專利名稱：eIF3a突變基因及其檢測(cè)引物、試劑盒、檢測(cè)方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及eIF3a突變基因及其擴(kuò)增引物、試劑盒、擴(kuò)增方法、pc β a-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒和該質(zhì)粒的制備方法。
背景技術(shù)：
真核生物翻譯調(diào)控主要發(fā)生在起始階段，也是翻譯的限速階段。這一過(guò)程有10個(gè)以上的翻譯起始因子(eukaryotic initiation factors, eIFs)參與。eIF3是翻譯起始因子中最大，最復(fù)雜的一個(gè)，它由13個(gè)亞基組成，分別命名為eIF3a到eIF3m，它參與翻譯起始的所有步驟。首先，參與80S核糖體解離，eIF3可以與40S核糖體亞基結(jié)合并形成復(fù)合物，從而使其保持解離狀態(tài)不與60S亞基聚合。第二，eIF3參與了 43S翻譯起始前復(fù)合物的形成，它與40S亞基結(jié)合后，協(xié)助招募GTP-eIF2-tRNA-methionine三聚復(fù)合物。第三，eIF3幫助mRNA與43S翻譯起始前復(fù)合物結(jié)合。此外,它也參與了翻譯起始復(fù)合物對(duì)起始密碼子的識(shí)別和通過(guò)與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site, IRES)結(jié)合參與帽狀結(jié)構(gòu)非依賴性翻譯起始 過(guò)程。eIF3a是eIF3最大的亞基，我們前期的研究表明它可以調(diào)控一些蛋白的合成，包括a-tubulin、核苷酸還原酶M2 (Ribonucleotide ReductaseM2, RRM2)和p27等。我們已有的研究證明了 eIF3a可以調(diào)控一些NER途徑的蛋白翻譯。我們前期的研究中測(cè)序篩查到新的SNPs:eIF3a2554G>A，它位于10號(hào)染色體外顯子(Arg803Lys)，導(dǎo)致了有義突變。我們?cè)谇捌诘难芯勘砻鳎琫IF3a可以調(diào)控某些細(xì)胞周期和增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)。我們?cè)噲D探討eIF3a2554G>A基因突變是否能通過(guò)調(diào)控eIF3a的表達(dá)而影響其下游基因的表達(dá)。因此需要構(gòu)建eIF3a2554G>A突變型eIF3a真核表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供eIF3a突變基因及其擴(kuò)增引物、試劑盒、擴(kuò)增方法、pc β a-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒和該質(zhì)粒的制備方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種eIF3突變基因，其基因序列如SEQ ID N0.1所示?！N檢測(cè)上述突變基因的試劑盒，所述試劑盒包括如下引物:前引物:5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’ (SEQ ID N0.2)；后引物:5，-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’(SEQID N0.3)。試劑盒中其他試劑為常規(guī)PCR擴(kuò)增試劑，測(cè)序試劑。一種擴(kuò)增上述突變基因的方法:從質(zhì)粒pci3a_eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出突變基因并測(cè)序，pc β a_eIF3a基因序列如SEQ ID N0.7所示；擴(kuò)增體系為:5XPrimer starBuffer20 μ L, dNTP mix8 μ L，前引物 2 μ L，后引物 2 μ L，cDNA2 μ L, Primer STARl μ L,加ddH2065 y L至終體積100 μ L ;擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min，98°C 10s，58°C退火15s，72°C 2min共30個(gè)循環(huán)，72°C總延伸IOmin ;所述前引物和后引物分別如SEQ ID N0.2和SEQID N0.3 所示。一種pC0 a-eIF3a_Arg438Cys突變型質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包括eIF3突變基因，所述質(zhì)粒的核酸序列如SEQ ID N0.4所示。一種制備pc β a-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒的方法,包括如下步驟:(I)從質(zhì)粒pc β a-eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段Arg803Lys, pc β a_eIF3a基因序列如SEQ ID N0.7所示；擴(kuò)增引物為:前引物:5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’ (SEQ ID N0.2)；后引物:5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’ (SEQ ID N0.3)；擴(kuò)增體系為:5XPrimerstar Buffer20 μ L, dNTP mix8 μ L，前引物 2 μ L，后引物2 μ L，CDNA2 μ L, Primer STARl μ L,加 ddH2065 μ L 至終體積 100 μ L ;擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min，98°C 10s， 58°C退火 