專利名稱：無固定點靶物質(zhì)的適配體篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分析化學(xué)核酸適配體篩選技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體涉及一種利用鏈霉親和素標(biāo)記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，并通過SELEX技術(shù)篩選無固定點靶物質(zhì)的適配體的方法。
背景技術(shù)：
SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,即指數(shù)富集配體系統(tǒng)體外進(jìn)化)技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)可以從隨機單鏈寡核苷酸庫中篩選到特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體。其基本思路是體外化學(xué)合成一個單鏈寡核苷酸庫，與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗脫未結(jié)合的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴增，再進(jìn)入下輪的篩選。通過重復(fù)的篩選與擴增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中未和力的核酸分子被洗去，而與祀物質(zhì)有強未和力的核酸分子從非常大的隨機庫中分尚出來，且純度隨SELEX過程的進(jìn)行而增高，最后占據(jù)庫的大多數(shù)(>90%左右)。自Tuerk和Ellington等首先運用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異核酸適配體后，經(jīng)過十幾年的發(fā)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研究手段和工具。SELEX過程中的關(guān)鍵步驟是將未結(jié)合的核酸與能與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分開。大多數(shù)研究者選擇將靶物質(zhì)固定，當(dāng)單鏈寡核苷酸庫與靶物質(zhì)混合，能與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子隨著靶物質(zhì)一起留在固定介質(zhì)上后，洗去不能結(jié)合的核酸。通過固定靶物質(zhì)的方法，人們運用SELEX技術(shù)已成功篩選到包括有機染料、藥物、氨基酸、細(xì)胞因子、輔因子、氨基糖苷、氨基類似物、核苷酸和多肽等物質(zhì)的適配體。但運用該方法的前提是靶物質(zhì)有固定點，因此有關(guān)無固定點靶物質(zhì)適配體的篩選少見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種無固定點靶物質(zhì)的適配體篩選方法，通過固定寡核苷酸文庫，洗脫未固定的核酸，正向篩選時加入靶物質(zhì)與固定的核酸作用，洗脫下能與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，PCR擴增后用于下一輪篩選；反向篩選時加入與靶物質(zhì)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，洗脫除去與靶物質(zhì)非特異性結(jié)合的核酸分子。經(jīng)過多輪次的正、反向篩選，得到能與靶物質(zhì)高特異性、強親和力作用的核酸適配體。將本方法應(yīng)用于重金屬鎘離子適配體的篩選，得到13條能與鎘離子高特異性、強親和力作用的適配體。本發(fā)明固定效果好、適用性強且成本低，可用于無固定點靶物質(zhì)的適配體篩選。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明通過構(gòu)建隨機寡核苷酸文庫以及用于PCR擴增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文庫引物，并利用鏈霉親和素標(biāo)記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用于克隆測序的PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序后得到與無固定點靶物質(zhì)特異親和性結(jié)合的適配體。所述的隨機寡核苷酸文庫的序列為:
5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’，其中:兩端分別為Seq ID N0.1和Seq ID N0.2所示的19bp的固定序列，中間30個堿基為隨機序列。因30個堿基中每個堿基有4種可能組成，故此隨機寡核苷酸文庫理論庫容量為430，理論上可從中篩選出任何靶物質(zhì)的適配體。所述的上游引物，即Pl序列，如Seq ID N0.1所示，為5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’ ；所述的下游引物，即P2序列，如Seq ID N0.3所示，為5， -CGCAACGCTCGCTCATACT-3，；所述的固定寡核苷酸文庫引物，即P3序列，為5， -Biotin-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’其中:P3序列由Biotin (生物素，與鏈霉親和素有很強作用力)和Seq ID N0.3所示的下游引物序列組成。所述的固 定寡核苷酸文庫是指:將含有隨機寡核苷酸文庫與含有固定寡核苷酸文庫引物的水溶液混合后進(jìn)行退火處理，然后將將退火后的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。