病者1110萬，因結(jié)核病導致死亡者110萬。如果以這樣的趨勢繼續(xù)發(fā)展，到2015年，全球新增結(jié)核病感染者將達到1000萬。結(jié)核分枝桿菌與HIV共感染，耐多藥及廣譜耐藥結(jié)核菌的出現(xiàn)及蔓延更加激了全球結(jié)核病防治任務(wù)。診斷是治療的前提，但目前的診斷技術(shù)手段極大的束縛了結(jié)核病的控制。目前結(jié)核病的診斷方法主要包括影像學、微生物學、免疫學和分子生物學診斷。這些方法具備不同的檢測靈敏性和特異性，且針對不同類型的患者各具長短。近年來，基于特異性抗原-抗體反映的血清學免疫診斷因其耗時短，方法簡單，樣品容易獲得及適應(yīng)人群廣泛等優(yōu)點而備受青睞。開發(fā)高特異性和高靈敏性的診斷方法主要依賴于抗原-抗體及檢測方法的選擇。血清學免疫診斷主要包括基于抗體免疫反應(yīng)檢測針對結(jié)核菌的特異性抗體，基于T細胞介導的細胞免疫的檢測如Y干擾素檢測或直接檢測結(jié)核菌特異性抗原如脂阿拉伯甘露糖等。但在2008年，WH0/TDR在同一實驗室對目前可商業(yè)購買的19個快速結(jié)核病檢測試盒進行了調(diào)研，參考分支桿菌培養(yǎng)及臨床跟蹤結(jié)果得到它們的靈敏性和特異性分別介于 0. 97%-59. 7%和53%-98. 7%，并強調(diào)這些診斷試劑盒不能被推薦使用于結(jié)核病診斷。電化學免疫傳感器是將免疫測定法與高靈敏的電化學傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型生物傳感器，應(yīng)用于痕量免疫原性物質(zhì)的分析研究。能識別較大分子之間的微小差異，具有很強的專一性。其工作原理和傳統(tǒng)的免疫測試法相似，都屬于固相免疫測試法， 即把抗原或抗體固定在傳感器表面，通過傳感技術(shù)將抗原抗體發(fā)生吸附時產(chǎn)的電流變化轉(zhuǎn)變成可檢測的信號來測定樣品中待測分子的濃度。經(jīng)過多年的研究，該技術(shù)已經(jīng)成功運用于藥物如恩氟沙星；毒素如黃曲霉毒素B，黃曲霉毒素Ml，赫曲毒素A，磷酸化乙酰膽堿酯酶；生物素；細菌如鼠傷寒沙門(氏)菌；病毒；激素如human chorionic gonadotrophin (hCG)，霍爾蒙17 β-雌二醇，睪酮；抗體如癌胚抗原，前列腺特異抗原，α-1-胎兒球蛋白； 抗體如人體血清中IgG，針對組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體；細胞因子如IL-12等的檢測。這些電化學免疫傳感器的檢測最低濃度可達到納克甚至皮克級，具有很高的靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
免疫傳感器是將免疫測定法與高靈敏的傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型生物傳感器，應(yīng)用于痕量免疫原性物質(zhì)的分析研究。基于前期的抗原標記篩選工作，選定結(jié)核分枝桿菌Rv2175c基因編碼蛋白(下稱特異性抗原)作為特異性抗原，構(gòu)建高靈敏度電化學免疫傳感器，通過檢測人體血清中對應(yīng)該特異抗原的抗體而實現(xiàn)結(jié)核病血清學診斷。本發(fā)明提出的電化學免疫傳感器含有結(jié)核菌特異性抗原以及電化學檢測裝置，所述的結(jié)核菌特異性抗原是結(jié)核菌特異性抗原Rv2175c。其中結(jié)核菌特異性抗原Rv2175c是通過以下方式制備獲得⑴克隆結(jié)核分枝桿菌H37Rv中Rv2175c基因；⑵在大腸桿菌中異源表達純化特異性抗原。電化學免疫傳感器是通過以下制備方式獲得首先，將奈酚分散的多壁碳納米管修飾在裸玻碳電極表面(奈酚帶負電)行成一層帶負電荷的膜層；然后通過靜電吸附作用將帶正電荷的亞甲基藍(起氧化還原探針的作用)固定在電極表面；接著在電極表面電沉積一層納米金，能特異蛋白表面帶有大量的氨基發(fā)揮鍵合作用而將其固載在電極表面；用牛血清白蛋白來封閉沒有被特異蛋白沒占據(jù)的納米金活性位點。本發(fā)明通過檢測血清中是否含有與特異蛋白結(jié)合的特異性抗體，判斷是否為結(jié)核病患者(當結(jié)核病特異性抗體與電極表面抗原結(jié)合時，其電墮性將阻礙電子傳遞，從而使得電極表面亞甲藍所產(chǎn)生的氧化還原峰電流減小。通過結(jié)合前后電流的變化就可以定性檢測血清中是否含有針對結(jié)核菌特意抗原的抗體)。


