專利名稱：一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇是一種有效的抗癌藥物，傳統(tǒng)的獲得方法包括為對(duì)紅豆杉進(jìn)行植物提取，但紅豆杉中不僅含量極低，且大量砍伐紅豆杉樹木為環(huán)境不友好行為；植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法雖然解決了大規(guī)?？撤ゼt豆杉的問題，卻因植物細(xì)胞生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，故獲得紫杉醇的效率也并不高；化學(xué)合成法不僅合成步驟復(fù)雜，且每一步收率不高，若應(yīng)用此法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)勢(shì)必產(chǎn)生大量污染廢物，且成本昂貴。人類 健康、能源、環(huán)境等領(lǐng)域的重大需求也牽引著合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展。將基因元件(啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、開放閱讀框、終止子等)依據(jù)工程化目標(biāo)需要，有機(jī)重構(gòu)和連接起來，便形成了功能基因模塊。通過對(duì)已有生物網(wǎng)絡(luò)加以利用，同時(shí)引入新的功能基因模塊，表達(dá)出天然細(xì)胞不能合成或含量極低的產(chǎn)物。美國(guó)Croteau R教授的實(shí)驗(yàn)室在紫杉醇生物合成的研究中作了大量的、卓有成效的工作，經(jīng)過十幾年的努力，紫杉醇大部分生物合成途徑已經(jīng)明確。紫杉二烯作為紫杉醇合成途徑中的關(guān)鍵前體，其產(chǎn)量的提升具有十分重大的意義。華盛頓州立大學(xué)的Croteau教授是最早從事紫杉醇合成途徑解析和相關(guān)基因克隆工作的，從上世紀(jì)90年代開始相繼克隆了紫杉醇合成的多個(gè)基因，為微生物合成紫杉醇提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。2001年，德克薩斯州農(nóng)工的Scott等在大腸桿菌中首次實(shí)現(xiàn)了紫杉二烯的生物合成，產(chǎn)量為1.3mg/l。2004年西班牙巴塞羅那大學(xué)的Boronat等在擬南芥中實(shí)現(xiàn)了紫杉二烯的合成，產(chǎn)量為600ng/g DW。2005年德國(guó)Darmstadt技術(shù)大學(xué)的Jennewein等在酵母中合成了紫杉二烯，產(chǎn)量達(dá)到8.7mg/Lo 2006年,Croteau教授等在酵母菌實(shí)現(xiàn)了紫杉二烯-5 α-醇的合成，約為25yg/L。2010年，麻省理工學(xué)院(MIT)的Skphanopoulos課題組在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了紫杉二烯的合成，產(chǎn)量高達(dá)1020±80mg/L。雖然在大腸桿菌中紫杉二烯的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到較高水平，但當(dāng)此課題組進(jìn)行后續(xù)紫杉二烯-5 α -醇的合成時(shí)，卻只檢測(cè)到很少量的產(chǎn)物，這可能由于Ρ450酶在大腸桿菌的背景下難以有效地發(fā)揮其催化功能。因此，在酵母中進(jìn)行紫杉二烯及后續(xù)前體的合成具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)和重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種紫杉二烯合酶基因。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種紫杉二烯合酶基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的構(gòu)建方法構(gòu)建的酵母菌。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:一種紫杉二烯合酶基因，是序列表SEQ ID NO: 11所述的核苷酸序列。
上述一種紫杉二烯合酶基因編碼的蛋白質(zhì)，是序列表SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列。