所述的混合是指:以摩爾比為1: 2 3的比例混合。所述的退火處理是指:在94° C環(huán)境下變性60s;然后在59° C環(huán)境下退火60min ;再在25。C環(huán)境下延伸5min，其中:退火過程及延伸過程的降溫速度為0.1° C/s。所述的固定寡核苷酸文庫在SELEX方法篩選前經(jīng)緩沖液充分洗滌，離心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。所述的SELEX方法是指:依次進(jìn)行若干輪的正向SELEX篩選和反向SELEX篩選。所述的正向SELEX篩選是指:向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒加入無固定點靶物質(zhì)，經(jīng)孵育后離心處理并收集離心液，作為非對稱PCR擴增的模板，經(jīng)PCR程序擴增后收集產(chǎn)物并純化，作為后續(xù)正向篩選用文庫，使得無固定點靶物質(zhì)濃度降低。所述的無固定點靶物質(zhì)的濃度可參考美國環(huán)保署(EPA)及世界衛(wèi)生組織(WHO)的相關(guān)規(guī)定來設(shè)定。所述的孵育是指:無固定點靶物質(zhì)與固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒在一定溫度下作用一段時間。所述的擴增是指:擴大上述收集的離心液中能與靶物質(zhì)作用的寡核苷酸的含量。所述的正向SELEX篩選的次數(shù)優(yōu)選為以無固定點靶物質(zhì)濃度降低至標(biāo)準(zhǔn)檢出限(具體濃度可參考美國環(huán)保署(EPA)及世界衛(wèi)生組織(WHO)的相關(guān)規(guī)定)以下時終止，并進(jìn)行反向SELEX篩選。所述的反向SELEX篩選是指:當(dāng)靶物質(zhì)為某種重金屬離子，則向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒先加入與無固定點靶物質(zhì)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)類似的不同的重金屬離子，孵育后離心處理并去除離心液，然后加入無固定點靶物質(zhì)，孵育后離心處理并收集離心液，作為PCR擴增寡核苷酸的模板，經(jīng)PCR程序擴增后收集產(chǎn)物并純化，作為后續(xù)反向篩選的文庫。所述的反向SELEX篩選的次數(shù)優(yōu)選為3 5次。本發(fā)明的原理在于:體外化學(xué)合成一個單鏈寡核苷酸庫，通過生物素與親和素之間的作用將單鏈寡核苷酸固定在介質(zhì)上，洗脫未固定的核苷酸，正向篩選時，加入無固定點靶物質(zhì)與固定的核苷酸孵育，孵育過程中有核苷酸與靶物質(zhì)發(fā)生親和性作用，該作用足以克服生物素與親和素之間的作用力，當(dāng)分離靶物質(zhì)與固定介質(zhì)時，結(jié)合部分的核苷酸就隨著靶物質(zhì)脫離固定介質(zhì)，再分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴增，再進(jìn)入下輪的正向篩選。通過重復(fù)的正向篩選與擴增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的核酸分子被離去。反向篩選時，在加入靶物質(zhì)之前，先加入與靶物質(zhì)結(jié)構(gòu)或性質(zhì)類似的其他物質(zhì)與固定的核酸作用，若有核酸分子隨該物質(zhì)從固定介質(zhì)上脫離，則其為靶物質(zhì)的非特異性結(jié)合核酸，也當(dāng)被除去。如此經(jīng)過多輪次的正、反向篩選，最終將與靶物質(zhì)有高特異性、強親和力的核苷酸分子從隨機庫中分離出來，該核酸分子即為靶物質(zhì)的適配體。
技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的篩選方法不需要大型儀器設(shè)備，固定效果好、操作方便、適用性強且成本低，可用于無固定點靶物質(zhì)的適配體篩選。


圖1為本發(fā)明鎘離子核酸適配 體篩選的技術(shù)路線示意圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
實施例1如圖1所示，本實施例包括以下步驟:步驟I)構(gòu)建總長度為68bp的隨機寡核苷酸文庫，寡核苷酸文庫的序列為:5’_ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’，其中兩端為 19bp 的固定序列，中間 30個堿基為隨機序列。步驟2)設(shè)計三條引物，其中 Pl(5’-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’)和P2 (5 ’ -CGCAACGCTCGCTCATACT-3，)分別用作PCR擴增寡核苷酸的上游引物和下游引物，P3 (5’-Biotin-CGCAACGCTCGCT CATACT-3’)用于將寡核苷酸文庫固定在鏈霉親和素標(biāo)記的瓊脂糖顆粒上。步驟3)取隨機寡核苷酸文庫，與P3序列按體積比1:2 3均勻混合，混合液進(jìn)行退火處理，退火條件為:94° C變性60s，59° C退火60min，25° C延伸5min，降溫速度為
0.1° C/s。退火過程中寡核苷酸3’端的19個堿基將與P3形成配對。將退火后的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。用緩沖液充分洗滌，離心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。步驟4)向上述柱子中加入一定200 μ M鎘離子進(jìn)行正向篩選，孵育一定時間后離心，收集離心液。步驟5)將上述收集的離心液用作非對稱PCR擴增的模板，經(jīng)一定的PCR程序擴增后，收集PCR產(chǎn)物并純化，用作下一輪篩選的文庫。
