專利名稱：一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物新材料，更具體地，涉及一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
培養(yǎng)基是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽以及維生素和水等；有的培養(yǎng)基還含有抗菌素和色素，用于單種微生物培養(yǎng)和鑒定；基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加血清、抗生素等物質(zhì)后，叫做完全培養(yǎng)基也叫細(xì)胞培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基根據(jù)添加血清量的多少，又分為細(xì)胞生長培養(yǎng)基和細(xì)胞維持培養(yǎng)基。細(xì)胞維持培養(yǎng)基是維持細(xì)胞緩慢生長或不死的培養(yǎng)基，血清含量比較少，一般細(xì)胞因缺少生長因子不能增殖，生長緩慢，但是發(fā)生轉(zhuǎn)化或者癌細(xì)胞因自身有產(chǎn)生促生長增殖因子的能力，在血清缺少情況下仍能生長，所以維持培養(yǎng)基可用于選擇發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在現(xiàn)有技術(shù)中，在細(xì)小病毒維持工藝中，一般使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在使用時(shí)需要輔以血清，這種培養(yǎng)基主要針對細(xì)胞的存活與增殖，并未特意弱化細(xì)胞對病毒的抵抗力和高比例防腐劑滅活劑添加對最終產(chǎn)品的副作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基及其制備方法，優(yōu)化了維持病毒時(shí)維持培養(yǎng)液的配方，本發(fā)明通過增加維持培養(yǎng)液營養(yǎng)成分可以使目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)量更高，通過調(diào)低防腐劑和滅活劑比例減少最終成品副作用。本發(fā)明填補(bǔ)了細(xì)小病毒維持液的配方空白，切實(shí)有效的在細(xì)胞維持階段保持細(xì)胞存活率，并且支持病毒 維持時(shí)的營養(yǎng)狀態(tài)不發(fā)生過抗?fàn)顟B(tài)；通過本發(fā)明的制備方法制成的粉末劑型，增加了產(chǎn)品的存放時(shí)間和降低了產(chǎn)品的存放條件要求?！N粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基，其特征在于，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，由10-30份的氨基酸及其衍生物、2-5份的維生素及其衍生物、40-78份的無機(jī)化合物和15-50份的其它類組成，所述其它類包括5.8-10.4份的PluronicF-68和0.00009-0.00016份的亞油酸凍干粉。優(yōu)選的，所述氨基酸及其衍生物按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括:4.1-8.5份L-色氨酸，0.3-0.6份L-半胱氨酸，0.1-0.3份L-異亮氨酸，0.3-0.5份L-亮氨酸，0.1-0.3份L-纈氨酸，0.2-0.4份L-賴氨酸，0.3-0.8份L-蛋氨酸，0.2-0.4份L-谷氨酸，0.2-0.3份L-苯丙氨酸，0.5-1.3份L-酪氨酸，0.2-0.3份甘氨酸，0.1-0.2份L-脯氨酸，0.1-0.3份L-丙氨酸，0.2-0.3份L-天冬氨酸，0.2-0.4份L-絲氨酸，0.3-0.8份L-蘇氨酸，3.5-6.3份L-谷氨酰胺，0.3-0.7份L-天冬酰胺，0.3-0.6份L-胱氨酸鹽酸鹽，0.2-0.4份L-精氨酸鹽酸鹽，0.5-0.8份L-組氨酸鹽酸鹽。