專利名稱：抑制c-MET二聚化的新型抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合人C-Met受體和/或能夠特異性抑制所述受體的酪氨酸激酶活性的新型抗體，特別是鼠的，嵌合的和人源化來源的單克隆抗體，以及編碼這些抗體的氨基酸和核苷酸序列。更具體而言，本發(fā)明所述的抗體能夠抑制C-Met 二聚化。本發(fā)明也包含這些抗體作為藥物在預(yù)防性和/或治療性處理惡性腫瘤或與所述受體過表達(dá)有關(guān)的任何病變中的用途，以及在診斷與C-Met過表達(dá)有關(guān)的疾病的過程中和試劑盒中的用途。本發(fā)明最后包含含有所述抗體聯(lián)合針對在腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移中涉及的其他生長因子的其他抗體和/或化學(xué)化合物，和/或化合物和/或抗惡性腫瘤制劑或與毒素結(jié)合的制劑的產(chǎn)品和/或組合物，以及它們在預(yù)防和/或治療某些惡性腫瘤中的用途。
背景技術(shù)：
已經(jīng)顯示，受體酪氨酸激酶(RTK)靶向劑如曲妥單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗、伊馬替尼和吉非替尼抑制劑有利于以該蛋白質(zhì)類為靶標(biāo)用于治療選定的惡性腫瘤。c-Met是RTK亞家族的原型成員，該亞家族也包括RON和SEA。c_Met RTK家族與其他RTK家族在結(jié)構(gòu)上有區(qū)別并且是肝細(xì)胞生長因子(HGF，也稱離散因子，SF)的唯一已知的高親和性受體[D.P.Bottaro et al, Sciencel991, 251:802-804;L.Naldini et al, Eur.Mol.Biol.0rg.J.1991，10:2867-2878]。c_Met和HGF在多種組織中廣泛表達(dá)，它們的表達(dá)一般分別限定于上皮和間充質(zhì)來源的 細(xì)胞[M.F.Di Renzo et al., 0ncogenel991, 6:1997-2003;E.Sonnenberg et al.，J.Cell.Biol.1993，123:223-235]。兩者對于正常的哺乳動物的發(fā)育都是必需的，并且已經(jīng)表明它們在細(xì)胞遷移、形態(tài)分化和三維管狀結(jié)構(gòu)的組織以及生長和血管發(fā)生中特別重要[RBaldt et al., Naturel995, 376 =768-771; C.Schmidt et a 1., Nature.1995:373:699-702;Tsarfaty et al.,Sciencel994, 263:98-101]。已經(jīng)表明，c-Met和HGF受控制的調(diào)節(jié)在哺乳動物發(fā)育、組織保持和修復(fù)中是重要的[Nagayama T, Nagayama M, Kohara S，Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, ItohJ,Shinohara Y., Brain Res.2004, 5;999(2):155-66;Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, MiyataY, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther.2003, 307 (I):146-51]，它們的失調(diào)涉及到惡性腫瘤的進(jìn)展。c-Met的不適當(dāng)?shù)募せ顚?dǎo)致的異常信號傳導(dǎo)是在人的惡性腫瘤中觀察到的最常見的改變之一，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[Birchmeier et al., Nat.Rev.Mol.CellBiol.2003，4:915-925 ; L.Trusolino 和 Comoglio P.M., Nat Rev.Cancer.2002, 2 (4):289-300]。不適當(dāng)?shù)腸-Met激活可通過配體依賴性和非依賴性機制(包括c-Met過表達(dá)，和/或旁分泌或自分泌激活)發(fā)生，或通過獲得性功能突變發(fā)生[J.G.Christensen, BurrowsJ.and Salgia R., Cancer Latters.2005，226:1-26]。然而，在配體存在或不存在情況下的c-Met受體的寡聚化在調(diào)節(jié)激酶對ATP和含酪氨酸的肽底物的結(jié)合親和力和結(jié)合動力學(xué)中是必需的[Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004Augl7, 43: 10570-8]。激活的c-Met募集信號傳導(dǎo)效應(yīng)物到它位于胞質(zhì)區(qū)中的多停泊位點(multidockingsite)，導(dǎo)致幾個關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)途徑的激活，這些信號傳導(dǎo)途徑包括Ras-MAPK、PI3K、Src 和 Stat3[Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res.2005, 15(1):49-51;Furge KA, ZhangYW, Vande Woude GF, Oncogene.2000, 19 (49):5582-9]。