步驟6)按步驟3)和4)做下一輪篩選，每進(jìn)行一輪篩選，將步驟(4)中加入的鎘離子濃度降低。步驟7)當(dāng)鎘離子濃度降低至0.002 μ M時，按步驟3)-5)進(jìn)行反向篩選。步驟4)中加入鎘離子之前，先加入其他的金屬離子，孵育一定時間后離心，棄掉離心液，再向柱子中加入200 μ M鎘離子，孵育一定時間后離心，收集離心液，用作PCR擴增寡核苷酸的模板，經(jīng)一定的PCR程序擴增后，收集PCR產(chǎn)物并純化，用作下一輪反向篩選的文庫。經(jīng)過十輪正向SELEX篩選后得到的結(jié)果分析如下:
權(quán)利要求
1.一種無固定點靶物質(zhì)的適配體篩選方法，其特征在于，通過構(gòu)建隨機寡核苷酸文庫以及用于PCR擴增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文庫引物，并利用鏈霉親和素標(biāo)記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用于克隆測序的PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序后得到與無固定點靶物質(zhì)特異親和性結(jié)合的適配體； 所述的隨機寡核苷酸文庫的序列為: 5’ -ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3 ’，其中:兩端分別為 Seq IDN0.1和Seq ID N0.2所不的19bp的固定序列，中間30個喊基為隨機序列； 所述的上游引物，即Pl序列，如Seq ID N0.1所示； 所述的下游引物，即P2序列，如Seq ID N0.3所示； 所述的固定寡核苷酸文庫引物，即P3序列，為5’-Biotin-CGCAACGCTCGCTCATACT-3’其中:P3序列由Biotin和Seq ID N0.3所示的下游引物序列組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的固定寡核苷酸文庫是指:將含有隨機寡核苷酸文庫與含有固定寡核苷酸文庫引物的水溶液混合后進(jìn)行退火處理，然后將將退火后的混合液加入到裝有表面接枝親和素的瓊脂糖的柱子中，通過生物素-親和素作用將隨機寡核苷酸庫固定在瓊脂糖顆粒上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的混合是指:以摩爾比為1:2 3的比例混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的退火處理是指:在94°C環(huán)境下變性60s;然后在59° C環(huán)境下退火60min ;再在25° C環(huán)境下延伸5min，其中:退火過程及延伸過程的降溫速度為0.1° C/s。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的固定寡核苷酸文庫在SELEX方法篩選前經(jīng)緩沖液充分洗滌，離心除去未固定的寡核苷酸和P3序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的SELEX方法是指:依次進(jìn)行若干輪的正向SELEX篩選和反向SELEX篩選。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的正向SELEX篩選是指:向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒加入無固定點靶物質(zhì)，經(jīng)孵育后離心處理并收集離心液，作為非對稱PCR擴增的模板，經(jīng)PCR程序擴增后收集產(chǎn)物并純化，作為后續(xù)正向篩選用文庫，使得無固定點祀物質(zhì)濃度降低。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征是，所述的正向SELEX篩選的次數(shù)為以無固定點靶物質(zhì)濃度降低至標(biāo)準(zhǔn)檢出限以下時終止，并進(jìn)行反向SELEX篩選。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的反向SELEX篩選是指:當(dāng)靶物質(zhì)為某種重金屬離子，則向固定有隨機寡核苷酸庫的瓊脂糖顆粒先加入與無固定點靶物質(zhì)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)類似的不同的重金屬離子，孵育后離心處理并去除離心液，然后加入無固定點靶物質(zhì)，孵育后離心處理并收集離心液，作為PCR擴增寡核苷酸的模板，經(jīng)PCR程序擴增后收集產(chǎn)物并純化，作為后續(xù)反向篩選的文庫。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或9所述的方法，其特征是，所述的反向SELEX篩選的次數(shù)為3 5次。
全文摘要
一種分析化學(xué)核酸適配體篩選技術(shù)領(lǐng)域的無固定點靶物質(zhì)的適配體篩選方法，通過構(gòu)建隨機寡核苷酸文庫以及用于PCR擴增的上游引物和下游引物和固定寡核苷酸文庫引物，并利用鏈霉親和素標(biāo)記的瓊脂糖顆粒固定寡核苷酸文庫，最終通過SELEX方法篩選得到可用于克隆測序的PCR產(chǎn)物，經(jīng)測序后得到與無固定點靶物質(zhì)特異親和性結(jié)合的適配體。將本方法應(yīng)用于重金屬鎘離子適配體的篩選，得到13條能與鎘離子高特異性、強親和力作用的適配體。本發(fā)明固定效果好、適用性強且成本低，可用于無固定點靶物質(zhì)的適配體篩選。
文檔編號C12Q1/68GK103114147SQ20131006384
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者周培, 吳遠(yuǎn)根, 詹深山, 王法澤, 劉樂, 邢海波, 詹學(xué)佳 申請人:上海交通大學(xué)