優(yōu)選的，所述無機(jī)化合物按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì),包括:45.6-94.6份氯化鈉,0.5-0.9份六水氯化鎂，0.4-0.8份無水硫酸鎂，0.7-1.6份無水氯化鈣，1.3-2.2份氯化鉀，0.3份-0.6份一水磷酸二氫鈉，0.2-0.3磷酸氫二鈉，0.0007-0.001份七水合硫酸鋅，0.000003-0.000005份五水硫酸銅，0.0007-0.002份九水合硝酸鐵。優(yōu)選的，所述維生素及其衍生物按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括:0.0007-0.001份維生素C， 0.001-0.003g磷酸吡哆醇，0.00009-0.0002份磷酸吡哆醛，0.01-0.03份煙酰胺，0.01-0.03 份鹽酸硫胺素，0.0001-0.0003 份鈷銨素，0.006-0.01 份核黃素，0.02-0.05份葉酸，0.0007-0.002份生物素。制備上述亞油酸凍干粉的方法，包括以下步驟:
(1)將7g亞油酸和Ig氫氧化鈉溶于50ml蒸餾水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化鈉制備成預(yù)凍液Y ；
(2)將步驟(I)所述的預(yù)凍液Y放入真空冷凍干燥機(jī)中，在-36°C下保溫，打開真空冷凍干燥機(jī)的真空裝置，待其真空度到6-7Pa時(shí)，以每小時(shí)2°C的梯度升溫，直至預(yù)凍液Y的共晶點(diǎn);
(3)將步驟(2)中的預(yù)凍液Y，保持溫度lh，2次升華至0°C，待冰點(diǎn)核通透后急速升溫至常溫，常溫保持2h，制得亞油酸凍干粉。一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟:
(I)制備亞油酸凍干粉:將7g亞油酸和Ig氫氧化鈉溶于50ml蒸餾水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化鈉制備成預(yù)凍液Y，再將預(yù)凍液Y放入真空冷凍干燥機(jī)中在_36°C下保溫，打開真空冷凍干燥機(jī)的真空裝置，待其真空度到6-7Pa時(shí)，以每小時(shí)2°C的梯度升溫，直至預(yù)凍液Y的共晶點(diǎn)，然后保持溫度lh，2次升華至0°C，待冰點(diǎn)核通透后急速升溫至常溫，常溫保持2h，制得亞油酸凍干粉。(2)組分制 備:按照重量分別稱取各物質(zhì)，配制成組分A、B、C、D，然后將組分A在鼓風(fēng)恒溫干燥箱65°C下干燥8h，將組分B在鼓風(fēng)恒溫干燥箱80°C下干燥8h，將組分C在鼓風(fēng)恒溫干燥箱40°C下干燥14h，組分D在鼓風(fēng)恒溫干燥箱65°C下干燥IOh ；
(3)成品制備:將上述干燥的組分A、干燥的組分B、干燥的組分C與600-800gPluronicF-68的混合物、干燥的組分D分別裝在球磨機(jī)的四頭缸體中，混合6h,制得四種粒徑小于0.1mm3的中間體A、B、C、D，然后再將上述中間體A、B、C、D在三維運(yùn)動混合機(jī)中進(jìn)行攪拌混合均勻，得到粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明方案，并使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例1:
首先，制備亞油酸凍干粉，具體步驟如下:
(1)將78亞油酸和Ig氫氧化鈉溶于50ml蒸餾水中，配制成溶液Z;然后在溶液Z中添加20g氯化鈉，配制成預(yù)凍液Y ；
(2)將預(yù)凍液Y放入真空冷凍干燥機(jī)的托盤中，關(guān)好設(shè)備艙門，將冷凝溫度調(diào)到-36°C，保持溫度；
(3)將真空度調(diào)至約6-7Pa，開始以每小時(shí)2°C的梯度升溫，直至到達(dá)預(yù)凍液Y的共晶占.(4)保持溫度lh，二次升華至0°C，觀察冰點(diǎn)核情況，冰點(diǎn)核通透后急速升溫至常溫，在常溫下保持2h，凍干亞油酸制成。然后，制備1000L培養(yǎng)基，將配方中的原料分為A、B、C、D四組，按照下列質(zhì)量稱取各組分:
組分A: L-色氨酸450g，L-半胱氨酸37.5g，L-異亮氨酸15g，L-亮氨酸30g，L-纈氨酸16.5g，L-精氨酸鹽酸鹽18.75g，L-組氨酸鹽酸鹽50g，L-賴氨酸22.5g，L-蛋氨酸37.5g, L-谷氨酸25g, L-苯丙氨酸18.75g, L-天冬酰胺31.5g,甘氨酸20g, L-脯氨酸14.25g, L-丙氨酸15g, L-天冬氨酸20g, L-絲氨酸22.5g, L-蘇氨酸37.5g, L-谷氨酰胺390g，L-胱氨酸鹽酸鹽33.75g，L-酪氨酸60g。組分B:六水氯化鎂60g，無水硫酸鎂48g，無水氯化鈣80g，氯化鉀141g，氯化鈉1040g, 一水磷酸二氫鈉32g，磷酸氫二鈉20g，七水合硫酸鋅0.08g,五水硫酸銅0.0003g。組分C:氯化鈉2000g，九水合硝酸鐵0.08g。組分D:氯化鈉2000g，大米水解物800g，丙酮酸鈉105g，還原型谷胱甘肽0.04g,肌醇Sg，次黃嘌呤鈉鹽0.5g，腐胺0.08g,硫辛酸0.08g,亞油酸凍干粉0.0lg，維生素C0.08g，磷酸吡哆醇0.16g，磷酸吡哆醛0.0lg，鈷銨素0.016g，煙酰胺1.6g，核黃素0.7g，鹽酸硫胺素1.6g,氯化膽堿5.6g, D-泛酸 丐2g,葉酸3.2g,生物素0.08g。在鼓風(fēng)恒溫干燥箱中，將組分A以65°C的條件下干燥8h ;將組分B以80°C的條件下干燥8h ;將組分C以40°C的條件下干燥14h ;將組分D以65°C的條件下干燥10h。最后，在球磨機(jī)的四頭缸體分別裝入上述干燥組分A、B、D和干燥組分C與640gPluronic F-68 ;混合6h，產(chǎn)出粒徑小于0.1mm3的中間體A、B、C、D，然后在三維運(yùn)動混合機(jī)中進(jìn)行攪拌混合均勻，制得粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基。

實(shí)施例2:
首先，制備亞油酸凍干粉，步驟與實(shí)施例1中完全相同。然后，配制1000L培養(yǎng)基，將配方中的原料分為A、B、C、D四組，按照下列質(zhì)量稱取各組分:
組分A: L-色氨酸551.25g，L-半胱氨酸43.75g，L-異亮氨酸20g，L-亮氨酸34g，L-纈氨酸19.5g，L-精氨酸鹽酸鹽24.25g，L-組氨酸鹽酸鹽56.25g，L-賴氨酸25.8g，L-蛋氨酸50g, L-谷氨酸28.2g, L-苯丙氨酸21.75g, L-天冬酰胺42g,甘氨酸22.5g,L-脯氨酸16.25g，L-丙氨酸17.5g，L-天冬氨酸22.5g，L-絲氨酸26.25g，L-蘇氨酸49.lg, L-谷氨酰胺438.75g，L-胱氨酸鹽酸鹽39.75g，L-酪氨酸80g。組分B:六水氯化鎂66g，無水硫酸鎂54g，無水氯化鈣100g，氯化鉀155.1g,氯化鈉1170g，一水磷酸二氫鈉40g，磷酸氫二鈉22g，七水合硫酸鋅0.09g,五水硫酸銅0.00033go組分C:氯化鈉2500g，九水合硝酸鐵0.1Ogo組分D:氯化鈉2500g，大米水解物lOOOg，丙酮酸鈉115.5g，還原型谷胱甘肽
0.045g，肌醇IOg,次黃嘌呤鈉鹽0.55g，腐胺0.09g,硫辛酸0.1Og,亞油酸凍干粉0.0llg,維生素C0.09g，磷酸吡哆醇0.20g，磷酸吡哆醛0.011§，鈷銨素0.018g，煙酰胺2.0g，核黃素
0.Hg,鹽酸硫胺素1.8g，氯化膽堿7g，D-泛酸鈣2.2g，葉酸3.6g，生物素0.1Ogo在鼓風(fēng)恒溫干燥箱中，將組分A以65°C的條件下干燥8h ;將組分B以80°C的條件下干燥8h ;將組分C以40°C的條件下干燥14h ;將組分D以65°C的條件下干燥10h。最后，在球磨機(jī)的四頭缸體分別裝入上述干燥組分A、B、D和干燥組分C與720gPluronic F-68 ;混合6h，產(chǎn)出粒徑小于0.1mm3的中間體A、B、C、D，然后在三維運(yùn)動混合機(jī)中進(jìn)行攪拌混合均勻，制得粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基。實(shí)施例3:
首先，制備亞油酸凍干粉，步驟與實(shí)施例1中完全相同。然后，配制1000L培養(yǎng)基，將配方中的原料分為A、B、C、D四組，按照下列質(zhì)量稱取各組分:
組分A: L-色氨酸652.5g，L-半胱氨酸50g，L-異亮氨酸25g，L-亮氨酸37.5g，L-纈氨酸22g，L-精氨酸鹽酸鹽31.25g，L-組氨酸鹽酸鹽62.5g，L-賴氨酸30g，L-蛋氨酸62.5g, L-谷氨酸31.25g, L-苯丙氨酸25g, L-天冬酰胺52.5g,甘氨酸25g, L-脯氨酸19g，L-丙氨酸25g，L-天冬氨酸25g，L-絲氨酸30g，L-蘇氨酸62.5g，L-谷氨酰胺487.5g，L-胱氨酸鹽酸鹽45g，L-酪氨酸100g。組分B:六水氯化鎂72g，無水硫酸鎂60g，無水氯化鈣120g，氯化鉀169.2g，氯化鈉1300g，一水磷酸二氫鈉48g，磷酸氫二鈉24g，七水合硫酸鋅0.1g,五水硫酸銅0.00036g。組分C:氯化鈉3000g，九水合硝酸鐵0.12g。組分D:氯化鈉3000g，大米水解物1200g，丙酮酸鈉126g，還原型谷胱甘肽0.05g,肌醇12g，次黃嘌呤鈉鹽0.6g，腐胺0.lg，硫辛酸0.12g，亞油酸凍干粉0.012g，維生素C0.1g,磷酸吡哆醇0.24g，磷酸吡哆醛0.012g,鈷銨素0.02g,煙酰胺2.4g，核黃素0.84g，鹽酸硫胺素2g,氯化膽堿8.4g, D-泛酸|丐2.4g,葉酸4g,生物素0.12g。

在鼓風(fēng)恒溫干燥箱中，將組分A以65°C的條件下干燥8h ;將組分B以80°C的條件下干燥8h ;將組分C以40°C的條件下干燥14h ;將組分D以65°C的條件下干燥10h。最后，在球磨機(jī)的四頭缸體分別裝入上述干燥組分A、B、D和干燥組分C與SOOgPluronic F-68 ;混合6h，產(chǎn)出粒徑小于0.1mm3的中間體A、B、C、D，然后在三維運(yùn)動混合機(jī)中進(jìn)行攪拌混合均勻，制得粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求所界定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基，其特征在于，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，由10-30份的氨基酸及其衍生物、2-5份的維生素及其衍生物、40-78份的無機(jī)化合物和15-50份的其它類組成，所述其它類包括5.8-10.4份的PluronicF-68和0.00009-0.00016份的亞油酸凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸及其衍生物按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括:4.1-8.5份L-色氨酸，0.3-0.6份L-半胱氨酸，0.1-0.3份L-異亮氨酸，0.3-0.5份L-亮氨酸，0.1-0.3份L-纈氨酸，0.2-0.4份L-賴氨酸，0.3-0.8份L-蛋氨酸，0.2-0.4份L-谷氨酸，0.2-0.3份L-苯丙氨酸，0.5-1.3份L-酪氨酸，0.2-0.3份甘氨酸，0.1-0.2份L-脯氨酸，0.1-0.3份L-丙氨酸，0.2-0.3份L-天冬氨酸，0.2-0.4份L-絲氨酸，0.3-0.8份L-蘇氨酸，3.5-6.3份L-谷氨酰胺，0.3-0.7份L-天冬酰胺，0.3-0.6份L-胱氨酸鹽酸鹽，0.2-0.4份L-精氨酸鹽酸鹽，0.5-0.8份L-組氨酸鹽酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基，其特征在于，所述無機(jī)化合物按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括:45.6-94.6份氯化鈉，0.5-0.9份六水氯化鎂，0.4-0.8份無水硫酸鎂，0.7-1.6份無水氯化鈣，1.3-2.2份氯化鉀，0.3份-0.6份一水磷酸二氫鈉，0.2-0.3磷酸氫二鈉，0.0007-0.001份七水合硫酸鋅，0.000003-0.000005份五水硫酸銅，0.0007-0.002份九水合 硝酸鐵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素及其衍生物按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括:0.0007-0.001份維生素C， 0.001-0.003g磷酸吡哆醇，0.00009-0.0002份磷酸吡哆醛，0.01-0.03份煙酰胺，0.01-0.03份鹽酸硫胺素，0.0001-0.0003 份鈷銨素，0.006-0.01 份核黃素，0.02-0.05 份葉酸，0.0007-0.002 份生物素。