一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟:(I)載體 SyBE_001173 的構(gòu)建:①將啟動(dòng)子、GGPP合酶基因、終止子采用OE-PCR方法拼接起來，得到兩端包含Hind III和Apa I位點(diǎn)的片段，連接入游離型載體pRS425 ；②將啟動(dòng)子、序列表SEQ ID NO: 11所示的紫杉二烯合酶基因、終止子采用OE-PCR方法拼接起來，得到兩端包含Sac I和HindIII位點(diǎn)的片段，連接入步驟①獲得的載體，得到載體 SyBE_001173 ；(2)載體 SyBE_001187 的構(gòu)建:①將酵母組成型啟動(dòng)子、tHMGR基因、終止子應(yīng)用OE-PCR法拼接起來，得到兩端包含Xho I和Apa I位點(diǎn)的片段，連接至整合型載體PRS403 ；②將酵母組成型啟動(dòng)子、ERG20基因、終止子應(yīng)用OE-PCR法拼接起來，得到兩端包含Sac I和Xho I兩個(gè)位點(diǎn)的片段，連接至步驟①獲得的載體，得到載體SyBE_001187 ；所述GGPP合酶基因是序列表SEQ ID N0:9所述的核苷酸序列；所述tHMGR基因是序列表SEQ ID NO: 3所述的核苷酸序列；所述ERG20基因是序列表SEQ ID NO: 7所述的核苷酸序列；(3)將所述載體SyBE_001173、SyBE_001187導(dǎo)入到釀酒酵母W303-1A或釀酒酵母BY4742中，得到生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌。

上述一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的構(gòu)建方法構(gòu)建的酵母菌。本發(fā)明的生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)更為環(huán)保、成本低廉，為紫杉二烯的生產(chǎn)提供了一種可行的方法。


圖1 載體 SyBE_001173 (pRS425_TS_GGPPS)構(gòu)建圖譜。圖2 載體 SyBE_001187 (pRS403_tHMGR-ERG20)構(gòu)建圖譜。圖3酵母中紫杉二烯合成途徑。圖4發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定氣相色譜圖。圖5發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉二烯質(zhì)譜圖。圖6功能菌株發(fā)酵細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及紫杉二烯的積累曲線。圖7濃縮純化得到的紫杉二烯標(biāo)準(zhǔn)品氣相圖。圖8純化得到的紫杉二烯標(biāo)準(zhǔn)品H-NMR譜圖。圖9純化得到的紫杉二烯標(biāo)準(zhǔn)品C-NMR譜圖。圖10紫杉二烯GC-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下通過合成紫杉二烯的優(yōu)選實(shí)施例并結(jié)合附圖具體說明本發(fā)明的各個(gè)方面和特征。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些實(shí)施例只是用于說明，而不限制本發(fā)明的范圍。在不背離權(quán)利要求書范圍的條件下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)行各種修改和改進(jìn)，這些修改和改進(jìn)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。例如，將實(shí)施例中所使用的啟動(dòng)子和表達(dá)載體替換為本領(lǐng)域中常用的其他啟動(dòng)子和表達(dá)載體，是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所能夠理解并實(shí)現(xiàn)的。另外，需要注意的是，除非特別指明，下面實(shí)施例中所用的各種材料和試劑都是本領(lǐng)域中常用的材料和試劑，可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑獲得；所用方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法。實(shí)施例1:酵母中紫杉二烯合成途徑相關(guān)基因的獲得A、tHMGR基因(酵母截短HMG-CoA還原酶基因)的獲得根據(jù)酵母HMG-CoA還原酶基因序列設(shè)計(jì)引物，SEQ ID NO:1tHM_F: 5’-ATGGTTTTAACCAATAAAACAGTCATTTCT-3’ 及 SEQ ID NO:2tHM_R:5’-TTAGGATTTAATGCAGGTGACG-3’，以W303-1A 菌株基因組為模版，使用 pfu 酶進(jìn)行 PCR (95°C，3min ;95°C，30s，57°C，35s，72°C，2min，32cycles ；72°C,5min ；4°C, + 擴(kuò)增，得到 1509bp 片段?？寺≈?pMD18_T 載體，進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)未發(fā)生突變。核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列SEQ ID N0:4。