這些途徑對于腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和血管生成和對于逃避細(xì)胞凋亡是必需的[Furge KA, Zhang Yff, Vande WoudeGF, Oncogene, 2000,19 (49):5582-9;Gu H, Neel BG,Trends Cell Biol.2003Mar, 13(3):122-30; Fan S，Ma YXj Wang JA，Yuan RQ，Meng Q，Cao Yj Laterra JJj Goldberg ID, RosenEMj Oncogene.2000Apr27, 19(18):2212-23]。此外，相對于其他 RTK，c_Met 信號傳導(dǎo)的獨特之處在于已經(jīng)報道的它與粘著斑復(fù) 合物和非激酶結(jié)合伙伴如α6β4整合素[TrusolinoLj Bertotti A,Comoglio PM，Cell.2001，107:643-54]，CD44v6[Van der Voort Rj TaherTE, Wielenga VJj Spaargaren Mj Prevo R，Smit Lj David G，Hartmann G，GherardiEj Pals STjJ Biol Chem.1999，274 (10):6499-506]，Plexin BI 或信號素(semaphorin)[Giordano S，Corso S，Conrotto P，Artigiani S，Gilestro G，Barberis D，TamagnoneLj Comoglio PM，Nat Cell Biol.2002，4 (9):720-4;Conrotto Pj Valdembri Dj CorsoS，Serini G，Tamagnone L，Comoglio PM, Bussolino F，Giordano S，Blood.2005，105 (11):4321-9;Conrotto P，Corso S，Gamberini S，Comoglio PM，Giordano S，Oncogene.2004，23:5131-7]之間的相互作用，這可進(jìn)一步增加了這一受體調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的復(fù)雜性。最后，近期的數(shù)據(jù)證明，c-Met可能涉及腫瘤對吉非替尼和埃羅替尼的抵抗，這提示聯(lián)合靶向EGFR和c-Met 兩者的化合物可能有重要意義[Engelman JA at al.，Science, 2007，316:1039-43]。在過去幾年中，已開發(fā)出許多不同策略用來減弱惡性腫瘤細(xì)胞系中的c-Met信號傳導(dǎo)。這些策略包括i)抗c-Met或HGF/SF的中和抗體[Cao B，Su Y，OskarssonMj Zhao P, Kort EJj Fisher RJj Wang LMj Vande Woude GFj Proc Natl Acad Sci U SA.2001，98 (13):7443-8 ;Martens T，Schmidt NO, Eckerich C，F(xiàn)illbrandt Rj MerchantMj Schwall Rj Westphal Mj Lamszus K，Clin Cancer Res.2006，12 (20):6144-52]或使用 HGF/SF 的拮抗劑 NK4 來阻止配體結(jié)合 c-Met [Kuba K, Matsumoto K，Date K, ShimuraH，Tanaka M，Nakamura T，Cancer Res.，2000，60:6737-43] ；ii) c-Met 的小 ATP 結(jié)合位點抑制劑來阻斷激酶活性[Christensen JGj Schreck Rj Burrows Jj Kuruganti P，Chan E，LeP，Chen Jj Wang X，Ruslim L，Blake R，Lipson KE，Ramphal J，Do S，Cui JJ，CherringtonJMj Mendel DB, Cancer Res.2003，63:7345-55] ；iii)影響通向多停泊位點的工程化的 SH2區(qū)多肽，和降低受體或配體表達(dá)的RNAi或核酶。這些方法中的大部分表現(xiàn)出c-Met的選擇性抑制，從而導(dǎo)致腫瘤的抑制，并且表明c-Met在惡性腫瘤的治療性干預(yù)中可能是令人感興趣的。所產(chǎn)生的靶向c-Met的分子中，有些是抗體。最廣泛描述的是Genentech[W096/38557]生產(chǎn)的抗c_Met5D5抗體，其在多種模型中單獨加入時作為強力激動劑起作用，當(dāng)用作Fab片段時作為拮抗劑起作用。這一抗體的單價的工程化的形式被描述為單臂(0AOT5)，在大腸桿菌中作為重組蛋白質(zhì)而產(chǎn)生，這也是Genentech專利申請[W02006/015371]的主題。然而，這一分子由于它特定的支架(scarfold)而不能被認(rèn)為是抗體,它也表現(xiàn)出能產(chǎn)生對于人具有免疫原性的突變。