5.制備權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述亞油酸凍干粉的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將7g亞油酸和Ig氫氧化鈉溶于50ml蒸餾水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化鈉制備成預(yù)凍液Y ； (2)將步驟(I)所述的預(yù)凍液Y放入真空冷凍干燥機(jī)中，在-36°C下保溫，打開真空冷凍干燥機(jī)的真空裝置，待其真空度到6-7Pa時(shí)，以每小時(shí)2V的梯度升溫，直至預(yù)凍液Y的共晶點(diǎn); (3)將步驟(2)中的預(yù)凍液Y，保持溫度lh，2次升華至0°C，待冰點(diǎn)核通透后急速升溫至常溫，常溫保持2h，制得亞油酸凍干粉。
6.一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備亞油酸凍干粉:將7g亞油酸和Ig氫氧化鈉溶于50ml蒸餾水中配置成溶液Z，在溶液Z中添加20g氯化鈉制備成預(yù)凍液Y，再將預(yù)凍液Y放入真空冷凍干燥機(jī)中在_36°C下保溫，打開真空冷凍干燥機(jī)的真空裝置，待其真空度到6-7Pa時(shí)，以每小時(shí)2°C的梯度升溫，直至預(yù)凍液Y的共晶點(diǎn)，然后保持溫度lh，2次升華至0°C，待冰點(diǎn)核通透后急速升溫至常溫，常溫保持2h，制得亞油酸凍干粉； (2)組分制備:按照重量分別稱取各物質(zhì)，配制成組分A、B、C、D，然后將組分A在鼓風(fēng)恒溫干燥箱65°C下干燥8h，將組分B在鼓風(fēng)恒溫干燥箱80°C下干燥8h，將組分C在鼓風(fēng)恒溫干燥箱40°C下干燥14h，組分D在鼓風(fēng)恒溫干燥箱65°C下干燥IOh ；(3)成品制備:將上述干燥的組分A、干燥的組分B、干燥的組分C與600-800gPluronicF-68的混合物、干燥的組分D分別裝在球磨機(jī)的四頭缸體中，混合6h,制得四種粒徑小于0.1mm3的中間體A、B、C、D，然后再將上述中間體A、B、C、D在三維運(yùn)動混合機(jī)中進(jìn)行攪拌混合均勻，得到粉末`型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種粉末型細(xì)小病毒維持培養(yǎng)基，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，由10-30份的氨基酸及其衍生物、2-5份的維生素及其衍生物、40-78份的無機(jī)化合物和15-50份的其它類組成，所述其它類包括5.8-10.4份的PluronicF-68和0.00009-0.00016份的亞油酸凍干粉。其制備方法如下(1)制備亞油酸凍干粉；(2)組分制備，按照重量分別稱取各物質(zhì)，配制成組分A、B、C、D，并將這四種組分在鼓風(fēng)恒溫干燥箱中干燥；(3)將上述干燥的組分A、干燥的組分B、干燥的組分C與600-800gPluronicF-68的混合物、干燥的組分D分別裝在球磨機(jī)的四頭缸體中，混合6h，然后再進(jìn)行攪拌混合均勻，得到產(chǎn)品。本發(fā)明通過增加維持培養(yǎng)液營養(yǎng)成分可以使目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)量更高，通過調(diào)低防腐劑和滅活劑比例減少最終成品副作用。
文檔編號C12N7/00GK103184195SQ201310073638
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者張大鶴, 王其樂 申請人:蘇州市沃美生物技術(shù)有限公司