用于結(jié)核病診斷的蛋白以及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于結(jié)核病診斷的蛋白以及試劑盒。具體地，本發(fā)明涉及一種分離的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示。本發(fā)明的蛋白可以作為作為細(xì)胞水平的結(jié)核病免疫診斷分子標(biāo)識(shí)，具有良好的符合率和反應(yīng)強(qiáng)度。
【專利說明】用于結(jié)核病診斷的蛋白以及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于結(jié)核病診斷的蛋白以及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核分枝桿菌是對(duì)人類健康威脅最大的病原體之一，結(jié)核病是當(dāng)今世界上成年人中的主要傳染病，已對(duì)國(guó)際公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。結(jié)核菌在感染人體以后，多處于潛伏狀態(tài)或持續(xù)感染狀態(tài)，它能在感染宿主細(xì)胞內(nèi)逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主達(dá)到一種微妙的平衡，感染者一生中的任何時(shí)候都有可能發(fā)病。一般情況下，10%的感染者將發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。一個(gè)未經(jīng)治療的活動(dòng)性肺結(jié)核病人，一年能傳染10 - 15人。
[0003]近五十年來(lái)，結(jié)核病的控制理論與技術(shù)、臨床診斷治療水平與研究均有長(zhǎng)足的進(jìn)步。由于有效化療藥物(異煙肼、利福平、吡嗪酰銨、鏈霉素、乙胺丁醇等)的普遍應(yīng)用和卡介苗在世界范圍的推廣，使得結(jié)核病的發(fā)病率曾一度降低，以至于人們樂觀地認(rèn)為，結(jié)核病將同天花一樣被人類徹底消滅。但在八十年代中期，由于過分樂觀的估計(jì)形勢(shì)，減少投資、縮減機(jī)構(gòu)，放松對(duì)結(jié)核病的治療與管理，結(jié)核病又在許多國(guó)家死灰復(fù)燃，發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)再次回升。1993年WHO宣布結(jié)核病處于“全球緊急狀態(tài)”，并呼吁“迅速采取行動(dòng)與結(jié)核病危機(jī)進(jìn)行斗爭(zhēng)”，這在WHO歷史上發(fā)表這樣的聲明尚屬首次。耐藥及耐多藥結(jié)核病也已成為當(dāng)前結(jié)核病控制工作中的重大威脅。
[0004]在常用的肺結(jié)核診斷技術(shù)中存在著陽(yáng)性率低、周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、假陽(yáng)性率高等問題。故此需要一種快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異的診斷方法。
[0005]目前結(jié)核病毒診斷方法有:(一)痰菌檢查:痰涂菌檢查和痰結(jié)核菌檢查簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確性較高，痰中查出結(jié)核菌，就能確診患了結(jié)核病。一般初次就診要查三個(gè)痰標(biāo)本，即夜間痰、清晨痰和即時(shí)痰。它雖然是診斷肺結(jié)核“金指標(biāo)”但診斷率低，培養(yǎng)周期長(zhǎng)。痰結(jié)核菌培養(yǎng)，結(jié)果可信度高，并能做結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)，但需時(shí)6 - 8周，應(yīng)用受到限制。(二)X射線檢查:胸部X線檢查可以早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病，而且可以確定病灶的部位、性質(zhì)、范圍，了解發(fā)病情況及用于治療效果的判斷，并且開展方便，病人樂于接受。胸部CT可以發(fā)現(xiàn)較小的或隱蔽部位的病變，可以彌補(bǔ)一般X線檢查的不足。但容易與其他肺部疾病混淆，需要專業(yè)醫(yī)生確證。(三)肺結(jié)核病免疫學(xué)診斷:1.常用的有結(jié)核菌素純蛋白衍化物(PPD)試驗(yàn)，該試驗(yàn)陽(yáng)性是感染過結(jié)核菌的證據(jù)之一，但是假陽(yáng)性率高，容易誤診。2.血中、痰中結(jié)核抗體檢測(cè)陽(yáng)性也有助于診斷，也容易出現(xiàn)假陽(yáng)率。3.BACTEC法測(cè)結(jié)核分枝桿菌的代謝物，一般兩周可分離出分枝桿菌，但菌量多少能影響陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的天數(shù)。5.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，優(yōu)點(diǎn)是敏感性可達(dá)98% — 100%，缺點(diǎn)是特異性較差。(四)其他檢查:只能作為輔助診斷，不能作為診斷依據(jù)。1.纖維支氣管鏡檢查，可以直接觀察或間接判斷支氣管、肺內(nèi)病變，并且有活組織檢查、灌洗、錄像、拍攝氣管內(nèi)照片等功能，對(duì)于診斷和鑒別診斷特別有用。2.胸腔鏡和縱隔鏡檢查，均可用于觀察胸腔、縱隔內(nèi)腫大淋巴結(jié)，并可取出活組織檢查以利診斷和鑒別診斷。3.超聲波檢查，主要用`于胸腔積液的診斷和鑒別診斷。[0006]結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)物濾液中有一種早期分泌抗原革巴蛋白(early secretoryantigenic target，ESAT-6)，GenBank 登錄號(hào)為:NC_00962，g1: 15608177，相對(duì)分子質(zhì)量為6000，在MTB感染早期即可被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，是重要的T細(xì)胞抗原抗原。