在活性方面，這一未糖基化的分子不具有效應(yīng)物的功能，并且最后沒有清楚的數(shù)據(jù)證明，0A5D5抑制c-Met的二聚化。此外，當(dāng)在G55體內(nèi)模型(表達(dá)c-Met但不表達(dá)HGF mRNA和蛋白質(zhì)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，其不依賴于配體而生長)中試驗時，單臂抗c-Met對G55腫瘤生長無顯著效應(yīng)，這提示0A5D5主要通過阻斷HGF結(jié)合起作用，并且不能夠靶向不依賴于HGF而激活的腫瘤[Martens T.et al, Clin.Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152]。Pfizer描述的另一個祀向c_Met的抗體是通過“主要作為c_Met拮抗劑,并且在有些情況下作為c-Met激動劑”起作用的抗體[W02005/016382]。該申請沒有描述顯示Pfizer抗體對c-Met 二聚化的任何效應(yīng)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明的一個新的方面是產(chǎn)生沒有內(nèi)在的激動活性并且抑制C-Met 二聚化的鼠單克隆抗體。除了靶向配體依賴性腫瘤外，該方法也破壞由于c-Met過表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)區(qū)突變的配體非依賴性c-Met激 活，這種激活依舊依賴于寡聚化以進(jìn)行細(xì)胞信號傳導(dǎo)。這種抗體活性的另一方面可能是對c-Met和其伙伴之間的相互作用的產(chǎn)生空間位阻從而破壞c-Met的功能。除了與特異性阻斷c-Met受體有關(guān)的功能之外，優(yōu)選地這些抗體是人源化的和工程化的作為人IgGl以獲得效應(yīng)物功能如ADCC和⑶C，但不限于此。

發(fā)明內(nèi)容
令人驚訝地，發(fā)明人第一次設(shè)法產(chǎn)生了能夠結(jié)合c-Met也能夠抑制c-Met 二聚化的抗體。在現(xiàn)有技術(shù)中，有時候提示能夠抑制c-Met與其伙伴二聚化的抗體可能是令人感興趣的抗體，如果這是真的話，也從來沒有公開過，或清楚的提示有抗體能夠做到這一點。此外，關(guān)于抗體的特異性，成功產(chǎn)生這種活性抗體根本是不明顯的。第一方面，本發(fā)明的主題是產(chǎn)生和選擇本發(fā)明所述的抗體的方法。更具體地，本發(fā)明涉及選擇能夠抑制配體依賴性和配體非依賴性C-Met激活的抗c-Met抗體或其功能片段之一或衍生物的方法，所述的方法包含下述步驟:i)篩選所產(chǎn)生的抗體,選擇能夠特異性結(jié)合c-Met的抗體；ii)體外評價步驟i)中選定的抗體，并且選擇能夠至少50%,優(yōu)選至少60%, 70%或80%地抑制至少一種腫瘤類型的腫瘤細(xì)胞增殖的抗體；iii)試驗步驟ii)中選定的抗體,選擇能夠抑制c_Met 二聚化的抗體。如前面所解釋的，由于這種抗體對于更大人群的病人具有實際的意義，抑制C-Met二聚化是本發(fā)明的首要方面。不僅配體依賴性激活的c-Met惡性腫瘤(正如直到本發(fā)明的情況)，而且配體非依賴性激活的c-Met惡性腫瘤也能通過本發(fā)明所述的方法產(chǎn)生的抗體進(jìn)行治療?？贵w的產(chǎn)生可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來實現(xiàn)，例如，將骨髓瘤細(xì)胞與從免疫小鼠或任何其他與選定的骨髓瘤細(xì)胞相容的物種獲得的脾細(xì)胞融合[Kohler&Milstein, 1975，Nature, 256:495-497]。免疫動物可包括帶有人免疫球蛋白質(zhì)位點的轉(zhuǎn)基因鼠，其然后能直接產(chǎn)生人抗體。其他可能的具體實施方式
可能在于使用噬菌體顯示技術(shù)以篩選文庫。篩選步驟i)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法或過程來實現(xiàn)。作為非限制性例子，可以提及的是ELISA、BIAcore、免疫組化、FACS分析和功能性篩選。優(yōu)選的方法在于通過ELISA對c-Met重組蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選，并且然后通過FACS分析至少一種腫瘤細(xì)胞系，以確定所產(chǎn)生的抗體也能夠識別腫瘤細(xì)胞上天然的受體。這一方法將在下述的實施例中進(jìn)行更精確的描述。同樣，步驟ii)也可通過已知的方法或過程來經(jīng)典地實現(xiàn)，例如使用3H-胸腺嘧啶或任何其他DNA染色劑、MTT、ATP評價等。本發(fā)明中優(yōu)選的腫瘤細(xì)胞模型可為BxPC3模型。通過抑制c-Met 二聚化，必須理解它優(yōu)選地為c_Met同二聚化。在本發(fā)明所述的選擇方法的步驟iii)的優(yōu)選具體實施方式