B、ERG20基因(酵母FPP和GPP合酶基因)的獲得根據(jù)酵母ERG20基因序列設(shè)計(jì)引物，SEQID NO: 5E20-F: 5’-ATGGCTTCAGAAAAAGAAAT-3’及 SEQ ID N0:6E20-R:5’-CTATTTGCTTCTCTTGTAAACTT-3’，以 W303-1A 菌株基因組為模版，使用 Pfu 酶進(jìn)行 PCRC950C，3min ；95°C，30s, 50°C，35s, 72°C，75s, 32cycles ；72°C, 5min ；4°C，+m)擴(kuò)增，得到1059bp片段，克隆至pMD18-T載體，進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)未發(fā)生突變。核苷酸序列SEQ ID NO:7。氨基酸序列SEQ ID NO:8。 C、GGPP合酶基因(紅豆杉源GGPP基因)的獲得和優(yōu)化通過密碼子優(yōu)化，使紅豆杉源GGPP基因的密碼子具有酵母偏好性，并適當(dāng)規(guī)避常用的限制性酶切位點(diǎn)。產(chǎn)生的優(yōu)化基因序列為:SEQ ID NO:9，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ IDNO:10。D、紫杉二烯合成酶基因的獲得與優(yōu)化通過密碼子優(yōu)化，使紫杉二烯合酶基因的密碼子具有酵母偏好性，并適當(dāng)規(guī)避常用的限制性酶切位點(diǎn)。產(chǎn)生的優(yōu)化序列為:SEQ ID NO: 11，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ IDNO:12。實(shí)施例2:載體的構(gòu)建A、載體SyBE_001187 (截短的HMG-CoA合酶基因和ERG20基因的表達(dá)載體)的構(gòu)建①將酵母組成型啟動(dòng)子TDH3p、tHMGR基因、終止子應(yīng)用OE-PCR法拼接起來，得到兩端包含Xho I和Apa I位點(diǎn)的片段，連接至整合型載體PRS403 ；②將酵母組成型啟動(dòng)子TDH3p、ERG20基因、終止子應(yīng)用OE-PCR法拼接起來，得到兩端包含Sac I和Xho I兩個(gè)位點(diǎn)的片段，連接至步驟①獲得的載體，得到載體SyBE_001187 (見圖 2);B、載體SyBE_001173 (含優(yōu)化后紅豆杉源GGPP合酶基因和優(yōu)化后紫杉二烯合酶基因表達(dá)載體)的構(gòu)建:①將啟動(dòng)子TDH3p (也 可以選GALlp等)、GGPP合酶基因、終止子采用OE-PCR方法拼接起來，得到兩端包含Hind III和Apa I位點(diǎn)的片段，連接入游離型載體pRS425 ；②將啟動(dòng)子TDH3p (也可以選GALlp等)、序列表SEQ ID NO: 11所示的紫杉二烯合酶基因、終止子采用OE-PCR方法拼接起來，得到兩端包含Sac I和Hind III位點(diǎn)的片段，連接入步驟①獲得的載體，得到載體SyBE_001173 (見圖1);D、表達(dá)載體的鑒定將構(gòu)建好的上述表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH-5CI中，提質(zhì)粒，進(jìn)行單、雙酶切以及測(cè)序的鑒定，以確保目的片段連接入質(zhì)粒相應(yīng)位置，且堿基序列未發(fā)生突變。實(shí)施例3:生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的獲得采用醋酸鋰法進(jìn)行載體的酵母轉(zhuǎn)化。其中整合型質(zhì)粒預(yù)先進(jìn)行線性化，以整合入釀酒酵母BY4742基因組相應(yīng)位點(diǎn)，游離型質(zhì)粒則直接轉(zhuǎn)化入釀酒酵母BY4742中。轉(zhuǎn)化后酵母采用SD-drop固體培養(yǎng)基(去氨基酵母氮源,6.7g/l ;葡萄糖，20g/l ；Dropout mix,0.2%；固體補(bǔ)加2%的瓊脂粉)進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，提取酵母質(zhì)?；蚧蚪M作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以排除假陽性的干擾。確認(rèn)正確的陽性菌株，平板劃線或甘油菌保存。利用酵母自身存在的MVA途徑，對(duì)該途徑涉及的關(guān)鍵基因HMG-CoA還原酶基因(HMGR)和FPP合酶基因(ERG20)進(jìn)行上調(diào)，同時(shí)引入GGPP合酶基因與紫杉二烯合酶基因，獲取具備生產(chǎn)紫杉二烯功能的釀酒酵母菌株(路線圖見圖3)。實(shí)施例4:酵母發(fā)酵培養(yǎng)驗(yàn)證正確的陽性轉(zhuǎn)化子,接菌入3ml SD-drop液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30h,轉(zhuǎn)接入50mlYPD(1%酵母浸粉；2%蛋白胨；2%葡萄糖)。使初始0D600值為0.05，30°C，200rpm培養(yǎng)70h。也可轉(zhuǎn)接至SD-Drop (去氨基酵母氮源,6.7g/l ;葡萄糖,20g/l ;Dropout mix,