ESAT-6來(lái)源的合成多肽被廣泛地用于外周血MTB特異性Y-干擾素(IFN-Y)應(yīng)答情況的檢測(cè)，臨床上用于診斷是否有MTB感染指標(biāo)之一 [Ravn P.Munk ME.Andersen AB Prospectiveevaluation ofa whole—blood test using Mycobacterium tuberculosis-specificantigens ESAT_6and CFP-1Ofor diagnosis of active tuberculosis2005 ；HarbceM.0etteinger T.Wiker HG Evidence for oceurrence of the ESAT-6protein inMycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absencein Mycabacterium bovis BCG1996 ；Zhang, Μ., H.Wang, M.Liao, et al.(2010)."Diagnosisof latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinatedsubjects in China by interferon-gamma ELISpot assay.〃Int J Tuberc LungDisl4(12):1556-1563.]o
[0007]盡管如此，目前尚需要發(fā)現(xiàn)新的診斷結(jié)核病或者檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)識(shí)，以及新的檢測(cè)診斷結(jié)核病或者檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法和試劑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一類蛋白，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的蛋白能夠作為診斷結(jié)核病或者檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)識(shí)，并且其具有良好的敏感性和特異性。由此提供了下述發(fā)明:
[0009]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種分離的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1 (本發(fā)明中有時(shí)稱為Rvll98)或SEQ ID NO:2 (本發(fā)明中有時(shí)稱為Rv2016)所示。所述蛋白為用于結(jié)核病診斷或結(jié)核桿菌檢測(cè)的蛋白。
[0010]Rvl 198的氨基酸序列:86aa
[0011 ] MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYE (SEQ ID NO:1)
[0012]Rv2016的氨基酸序列:180aa
[0013]FLAALVGTIRDTRFDIADMRNWRPGWFPTMHSRCLSNLIHDRIWAHLVTLIASNPGTSIKDKGATREIVVGAHLRLRIKRHHA⑶EISTYPTRTAIEFWQQGSQPAFPGLEEVRIAVGYRWDPDTREIGAPLLSLRDGKDHVIWWELDEPAAGVKITWTPIEPTLPSIDFGDLGEDSGA (SEQ ID NO:2)
[0014]本發(fā)明的另一方面一種分離的核苷酸，其編碼本發(fā)明的蛋白；具體地，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
[0015]Rvl 198的核苷酸序列(讀碼框):258bp
[0016]ATG ACC ATC AAC TAT CAA TTC GGG GAT GTC GACGCT CAC GGC GCC ATG ATC CGCGCT CAG GCC GGG TTGCTG GAG GCC GAG CAT CAG GCC ATC ATT CGT GAT GTGTTG ACC GCGAGT GAC TTT TGG GGC GGC GCC GGT TCGGCG GCC TGC CAG GGG TTC ATT ACC CAG TTG GGCCGTAAC TTC CAG GTG ATC TAC GAG CAG GCC AAC GCC CACGGG CAG AAG GTG CAG GCT GCCGGC AAC AAC ATG GCGCAA ACC GAC (SEQ ID NO:3)
[0017]Rv2016的核苷酸序列(讀碼框):540bp[0018]TTC CTT GCT GCT CTT GTT GGC ACC ATC AGG GATACG CGC TTC GAC ATC GCC GACATG CGG AAC TGG CGGCCG GGA TGG TTT CCG ACC ATG CAT AGC CGG TGT CTGTCC AAC CTCATC CAC GAC AGA ATC TGG GCA CAC CTGGTC ACC CTC ATC GCG AGC AAT CCA GGC ACC AGCATCAAG GAC AAG GGT GCC ACC CGC GAG ATT GTG GTT GGCGCA CAC CTG CGG TTG CGA ATCAAA CGC CAC CAC GCAGGT GAC GAG ATC AGC ACC TAC CCG ACC CGA ACC GCCATC GAA TTCTGG CAA CAG GGC AGC CAG CCC GCC TTCCCG GGG CTG GAA GAG GTT CGC ATT GCG GTG GGCTAT CGG TGG GAC CCT GAT ACC CGC GAG ATC GGA GCC CCCCTG CTG TCG CTT CGC GAC GGGAAA GAT CAC GTC ATCTGG GTA GTC GAA CTC GAC GAG CCT GCG GCC GGC GTGAAG ATC ACCTGG ACC CCG ATC GAG CCG ACA CTA CCGTCC ATC GAC TTC GGT GAC TTG GGT GAA GAC TCTGGAGCA (SEQ ID NO:4)[0019]Rvl 198和Rv2016的讀碼框的核苷酸序列可以由實(shí)施例1或2中的相應(yīng)的質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物測(cè)序得到，并可進(jìn)一步根據(jù)讀碼框核苷酸序列推知編碼的氨基酸序列。當(dāng)然，上述的讀碼框的核苷酸序列也可以通過人工合成得到。所述蛋白可以通過將讀碼框序列通過合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞得到。