中，所述的步驟iii)在于通過BRET分析表達(dá)c-Met-RLuc/c-Met-YFP兩者的細(xì)胞來評價抗體，并且選擇能夠至少30%，優(yōu)選35%、40%、45%、50%、55%或最優(yōu)選60%地抑制BRET信號的抗體。BRET技術(shù)為已知技術(shù)，其是蛋白質(zhì)二聚化的代表性技術(shù)[Angers etal, PNAS, 2000，97:3684-89]。在該方法的步驟iii)中使用的BRET技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且將會在下述實施例中進(jìn)行詳細(xì)描述。更具體地，BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)是發(fā)生在生物發(fā)光供體(海腎熒光素酶(Renilla LuciferasejRluc))和熒光受體，GFP (綠色熒光蛋白質(zhì))或YFP(黃色熒光蛋白質(zhì))的突變體之間的非放射性能量轉(zhuǎn)移。在本案中使用了 EYFP(增強型黃色熒光蛋白質(zhì))。轉(zhuǎn)移的效率依賴于供體和受體之間的方向和距離。因此，只有當(dāng)兩個分子臨近(1-1Onm)時才可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這一屬性用來進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。實際上，為研究兩個伙伴間的相互作用，第一個通過基因工程使其融合到海腎熒光素酶中，并且第二個融合到GFP的黃色突變體中。融合蛋白質(zhì)一般但不是一定在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。在其膜具有通透性的底物(腔腸素(coelenterazine))存在條件下，Rluc發(fā)射藍(lán)光。如果GFP突變體與Rluc接近大于10nm，可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，并且可檢測到另外的黃色信號。測量的BRET信號為受體發(fā)射的光和供體發(fā)射的光的比率。因此，當(dāng)使兩個融合蛋白接近或如果構(gòu) 象變化使Rluc和GFP突變體更近時，BRET信號將會增加。如果BRET分析是一個優(yōu)選的具體實施方式
的話，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法可用來測量c-Met 二聚化。非限制性地，下述技術(shù)可被提及:FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)，HTRF(均相時間分辨熒光)，F(xiàn)UM(熒光壽命成像顯微鏡)或SW-FCCS ((單波長熒光相關(guān)光譜法(single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy))。也可使用其他經(jīng)典的技術(shù)，如免疫共沉淀，α篩選，化學(xué)交聯(lián)，雙雜交，親和層析，ELISA 或遠(yuǎn)端 western 印跡(Far western blot)。第二方面，本發(fā)明的主題為通過所述的方法獲得的分離的抗體或其功能片段之一或衍生物。所述的抗體或其所述的功能片段之一或衍生物能夠特異性結(jié)合到人c-Met，并且，如果必要，優(yōu)選地還能夠抑制其配體HGF的天然結(jié)合和/或能夠特異性抑制所述c-Met的酪氨酸激酶活性，所述的抗體也能夠抑制c-Met的二聚化。更具體地，所述的抗體能夠抑制c-Met的配體依賴性和配體非依賴性激活?！肮δ苄云魏脱苌铩钡谋硎龃撕髸诒菊f明書中進(jìn)行詳細(xì)的限定。在此必須理解，本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，也就是說，這些抗體不是在其天然的環(huán)境中，而是它們能夠從天然來源中通過純化被分離或獲得，或還可通過基因重組獲得，或通過化學(xué)合成獲得，因此，它們含有非天然氨基酸，這一點會進(jìn)一步描述。
更具體地，根據(jù)本發(fā)明所述的另一方面，其要求保護(hù)抗體或其功能片段之一或衍生物，所述的抗體的特征在于其包含至少一個互補決定區(qū)⑶R，所述⑶R選自包含氨基酸序列 SEQ ID N0.1 至 17 和 56 至 61 的 CDR。含有至少一個⑶R，該⑶R的序列在與序列SEQ ID N0.1至17和56至61進(jìn)行優(yōu)化比對后，至少具有80%的同一性，優(yōu)選地85%、90%、95%或98%的同一性的任何抗體或片段或衍生物，都應(yīng)理解為本發(fā)明的等同物，因此，也是本發(fā)明的一部分。⑶R區(qū)或⑶R的意思是指IMGT限定的免疫球蛋白質(zhì)的重鏈和輕鏈的高變區(qū)。IMGT特有編號(IMGT unique numbering)被限定用來比較可變區(qū)，而不論抗原受體、鏈的類型或物種[Lefranc M.-P., Immunology Todayl8, 509 (1997) /LefrancΜ.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) /Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol，27，55-77 (2003)]。