15s，72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ；(2)將步驟(I)的擴(kuò)增的Arg803Lys用乙醇沉淀,然后在Arg803Lys末端加A尾；(3)采用切膠法回收經(jīng)步驟(2)處理的Arg803Lys ；(4)將Arg803Lys與pGEM_T easy載體連接后轉(zhuǎn)化至DH5 α高效率感受態(tài)細(xì)胞，于LB/氨芐平板上37°C過(guò)夜培養(yǎng)，再挑單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，然后用ApaI酶切驗(yàn)證連接質(zhì)粒;(5)定點(diǎn)誘變構(gòu)建pGEM-T easy_Arg803Lys突變型載體:PCR 擴(kuò)增體系:10*reaction buffer5 μ L, pGEM-T easy-Arg803LysI μ g,前引物5，-GGCAGCGTAAAGAAGAACGCAAGATAACATACTATAGAGAAA-3，( SEQ ID N0.5)I μ L，后引物 5’ -TTTTCTCTATAGTATGTTATCTTGCGTTCTTCTTTACGCTGCC-3’ (SEQ ID N0.6) I μ L，dNTP mixlμ L，Quik Solution reagentl.5 μ L, ddH20 力口至 50 μ L,最后力口 I μ L Quik change Enzyme ；熱循環(huán):96°C2min,96°C 20s,60°C 10s,68°C 2min 共 20 個(gè)循環(huán)。最后 68°C延伸5min ；將PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn I消化后轉(zhuǎn)化至XLlO-Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/氨芐平板，37°C下培養(yǎng)后挑單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即為pGEM-T easy-Arg803Lys突變型載體；(6)分別將 pGEM-T easy_Arg803Lys 突變型載體和 pc β a_eIF3a 進(jìn)行 MluI和BspDI雙酶切，將pc β a-eIF3a雙酶切后不含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段與pGEM_Teasy-Arg438Cys酶切后含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物用BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂LB/氨芐平板篩選，挑單克隆LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得pc β a-eIF3a-Arg803Lys 突變型質(zhì)粒。本發(fā)明采用pc β a空載體成功構(gòu)建了 eIF3a2554G>A突變型eIF3a真核表達(dá)載體。


圖1為含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖，泳道I和2均為PCR擴(kuò)增片段；圖2為pGEM-T easy與Arg803Lys片段連接后ApaI單酶切驗(yàn)證圖；圖3為pGEM-T easy-Arg803Lys定點(diǎn)誘變后測(cè)序結(jié)果與原pGEM_Teasy_Arg803Lys序列比較圖4 為 pGEM-T easy_Arg803Lys 突變型載體和 pc β a_eIF3a 進(jìn)行 MluI 和 BspDI雙酶切電泳圖；泳道I為pc β a-eIF3a雙酶切結(jié)果，泳道2為pGEM_T easy-Arg803Lys雙酶切結(jié)果；圖5為pc β a_eIF3a_Arg803Lys突變載體序列與原pc β a_eIF3a質(zhì)粒序列比對(duì)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1I含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段的擴(kuò)增1.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)從pc β a-eIF3a 的全長(zhǎng) cDNA 上擴(kuò)增含 2554G>A (Arg803Lys)位點(diǎn)的 DNA 片段。引物序列:前引物:5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’ (SEQ ID N0.2)后引物:5，-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3，(SEQID N0.3)擴(kuò)增長(zhǎng)度:755bpPCR擴(kuò)增體系如表1:表I
權(quán)利要求
1.一種eIF3突變基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述突變基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物:前引物:5’ -AGAITTATTCGTAATGCGACT-3’ ； 后引物:5’ -AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’。
3.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述突變基因的方法，其特征在于，所述方法為: 從質(zhì)粒ροβ a_eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出突變基因并測(cè)序，pc β a_eIF3a基因序列如 SEQ ID N0.7 所示；擴(kuò)增體系為:5 X Primer star Buffer 20 μ L, dNTP mix8yL，前引物2 μ L，后引物 2 μ L，cDNA2 μ L, Primer STAR I μ L，加 ddH2065 μ L 至終體積 100 μ L ;擴(kuò)增條件為:951:預(yù)變性51^11，981: 10s，58°C退火 15s，72°C 2min共 30 個(gè)循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ；所述前引物和后引物分別為權(quán)利要求2中所述的前引物和后引物。