[0020]本發(fā)明的再一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明的核苷酸。
[0021 ] 本發(fā)明的再一方面涉及一種重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明的重組載體。
[0022]本發(fā)明的再一方面涉及一種引物對(duì)，其包含SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示的核苷酸序列，和/或包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。具體地，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示，和/或如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示。
[0023]本發(fā)明的再一方面涉及一種抗體，其能夠與本發(fā)明的蛋白(Rvl 198和/或Rv2016)特異性結(jié)合；具體地，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；具體地，所述抗體連接有可檢測(cè)的標(biāo)記物。
[0024]所述多克隆抗體或單克隆抗體可以參照本領(lǐng)域人員知悉的方法制備。
[0025]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”具有免疫學(xué)的一般含義，例如抗原抗體間的結(jié)合。
[0026]本發(fā)明的再一方面涉及一種抗體偶聯(lián)物，包括抗體部分和偶聯(lián)部分，其中，所述抗體部分為本發(fā)明的抗體，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、脂類、和生物素中的一種或多種
[0027]本發(fā)明的再一方面涉及一種組合物，其含有本發(fā)明的蛋白(Rvll98和/或Rv2016)、本發(fā)明的核苷酸、本發(fā)明的重組載體、本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞、本發(fā)明的引物對(duì)、本發(fā)明的抗體、或者本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物；可選地，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑；具體地，所述組合物為疫苗組合物，并且所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑為疫苗用載體或賦形劑。
[0028]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“疫苗用載體或賦形劑”是指選自如下物質(zhì)的一種或多種，包括但不限于:pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、佐劑、離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。具體地，例如，pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括但不限于陽(yáng)離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。其中，非離子型表面活性劑包括但不限于:Tween-80。佐劑包括但不限于氫氧化鋁，氟氏完全佐劑。離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。
[0029]本發(fā)明的再一方面涉及一種試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物、或者本發(fā)明的引物對(duì)；具體地，所述試劑盒為用于診斷結(jié)核病特別是肺肺結(jié)核或者檢測(cè)結(jié)核桿菌的試劑盒。
[0030]本發(fā)明的再一方面涉及一種篩選藥物的模型，其包含本發(fā)明的蛋白(Rvll98和/或Rv2016)或者本發(fā)明的核苷酸；具體地，所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為抗結(jié)核桿菌的藥物。
[0031 ] 例如，可以通過被篩選的藥物是否能夠檢測(cè)本發(fā)明的蛋白(Rvl 198和/或Rv2016)或者本發(fā)明的核苷酸，來(lái)判斷被篩選的藥物是否能夠用作診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為抗結(jié)核桿菌的藥物。
[0032]本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的蛋白或者本發(fā)明的核苷酸在制備或者作為篩選藥物的模型中的用途，具體地，所述所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物。
[0033]本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的蛋白(Rvll98和/或Rv2016)、本發(fā)明的核苷酸、本發(fā)明的重組載體、本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞、本發(fā)明的引物對(duì)、本發(fā)明的抗體或者本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物在制備診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物(包括但不限于疫苗)或者制備檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物中的用途。