在MGT特有編號中，保守氨基酸總是具有相同的位置，例如半胱氨酸23 (第1-CYS)，色氨酸41 (保守-TRP (C0NSERVED-TRP))，疏水氨基酸89，半胱氨酸104(第2-CYS)，苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。MGT特有編號提供了對框架區(qū)(FR1-1MGT:位置 I 至 26，F(xiàn)R2-1MGT:39 至 55、FR3-1MGT:66 至 104 和 FR4-1MGT:118 至 128)和其互補決定區(qū):CDRHMGT:27 至 38、CDR2-1MGT:56 至 65 和 CDR3-1MGT:105至117的標(biāo)準(zhǔn)限定。由于缺口代表未占據(jù)的位置，⑶R-1MGT的長度(在括號中顯示用并點分開，例如[8.8.13])是重要的信息。MGT特有編號用2D圖表示，稱為MGTColliers de Perles[Ruiz, M.and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883(2002)/Kaas, Q.and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)],并且在 IMGT/3D結(jié)構(gòu)-DB[Kaas, Q., Ruiz, M.and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structuraldata.Nuc1.Acids.Res.，32，D208-D210 (2004)]中用 3D 結(jié)構(gòu)表示。存在3個重鏈⑶R和3個輕鏈⑶R。根據(jù)情況的不同，此處使用的術(shù)語⑶R或多個CDR用于表示這些區(qū)(含有大部分負(fù)責(zé)抗體`對抗原或其識別的表位的親和性結(jié)合的氨基酸殘基的區(qū))中的一個或幾個，或甚至全部。本發(fā)明意義上的兩條核酸或氨基酸序列之間的“同一性百分?jǐn)?shù)”是指將要比較的兩個序列之間的核苷酸或同樣的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，該百分?jǐn)?shù)在進(jìn)行最優(yōu)比對(優(yōu)化比對)后獲得，這一百分?jǐn)?shù)是純粹統(tǒng)計上的，并且兩個序列間的差異隨機分布并在全長上分布。傳統(tǒng)上，對兩個核酸或氨基酸序列的比較是通過將他們以優(yōu)化的方式比對后進(jìn)行比較，所述的比較可通過區(qū)段或“比較窗口”進(jìn)行。除了手工方式之外，進(jìn)行比較的序列的優(yōu)化比對可通過 Smith 和 Waterman (1981) [Ad.App.Math.2:482]的局部同源性算法，Neddleman和 Wunsch (1970) [J.Mol.Biol.48:443]的局部同源性算法，Pearson 和 Lipman (1988)[Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444)的相似性檢索法，通過使用這些算法的計算機軟件(威斯康辛遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學(xué)計算機組(GeneticsComputer Group), 575Science Dr.，Madison, WI,或通過BLAST N或 BLAST P 比較軟件的別的方式)的方式進(jìn)行。兩條核酸或氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)通過以優(yōu)化方式比較這兩個序列來確定，并且其中進(jìn)行比較的核酸或氨基酸序列可包含相對于參考序列的加入序列或刪除序列，該參考序列用于在這兩條序列之間進(jìn)行優(yōu)化比對。同一性百分?jǐn)?shù)的計算是通過確定兩個序列間相同核苷酸或氨基酸殘基的同樣位置的數(shù)目，將這一同樣位置的數(shù)目除以所比較窗口的總位置數(shù)目，將所獲得的結(jié)果乘以100，從而獲得這兩條個序列間的同一性百分?jǐn)?shù)。例如，可能使用BLAST程序?qū)?個序列進(jìn)行BLAST (Tatusova etal,〃Blast2sequences-a new tool for comparing protein 和 nucleotidesequences", FEMS Microbiol Lett.174:247-250)，該程序可在網(wǎng)址 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上獲得,使用那些缺省給定的參數(shù)(特別是參數(shù)“開放空缺罰分(open gap penalty)”:5,和“擴展空缺罰分(extension gap penalty)”:2 ;選擇作為矩陣，例如該程序建議的“BL0SUM62”矩陣)，將要比較的兩條序列的同一性百分?jǐn)?shù)直接通過該程序計算得出。相對于參考氨基酸序列具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%或98%的同一性的氨基酸序列，那些相對于參考序列具有某些修飾，特別是刪除、加入或替換了至少一個氨基酸，截短或延長是優(yōu)選的。在替換一個或多個連續(xù)或不連續(xù)氨基酸的情況下，該替換優(yōu)選為所替換的氨基酸被“等同”氨基酸所替換?！