促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基及其制備方法。該促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基，包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly(I:C)，且所述TLR3激動劑Poly(I:C)在所述促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25μg/ml。上述培養(yǎng)基在配制的RPMI?1640完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加了TLR3激動劑Poly(I:C)，并使其在培養(yǎng)基中的最終濃度控制在每毫升25微克，不僅能通過促進(jìn)B細(xì)胞增殖來促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長，同時也可以通過促進(jìn)B細(xì)胞分泌特異性抗體這一特性來促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞分泌所需單克隆抗體。
【專利說明】促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法，更具體地說涉及的是一種能夠為雜交瘤細(xì)胞提供更好的生長條件的培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單克隆抗體以其高度的特異性和靈敏度，在免疫學(xué)檢測、目的蛋白的親和純化和腫瘤治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)是生產(chǎn)單克隆抗體過程中極為重要的一個環(huán)節(jié)，但是，用該技術(shù)制備單克隆抗體，其實驗環(huán)節(jié)多，周期長，影響因素復(fù)雜，容易遭受挫折。尤其是在雜交瘤產(chǎn)生早期，由于新出現(xiàn)的雜交瘤生活力差，其生長情況容易因環(huán)境的變化而變化，不能很好地適應(yīng)體外組織培養(yǎng)條件，很容易夭折。即便獲得了生長良好的雜交瘤細(xì)胞，也可能會因為雜交瘤細(xì)胞不能分泌特異性抗體而導(dǎo)致實驗失敗。因此，在現(xiàn)有條件下增強新生成的雜交瘤細(xì)胞生長能力，提高雜交瘤細(xì)胞的克隆化效率及抗體產(chǎn)量就顯得十分必要了。
[0003]現(xiàn)有的培養(yǎng)基只注重了對雜交瘤細(xì)胞生長的促進(jìn)作用，并沒有做到同時加強雜交瘤細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，且配制方法較為復(fù)雜，操作不夠簡便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于此，有必要提供一種既促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞生長，又促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞分泌所需單克隆抗體的培養(yǎng)基及其制備方法。
[0005]—種促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基，包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly (1:C)，且所述TLR3激動劑Poly (1: C)在所述促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25 μ g/ml。
[0006]一種促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:
[0007]制備1640完全培養(yǎng)基；及
[0008]往所述1640完全培養(yǎng)基中加入TLR3激動劑Poly(I = C)，并使所述TLR3激動劑Poly (1: C)的終濃度為 25 μ g/ml。
[0009]在其中一個實施例中，所述制備1640完全培養(yǎng)基的方法包括:
[0010]將10.4克RPMI 1640干粉，3.574克4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2克碳酸氫鈉粉末用900毫升去離子水溶解，將pH值調(diào)至7.0后定容到1000毫升，在生物安全柜中用0.22微米濾膜過濾除菌后分裝待用，即為1640無血清培養(yǎng)基；
[0011]取79毫升1640無血清培養(yǎng)基，加入20毫升胎牛血清，再加入I毫升雙抗溶液，即為1640完全培養(yǎng)基。
[0012]上述培養(yǎng)基在配制的RPMI 1640完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加了 TLR3激動劑Poly (1:C),并使其在培養(yǎng)基中的最終濃度控制在每毫升25微克，不僅能通過促進(jìn)B細(xì)胞增殖來促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長，同時也可以通過促進(jìn)B細(xì)胞分泌特異性抗體這一特性來促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞分泌所需單克隆抗體?！揪唧w實施方式】
[0013]雜交瘤細(xì)胞是B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的，同時擁有B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的特性。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)是生產(chǎn)單克隆抗體過程中的一個重要技術(shù)，但是，用該技術(shù)制備單克隆抗體，其實驗環(huán)節(jié)多，周期長，影響因素復(fù)雜，容易遭受挫折。尤其是在雜交瘤產(chǎn)生早期，由于新出現(xiàn)的雜交瘤尚未適應(yīng)體外組織培養(yǎng)條件，很容易夭折或不能很好地分泌特異性抗體。
[0014]針對上述問題，本實施例在配制的RPMI 1640完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加終濃度為每毫升25微克的TLR3激動劑Poly (1:C)，不僅能通過促進(jìn)B細(xì)胞增殖來促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長，同時也可以通過促進(jìn)B細(xì)胞分泌特異性抗體這一特性來促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞分泌所需單克隆抗體。
[0015]本實施例的促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基，包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly (1:C)，且所述TLR3激動劑Poly (1: C)在所述促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25 μ g/ml。