[0034]本發(fā)明的再一方面涉及一種在體內(nèi)或體外檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法，包括使用本發(fā)明的抗體或者本發(fā)明的引物對(duì)的步驟；具體地，所述方法為抗原檢測(cè)方法(例如western blot或者ELISA)或者PCR法。一種在體內(nèi)或體外檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法，其為ELISP0T法。檢測(cè)的樣本包括但不限于:被檢測(cè)者的痰液、血液、組織、淋巴細(xì)胞、DNA等等。
[0035]本發(fā)明的再一 方面涉及一種診斷結(jié)核病特別是肺結(jié)核的方法，包括使用本發(fā)明的抗體或者本發(fā)明的引物對(duì)的步驟；具體地，所述方法為抗原檢測(cè)方法(例如western blot或者ELISA)或者PCR法。一種診斷結(jié)核病特別是肺結(jié)核的方法，其為ELISP0T法。
[0036]下面還給出了本發(fā)明涉及的部分術(shù)語(yǔ)的解釋。
[0037]表達(dá)載體
[0038]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體?？梢詫⑸鲜龈鞣N核酸和調(diào)控序列連接在一起來(lái)制備重組表達(dá)載體，該載體可以包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)，以便在這些位點(diǎn)插入或取代編碼本發(fā)明的蛋白或抗體的核酸序列。或者，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達(dá)載體而表達(dá)本發(fā)明所述核酸序列。制備表達(dá)載體時(shí)，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。
[0039]重組表達(dá)載體可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作并表達(dá)核酸序列的載體(例如質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。
[0040]載體可以是自主復(fù)制型載體(即存在于染色體外的完整結(jié)構(gòu)，可獨(dú)立于染色體進(jìn)行復(fù)制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保證自我復(fù)制的任何機(jī)制?；蛘?，載體是一個(gè)當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，將整合到基因組中并與所整合到的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可應(yīng)用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或總體包含將導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
[0041]優(yōu)選本發(fā)明所述載體含有一個(gè)或多個(gè)便于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是這樣一個(gè)基因，其產(chǎn)物賦予對(duì)殺生物劑或病毒的抗性、對(duì)重金屬的抗性，或賦予營(yíng)養(yǎng)缺陷體原養(yǎng)型等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因,或者抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的抗性標(biāo)記。
[0042]優(yōu)選本發(fā)明所述載體包含能使載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中，或保證載體在細(xì)胞中獨(dú)立于細(xì)胞基因組而進(jìn)行自主復(fù)制的元件。
[0043]就進(jìn)行自主復(fù)制的情況而言，載體還可以包含復(fù)制起點(diǎn)，使載體能在目標(biāo)宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以帶有使其在宿主細(xì)胞中成為溫度敏感型的突變(參見例如，fEhrlich, 1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)75:1433)。
[0044]可以向宿主細(xì)胞插入一個(gè)以上拷貝的本發(fā)明核酸序列以提高該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。該核酸序列的拷貝數(shù)增加可以通過將該序列的至少一個(gè)附加拷貝插入宿主細(xì)胞基因組中，或者與該核酸序列一起插入一個(gè)可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記，通過在有合適選擇試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞，挑選出含有擴(kuò)增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細(xì)胞。
[0045]用于連接上述各元件來(lái)構(gòu)建本發(fā)明所述重組表達(dá)載體的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見例如SambiOOk等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)。[0046]宿主細(xì)胞
[0047]本發(fā)明還涉及包含可用來(lái)重組生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白或抗體的本發(fā)明所述核酸序列(多核苷酸)的重組宿主細(xì)胞?？蓪景l(fā)明之核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使該載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于本發(fā)明的蛋白或抗體編碼基因及其來(lái)源。