暗韧被帷?equivalent amino acids)的表述在此處的目的是表示任何能夠多個氨基酸之一所替換的任何氨基酸，替換上去的氨基酸具有相應(yīng)抗體的基本結(jié)構(gòu)卻不會對其生物活性進(jìn)行實質(zhì)上修飾，并且這些氨基酸將在以后限定，特別是在實施例中限定。這些等同氨基酸的確定可基于它們與被它們替換的氨基酸的結(jié)構(gòu)同源性，或基于能夠進(jìn)行的不同抗體間生物活性的比較性試驗。通過舉例的方式提及能夠進(jìn)行的可能的替換，該替換不導(dǎo)致相應(yīng)的修飾抗體的生物活性的較大修飾。作為非限制性的例子，下述表I給出了考慮到保持修飾抗體的生物活性的可能的替換。在同樣條件下，相反的替換當(dāng)然也是可能的。表I 原始?xì)埢?MEAla(A)Val, Gly, Pro
Arg(R)LyS, His
Asn (N)Gln
Asp (D)Glu
cys(c)Ser
Gln (Q)Asn
Glu (C)Asp
Gly(G)Al^
His (H)Arg
權(quán)利要求
1.一種分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，它們分別包含氨基酸序列SEQ IDN0.56,57和58 ;所述的輕鏈包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，它們分別包含氨基酸序列SEQID N0.59,60 和 61。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0.62，所述的輕鏈包含氨基酸序列SEQ ID N0.63。
3.—種能夠分泌如權(quán)利要求2所述的抗體的鼠雜交瘤，其特征在于所述雜交瘤是于2007年3月14日保藏在巴黎巴斯德研究所CNCM，保藏號為1-3724的鼠雜交瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于所述的抗體是單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于所述的抗體為嵌合抗體，其中輕鏈和重鏈恒定區(qū)來自于人抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于所述的抗體是人源化的抗體，其中來自人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)分別是輕鏈K區(qū)和重鏈 Y -1、Y -2 或 Y -4 區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于所述人源化抗體包括來源于胚系IGKV3-7*01和IGKJ4*01的輕鏈可變區(qū)人框架，其中這些人框架包括至少一個從人殘基至鼠殘基的突變，所述突變選自M4至L、S40至Y、F87至Y、以及P96至T。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于所述人源化抗體包括來源于人胚系IGHV1-46*01和IGHJ4*03的重鏈可變區(qū)框架，其中這些人框架包括至少一個從人殘基至鼠殘基的突變，所述突變選自H40至N、155至Y、S66至D、R80至A、以及T82至K。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于其能夠特異地結(jié)合C-Met。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于其能夠抑制配體依賴和配體非依賴的C-Met激活。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于其抑制C-Met 二聚化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，其特征在于其抑制至少一個腫瘤類型的至少50%腫瘤細(xì)胞增殖。
13.一種分離的核酸，其特征在于其選自下述核酸: a)編碼如權(quán)利要求1和2之一所述的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一的核酸、DNA 或 RNA ；b)包含序列SEQ ID N0.64、SEQ ID N0.65、SEQ ID N0.66 和序列 SEQ ID N0.67、SEQID N0.68和SEQ ID N0.69的DNA序列的核酸； c)包含序列SEQID N0.70和SEQ ID N0.71的DNA序列的核酸； d)b)和/或c)中限定的核酸相對應(yīng)的RNA核酸；e)a),b)和c)中限定的核酸的互補核酸；和 f)在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與至少一個SEQID N0.64至69的CDR雜交的至少18個核苷酸的核酸。
14.一種包括如權(quán)利要求13所述的核酸的載體。
15.—種包含如權(quán)利要求14所述的載體的宿主細(xì)胞。