圖1的圖1(a)，圖1(b)，圖1(c)電化學免疫傳感器檢測結(jié)果。
具體實施例方式l、Rv2175c基因的克隆
利用引物對2715a (5’ -AGCCTAGGATCCATGCCTGGCC-3’，下劃線部分為BamHI限制性酶切位點)和 2715b (5' -GAGAAGCTTCTGCAACCCCGGT-3 ；下劃線部分為 HindIII 限制性酶切位點)將開放閱讀框Rv2175c從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出來；
擴增產(chǎn)物用BamHI和HindIII進行酶切，連接到經(jīng)過相同內(nèi)切酶酶切的pET28a質(zhì)粒載體上；
轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α經(jīng)過PCR鑒定，測序驗證后得到得到重組質(zhì)粒pET28a-rv2175c (測序結(jié)果顯示蛋白質(zhì)的第21位的天冬氨酸突變成了谷氨酸，目前的研究文獻沒有提及該氨基酸在該蛋白中發(fā)揮了特殊的功能，因此繼續(xù)進行下一步的實驗研究)。2、Rv2175c編碼蛋白的表達及純化
將重組質(zhì)粒pET28a-rv2175c轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL-21 (DE3)，PCR鑒定后； 用終濃度0.1 mM IPTG小規(guī)模誘導，檢測發(fā)現(xiàn)其表達量較高，以可溶性和包涵體兩種形式表達；
大規(guī)模誘導表達，并利用Qiangen公司的鎳親和層析柱，參考其方法進行純化，其中上樣緩沖液，雜蛋白系統(tǒng)液和目的蛋白洗脫也中的咪唑濃度分別為10mM，20 mM和250 mM。3、兔多克隆抗體制備
利用200ug特異性抗原(Rv2175c編碼蛋白)皮下初次免疫1只新西蘭大白兔；14天后再進行一次皮下加強免疫，免疫量為200ug ；10天后再進行一次皮下加強免疫，免疫量為 200ug ；7天后耳靜脈取血，測效價，效價未達要求；5天后再再進行一次皮下加強免疫，免疫量為200ug ；9天后耳靜脈取血，測效價，效價達到要求(大于1:51200)，頸動脈取血，離心收集多抗血清，共收集30ml，按每ml量分裝后于_80°C凍存?zhèn)溆谩?、電化學免疫傳感器的制備將3ul奈酚分散的多壁碳納米管修飾于潔凈玻碳電極表面，室溫干燥； 將電極浸入5mM亞甲基藍溶液20分鐘； 在電極表面電沉積一層納米金；
滴加IOul 30ug/ml特異抗原于電極表面，4°C孵育6小時； 將電極浸入0. 25%牛血清白蛋白溶液20分鐘； 用洗脫緩沖液充分洗脫電極并于潮濕環(huán)境下保存。5、血清樣品的檢測
將制備好的電化學免疫傳感器浸入10倍稀釋血清，孵育1小時； 用洗脫緩沖液充分洗滌電極；
將電極放入含有3ml 0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)的電化學小池(electrochemical cell)中；