[0048]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
[0049]制備方法
[0050]本發(fā)明還涉及重組制備本發(fā)明本發(fā)明的蛋白或抗體的方法，該方法包括:(a)在適于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白或抗體的條件下，培養(yǎng)含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼所述本發(fā)明的蛋白或抗體的核酸序列；和(b)回收該肽。
[0051]在本發(fā)明所述制備方法中，用本領(lǐng)域已知方法在合適本發(fā)明的蛋白或抗體產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許本發(fā)明的蛋白或抗體表達(dá)和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳源和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商提供或者可以參照公開的組成(例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)來(lái)制備。如果本發(fā)明的蛋白或抗體被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收。如果本發(fā)明的蛋白或抗體不分泌，可以從細(xì)胞裂解物中回收。
[0052]可以用本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的本發(fā)明的蛋白或抗體。例如，可以通過常規(guī)操作(包括，但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收。
[0053]可以通過各種本領(lǐng)域已知的操作來(lái)純化本發(fā)明所述本發(fā)明的蛋白或抗體，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、HPLC、電泳(例如，制備性等電點(diǎn)聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(例如參見，蛋白質(zhì)純化,J.C.Janson和Lars Ryden編，VCHPublishers, New York, 1989)。
[0054]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“結(jié)核桿菌”，包括但不限于，例如，結(jié)核分枝桿菌；術(shù)語(yǔ)“結(jié)核分枝桿菌”包括但不限于，結(jié)核分枝桿菌H37Rv。
[0055]發(fā)明的有益效果
[0056]本發(fā)明的蛋白可以作為作為結(jié)核病(例如肺結(jié)核)或結(jié)核桿菌細(xì)胞免疫診斷分子標(biāo)識(shí)，具有良好的符合率和反應(yīng)強(qiáng)度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0057]圖1:Rv2127-Rv2234基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，泳道M表示DNA marker(DL2000:2000,1000，750，500，250，IOObp);泳道 2 為 Rvl 198 ;泳道 3 為 Rv2016。
[0058]圖2:表達(dá)后Rvl 198和Rv2017的PAGE。其中，泳道M表示蛋白marker，泳道4為Rv2016，泳道 6 為 Rvll98。
[0059]圖3:蛋白純化結(jié)果。其中，泳道M表示蛋白marker ;泳道I為Rv2016 ;泳道2為Rvll98。
[0060]圖4:1160個(gè)蛋白的ELISP0T初篩鑒定結(jié)果分布圖。其中，白色小星為Rvll98的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度，黑色小星為Rv2016的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度。
[0061]圖5:10個(gè)蛋白的ELISP0T鑒定部分結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0062]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0063]實(shí)施例1:MTB H37Rv的相關(guān)基因的克隆和表達(dá)(Gateway法)
[0064]Invitrogen公司的Gateway技術(shù)為蛋白的重組和表達(dá)提供了一種可能，它是從PCR產(chǎn)物開始創(chuàng)建Gateway?入門克隆。這種方法是通過合并attB位點(diǎn)到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pDONR?(包含attP位點(diǎn))以及Gateway? BP Clonase?酶混合物。接著轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中，將會(huì)獲得包含目的基因的入門克隆，同時(shí)目的基因兩側(cè)具有attL重組位點(diǎn)。這個(gè)入門克隆可以與Gateway?目的載體pDEST17進(jìn)行重組表達(dá)，快速高效得到目的蛋白[Walhout AJ, Temple GF, Brasch MA.etal.GATEWAY recombinationalcloning:application to the cloning of large numbers of open reading framesor ORFeomes.Methods Enzymolj.2000，328:575-592 ;RachaeI M.GoIdstone，NicoleJ.Moreland, Ghader Bashirijetal.A new Gateway_vector and expression protocolfor fast and efficient recombinant protein expression in Mycobacteriumsmegmatis.Protein Expression and Purification57(2008) 81 - 87 ；A high throughputscreen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophilaembryogenesis.PNAS1998;95;9973-9978.]。