16.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1、2和4-12之一所述的分離的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一的方法，其特征在于該方法包含下述步驟: a)在培養(yǎng)基中和在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞；以及 b)從培養(yǎng)基或所述的培養(yǎng)細(xì)胞中收獲所述抗體或其功能性二價片段或衍生物之一。
17.如權(quán)利要求1、2、4-12的或通過權(quán)利要求16所述的方法獲得的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一用作藥物。
18.—種包含化合物作為有效成分的組合物，所述的化合物由如權(quán)利要求1、2、4-12之一所述的，或通過如權(quán)利要求16所述的方法產(chǎn)生的，或通過根據(jù)權(quán)利要求3的雜交瘤制備的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一組成。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于其進(jìn)一步包含作為組合產(chǎn)品以同時、分別或相繼使用的至少一種制劑，其中所述制劑是抗腫瘤抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的組合物，其特征在于其進(jìn)一步包含作為組合產(chǎn)品以同時、分別或相繼使用的至少一種制劑，其中所述制劑是細(xì)胞毒性劑/細(xì)胞抑制劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述的細(xì)胞毒性劑/細(xì)胞抑制劑化學(xué)偶聯(lián)至所述抗體或所述二價功能性片段或其衍生物用于同時使用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述的細(xì)胞毒性劑/細(xì)胞抑制劑選自烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、有絲分裂抑制劑、染色質(zhì)功能抑制劑、抗血管生成劑、抗雌激素、抗雄激素或免疫調(diào)節(jié)劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述的細(xì)胞毒性劑/細(xì)胞抑制劑是有絲分裂抑制劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求18至23任一項所述的組合物，其特征在于至少一種所述的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一與細(xì)胞毒素和/或放射性元素結(jié)合。
25.如權(quán)利要求18至24之一所述的組合物用作藥物。
26.如權(quán)利要求1、2、4至12之一所述的，或通過如權(quán)利要求16的方法生產(chǎn)的或通過根據(jù)權(quán)利要求3的雜交瘤制備的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，或如權(quán)利要求18至25的之一所述的組合物，在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或增殖的藥物中的用途。
27.如權(quán)利要求1、2、4至12之一所述的，或通過如權(quán)利要求16的方法生產(chǎn)的或通過根據(jù)權(quán)利要求3的雜交瘤制備的抗體或其功能性二價片段或衍生物之一，或如權(quán)利要求18至26的之一所述的組合物，在制備用于預(yù)防或用于治療惡性腫瘤的藥物中的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途，其特征在于所述的惡性腫瘤是選自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宮內(nèi)膜癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或結(jié)腸癌的惡性腫瘤。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的用途，其特征在于所述惡性腫瘤是cMet激活相關(guān)的惡性腫瘤，其選自HGF依賴性和/或HGF非依賴性的惡性腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制c-MET二聚化的新型抗體及其用途，進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及選擇能夠抑制c-Met的配體依賴性和配體非依賴性激活的抗c-Met抗體的方法。更具體地，所述的方法基于對c-Met二聚化的抑制。另一方面，本發(fā)明涉及用于制備治療惡性腫瘤的藥物的這種抗體和包含這種抗體的組合物。診斷方法和試劑盒也是本發(fā)明的一部分。
文檔編號C12N15/63GK103183739SQ20131007399
公開日2013年7月3日 申請日期2008年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者L·格奇 申請人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司