以50 mV/s的掃描速度記錄從-0. 6^0 V區(qū)間的循環(huán)伏安圖； 圖形數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明利用特異抗原在兔子中制備抗體血清作為陽性對照。在對健康人和結(jié)核病人血清檢測中，通過免疫傳感器電流變化差異，該免疫傳感器能很好的將健康人和結(jié)核病患者區(qū)分開，達到血清學診斷目的。使用本電化學免疫傳感器進行檢測的結(jié)果如圖1所示，(a), (b), (c)分別為利用電化學免疫傳感器對健康人血清(10人份混合)，結(jié)核病患者血清(10人份混合)和針對特異性抗原的兔免疫血清進行孵育半小時前后的循環(huán)伏安圖黑線代表孵育前電流，紅線代表孵育后電流，可以看出三者的電流變化差異Δ I分別為3μΑ，14μΑ和9μΑ。
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)核病血清學診斷的特異電化學免疫傳感器，其特征在于含有結(jié)核菌特異性抗原以及電化學檢測裝置，所述的結(jié)核菌特異性抗原是結(jié)核菌特異性抗原RV2175C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學免疫傳感器，其特征在于，它是通過以下制備方式獲得首先將奈酚分散的多壁碳納米管修飾在裸玻碳電極表面行成一層帶負電荷的膜層；然后通過靜電吸附作用將帶正電荷的亞甲基藍固定在電極表面；接著在電極表面電沉積一層納米金，將結(jié)核菌特異性抗原Rv2175c固載在電極表面；最后用牛血清白蛋白來封閉沒有被結(jié)核菌特異性抗原Rv2175c占據(jù)的納米金活性位點；據(jù)的納米金活性位點；亞甲基藍(起氧化還原探針的作用)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學免疫傳感器，其特征是，所述結(jié)核菌特異性抗原 Rv2175c是通過以下方式制備獲得(1)克隆結(jié)核分枝桿菌H37Rv中Rv2175c基因；其利用的引物對是271 (5，-AGCCTAGGATCCATGCCTGGCC-3，)和 2715b (5，-GAGAAGCTTCTGCAACCCCGGT-3，)；, 將開放閱讀框Rv2175c從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增出來；將擴增產(chǎn)物用BamHI 和HindIII進行酶切，連接到經(jīng)過相同內(nèi)切酶酶切的pET28a質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒 pET28a-rv2175c ；(2)Rv2175c編碼蛋白的表達及純化將重組質(zhì)粒pET28a-rV2175c轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌 BL-21 (DE3)，進行表達和純化，得到結(jié)核菌特異性抗原Rv2175c。
全文摘要
用于結(jié)核病血清學診斷的特異電化學免疫傳感器，屬于重要傳染病防治領(lǐng)域。免疫傳感器是將免疫測定法與高靈敏的傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型生物傳感器，應(yīng)用于痕量免疫原性物質(zhì)的分析研究。基于前期的抗原標記篩選工作，選定結(jié)核分枝桿菌Rv2175c基因編碼蛋白(下稱特異性抗原)作為特異性抗原，構(gòu)建高靈敏度電化學免疫傳感器,通過檢測人體血清中對應(yīng)該特異抗原的抗體而實現(xiàn)結(jié)核病血清學診斷。方法如下⑴克隆結(jié)核分枝桿菌H37Rv中Rv2175c基因；⑵在大腸桿菌中異源表達純化特異性抗原；⑶利用特異抗原在兔子中制備抗體血清作為陽性對照；⑷制備電化學免疫傳感器；⑸健康人和結(jié)核病人血清檢測。通過免疫傳感器電流變化差異，該免疫傳感器能很好的將健康人和結(jié)核病患者區(qū)分開，達到血清學診斷目的。
文檔編號C12N15/31GK102192984SQ201110056230
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者周培富, 袁亞利, 袁若, 謝建平 申請人:西南大學