[0065]本實(shí)驗(yàn)以于MTB H37Rv的基因組為模板,利用Invitrogen公司提供的Gateway技術(shù)，表達(dá)全部ORF編碼的蛋白質(zhì),經(jīng)過western blot方法檢測(cè)臨床血衆(zhòng)獲得具有較高敏感性特異性抗原，為臨床診斷、疾病治療、預(yù)防控制提供堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0066]一、實(shí)驗(yàn)方法
[0067]1.基因序列的獲取
[0068]根據(jù)已經(jīng)公開的MTB H37Rv的ORFs基因序列，用Primer designer設(shè)計(jì)引物序列，按照Gateway系統(tǒng)的引物設(shè)計(jì)方案，為引物序列添加attB臂，由北京新擎科公司完成引物的合成。
[0069]其為正向引物臂為:
[0070]GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC (SEQ ID NO:5)；
[0071]反向引物臂為:
[0072]GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA (SEQ ID NO:6)。
[0073]共完成引物設(shè)計(jì)3535對(duì)，因篇幅所限，部分引物如下面的表1所示。
[0074]表1:部分合成引物(不含att臂的部分) [0075]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.一種分離的核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的蛋白；具體地，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 所示。
3.一種重組載體，其含有權(quán)利要求2所述的核苷酸。
4.一種重組宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.一種引物對(duì)，其包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，和/或包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
6.一種抗體，其能夠與權(quán)利要求1所述的蛋白特異性結(jié)合；具體地，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；具體地，所述抗體連接有可檢測(cè)的標(biāo)記物。
7.一種抗體偶聯(lián)物，包括抗體部分和偶聯(lián)部分，其中，所述抗體部分為權(quán)利要求6所述的抗體，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、月旨類、和生物素中的一種或多種。
8.一種組合物，其含有權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2所述的核苷酸、權(quán)利要求3所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的引物對(duì)、權(quán)利要求6所述的抗體或者權(quán)利要求7所述的抗體偶聯(lián)物；可選地，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑；具體地，所述組合物為疫苗組合物，并且所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑為疫苗用載體或賦形劑。
9.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求6所述的抗體、權(quán)利要求7所述的抗體偶聯(lián)物、或者權(quán)利要求5所述的引物對(duì)；具體地，所述試劑盒為用于診斷結(jié)核病特別是肺肺結(jié)核或者檢測(cè)結(jié)核桿菌的試劑盒。`
10.一種篩選藥物的模型，其包含權(quán)利要求1所述的蛋白或者權(quán)利要求2所述的核苷酸；具體地，所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為抗結(jié)核桿菌的藥物。
11.權(quán)利要求1所述的蛋白或者權(quán)利要求2所述的核苷酸在制備或者作為篩選藥物的模型中的用途，具體地，所述所述藥物為診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物或者為檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物。
12.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2所述的核苷酸、權(quán)利要求3所述的重組載體、權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞、權(quán)利要求5所述的引物對(duì)、權(quán)利要求6所述的抗體或者權(quán)利要求7所述的抗體偶聯(lián)物在制備診斷和/或治療和/或預(yù)防和/或輔助治療結(jié)核病特別是肺結(jié)核的藥物(包括但不限于疫苗)或者制備檢測(cè)結(jié)核桿菌或抗結(jié)核桿菌的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103864907SQ201210549696
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】劉立國(guó), 金奇, 張笑冰, 張維佳 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所