[0016]TLR3(Toll樣受體3)是To ll樣受體家族成員之一，它能夠特異性識別病毒的雙鏈RNA及其類似物Poly (1: C)。已有研究表明，體內(nèi)多種免疫細(xì)胞均可表達(dá)TLR3，而Poly (1: C)作為TLR3的激動劑，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的生長增殖及抗原呈遞功能。并且，在無特異性抗原刺激的情況下，TLR3激動劑Poly (1:C)能夠直接誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgGl κ抗體。雜交瘤細(xì)胞是B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的，同時擁有B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的特性，促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化以及特異性抗體的產(chǎn)生，對促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長以及抗體產(chǎn)生有著很有益的作用。
[0017]上述促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:
[0018]步驟S100、制備1640完全培養(yǎng)基。
[0019]其中，制備1640完全培養(yǎng)基的方法包括:
[0020]步驟S110、將10.4克RPMI 1640干粉(購自Gibco公司)，3.574克分析純4_羥乙基哌嗪乙磺酸(購自Sigma公司)，2克分析純碳酸氫鈉粉末(購自上海生工)用900毫升去離子水溶解，將PH值調(diào)至7.0后定容到1000毫升，在生物安全柜中用0.22微米濾膜過濾除菌后分裝待用，即為1640無血清培養(yǎng)基。
[0021]步驟S120、取79毫升1640無血清培養(yǎng)基，加入20毫升胎牛血清(購自Gibco公司)，再加入I毫升雙抗溶液(青霉素及鏈霉素溶液)(100X )(購自Hyclone公司)，即為1640
完全培養(yǎng)基。
[0022]步驟S200、往所述1640完全培養(yǎng)基中加入TLR3激動劑Poly (1:C)，并使所述TLR3激動劑Poly (1: C)的終濃度為25 μ g/ml。
[0023]向上述配制好的每100毫升1640完全培養(yǎng)基中加入2.5毫克TLR3激動劑Poly(IiC)(購自Sigma公司)，使TLR3激動劑Poly(I = C)的終濃度為每毫升25微克，即為可促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基。以下用Poly (1:C)-1640命名配制成的該培養(yǎng)基。
[0024]本發(fā)明的培養(yǎng)基配制方法簡單，所需試劑容易獲得，使用方便。
[0025]以下為性能測試部分:
[0026]下列測試是以Poly (1: C)-1640培養(yǎng)基與常規(guī)1640完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)克隆細(xì)胞上進(jìn)行的比較。[0027]I) BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液的制備
[0028]取12周齡的BALB/c小鼠，拉頸法處死，于70%乙醇水溶液中浸泡10分鐘。在超凈工作臺的解剖盤中打開腹部皮膚，暴露出腹膜，向腹腔中注入10毫升的1640完全培養(yǎng)基，按摩腹部f 2分鐘后，用注射器抽出腹腔液，以每毫升2X 105個細(xì)胞的密度加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50微升腹腔巨噬細(xì)胞懸液。
[0029]2)將本發(fā)明的Poly (1:C)-1640培養(yǎng)基和常規(guī)1640完全培養(yǎng)基以每孔50微升的量加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每種培養(yǎng)基設(shè)置48個孔。
[0030]3)將處于對數(shù)生長期的鼠抗人IgG單克隆抗體分泌細(xì)胞和鼠抗人⑶4單克隆抗體分泌細(xì)胞分別用Poly (1: C)-1640培養(yǎng)基和常規(guī)1640完全培養(yǎng)基稀釋到每毫升20個，然后分別加入到含相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，每孔50微升，置于37攝氏度5% 二氧化碳條件下培養(yǎng)。每種細(xì)胞設(shè)置24個孔。
[0031]4)分別于第6天和第9天時每孔更換50微升相同培養(yǎng)基，到第12天時檢測克隆大小和分泌鼠抗人IgG單克隆抗體和鼠抗人CD4單克隆抗體的克隆細(xì)胞孔上清的效價。以相同培養(yǎng)條件下有克隆細(xì)胞生長孔細(xì)胞集落直徑(平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)和抗體效價(OD45tl)作為判斷依據(jù)。
[0032]效果比較
[0033]比較結(jié)果如表1和表2所示。
[0034]表1
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基,其特征在于,包括1640完全培養(yǎng)基和添加在所述1640完全培養(yǎng)基中的TLR3激動劑Poly (1:C)，且所述TLR3激動劑Poly (1: C)在所述促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基中的濃度為25μ g/ml。
2.一種促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 制備1640完全培養(yǎng)基；及 往所述1640完全培養(yǎng)基中加入TLR3激動劑Poly (1: C)，并使所述TLR3激動劑Poly (1: C)的終濃度為 25 μ g/ml。
3.如權(quán)利要求2所述的促進(jìn)雜交瘤生長的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述制備1640完全培養(yǎng)基的方法包括: 將10.4克RPMI 1640干粉，3.574克4-羥乙基哌嗪乙磺酸，2克碳酸氫鈉粉末用900毫升去離子水溶解，將PH值調(diào)至7.0后定容到1000毫升，在生物安全柜中用0.22微米濾膜過濾除菌后分裝待用，即為1640無血清培養(yǎng)基； 取79毫升1640無血清培養(yǎng)基，加入20毫升胎牛血清，再加入I毫升雙抗溶液，即為1640完全培養(yǎng)基。`
【文檔編號】C12N5/20GK103865879SQ201210548315
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月17日
【發(fā)明者】萬曉春, 張茜, 金言, 阮慶國 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院