4.一種pc β a-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒,其特征在于,所述質(zhì)粒包括權(quán)利要求1所述的突變基因，所述質(zhì)粒的核酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.一種制備權(quán)利要求4所述pc β a-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒的方法,包括如下步驟: (1)從質(zhì)粒pcβ a-eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段Arg803Lys ；擴(kuò)增引物為:前引物:5’ -AGAITTATTCGTAATGCGACT-3’ ； 后引物:5’ -AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’ ； 擴(kuò)增體系為:5XPrimer star Buffer 20 μ L, dNTP mix8 μ L，前引物 2 μ L，后引物2μ L，cDNA2 μ L, Primer STARl μ L，加 ddH2065 μ L 至終體積 100 μ L ;擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min，98°C 10s，58°C退火 15s，72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ； (2)將步驟(I)的擴(kuò)增的Arg803Lys用乙醇沉淀,然后在Arg803Lys末端加A尾； (3)采用切膠法回收經(jīng)步驟(2)處理的Arg803Lys； (4)將Arg803Lys與pGEM_Teasy載體連接后轉(zhuǎn)化至DH5 α高效率感受態(tài)細(xì)胞，于LB/氨芐平板上37°C過(guò)夜培養(yǎng)，再挑單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，然后用ApaI酶切驗(yàn)證連接質(zhì)粒；(5)定點(diǎn)誘變構(gòu)建pGEM-T easy-Arg803Lys突變型載體: PCR 擴(kuò)增體系:10*reaction buffer 5 μ L, pGEM~T easy_Arg803Lys lug，前引物 5，_GGCAGCGTAAAGAAGAACGCAAGATAACATACTATAGAGMA-3’ I μ L，后引物 5’-TITTCTCTATAGTATGTTATCTTGCGTTCTTCTTTACGCTGCC-3’ I μ L,dNTP mixlμ L,Quik Solution reagentl.5 μ L,ddH20力口至 50 μ L,最后力口 IyL Quik change Enzyme ； 熱循環(huán):96°C 2min,96°C 20s, 60°C 10s, 68°C 2min 共 20 個(gè)循環(huán)。最后 68°C延伸 5min ；將PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn I消化后轉(zhuǎn)化至XLlO-Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/氨芐平板，37°C下培養(yǎng)后挑單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即為pGEM-T easy-Arg803Lys突變型載體； (6)分別將 pGEM-T easy-Arg803Lys 突變型載體和 pc β a_eIF3a 進(jìn)行 MluI 和 BspDI 雙酶切，將pc β a-eIF3a雙酶切后不含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段與pGEM_T easy_Arg438Cys酶切后含2554G>A位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行連接，然后將連 接產(chǎn)物用BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂LB/氨芐平板篩選，挑單克隆LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得pc β a-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了eIF3a突變基因及其擴(kuò)增引物、試劑盒、擴(kuò)增方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突變型質(zhì)粒和該質(zhì)粒的制備方法。我們前期的研究中測(cè)序篩查到新的SNPs:eIF3a2554G>A，它位于10號(hào)染色體外顯子(Arg803Lys)，導(dǎo)致有義突變。前期的研究表明，eIF3a可以調(diào)控某些細(xì)胞周期和增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)。我們?cè)噲D探討eIF3a2554G>A基因突變是否通過(guò)調(diào)控eIF3a的表達(dá)而影響其下游基因的表達(dá)。本發(fā)明成功構(gòu)建了eIF3a2554G>A突變型eIF3a真核表達(dá)載體pcβa-eIF3a-Arg803Lys，有利于對(duì)eIF3a2554G>A基因功能的研究。
文檔編號(hào)C12N15/79GK103224938SQ20131006384
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者劉昭前, 王瑛, 郭成賢, 尹繼業(yè), 陳娟 申請(qǐng)人:中南大學(xué)