0.2%)培養(yǎng)基中進(jìn)行 發(fā)酵。實(shí)施例5:酵母發(fā)酵產(chǎn)物的定性與定量A、產(chǎn)物的定性取400ul發(fā)酵液至1.5ml離心管中，加入等體積正己烷，超聲波處理20min，混合渦旋20min。4°C離心5min。取上層正己烷層，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。得到譜圖見圖4和圖5。B、標(biāo)準(zhǔn)品的獲得在3L發(fā)酵罐中，進(jìn)行2L體系的發(fā)酵罐發(fā)酵。每4_12h取樣一次，測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)物紫杉二烯積累曲線(圖6)。經(jīng)過66h發(fā)酵后，在發(fā)酵罐中加入300ml正己烷，密封發(fā)酵罐攪動(dòng)4h，靜置lh。取上層正己烷層，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以濃縮。濃縮液通過硅膠柱進(jìn)行分離純化。最終得到純度95%以上的紫杉二烯標(biāo)準(zhǔn)品(GC結(jié)果見圖7 ;核磁結(jié)果見圖8及圖9)。C、發(fā)酵產(chǎn)物的定量將分離純化得到的標(biāo)品配置濃度梯度，運(yùn)用GC繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍為10mg/L-100mg/L(圖10)。功能菌株發(fā)酵后萃取得到的樣品進(jìn)行測(cè)定，按擬合曲線公式計(jì)算產(chǎn)量，得到功能菌株產(chǎn)量78.6mg/L。所獲得菌株進(jìn)行過多次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，由于菌株自身質(zhì)粒穩(wěn)定性等原因，紫杉二烯產(chǎn)量處于50.5-102.3mg/L之間。將載體SyBE_001173、SyBE_001187導(dǎo)入到釀酒酵母W303-1A中，得到生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌。實(shí)驗(yàn)證明:所生產(chǎn)的紫杉二烯的產(chǎn)量高于現(xiàn)有技術(shù)，在25.2-45.6mg/L左右。
權(quán)利要求
1.一種紫杉二烯合酶基因，其特征是它是序列表SEQ ID NO: 11所述的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的一種紫杉二烯合酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征是它是序列表SEQIDNO: 12所述的氨基酸序列。
3.—種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟: (1)載體SyBE_001173的構(gòu)建: ①將啟動(dòng)子、GGPP合酶基因、終止子采用OE-PCR方法拼接起來，得到兩端包含HindIII和Apa I位點(diǎn)的片段，連接入游離型載體PRS425 ； ②將啟動(dòng)子、序列表SEQID NO: 11所示的紫杉二烯合酶基因、終止子采用OE-PCR方法拼接起來，得到兩端包含Sac I和HindIII位點(diǎn)的片段，連接入步驟①獲得的載體，得到載體SyBE_001173 ； (2)載體SyBE_001187的構(gòu)建: ①將酵母組成型啟動(dòng)子、tHMGR基因、終止子應(yīng)用OE-PCR法拼接起來，得到兩端包含Xho I和Apa I位點(diǎn)的片段，連接至整合型載體PRS403 ； ②將酵母組成型啟動(dòng)子、ERG20基因、終止子應(yīng)用OE-PCR法拼接起來，得到兩端包含Sac I和Xho I兩個(gè)位點(diǎn)的片段，連接至步驟①獲得的載體，得到載體SyBE_001187 ； 所述GGPP合酶基因是序列表SEQ ID N0:9所述的核苷酸序列；所述tHMGR基因是序列表SEQ ID NO: 3所述的核苷酸序列；所述ERG20基因是序列表SEQ ID NO: 7所述的核苷酸序列； (3)將所述載體SyBE_001 173、SyBE_001187導(dǎo)入到釀酒酵母W303-1A或釀酒酵母BY4742中，得到生產(chǎn)紫杉二烯 的酵母菌。
4.權(quán)利要求3的一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的構(gòu)建方法構(gòu)建的酵母菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌及構(gòu)建方法。一種生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌的構(gòu)建方法的步驟為(1)載體SyBE_001173的構(gòu)建；(2)載體SyBE_001187的構(gòu)建；(3)將所述載體SyBE_001173、SyBE_001187導(dǎo)入到釀酒酵母W303-1A或釀酒酵母BY4742中，得到生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌。本發(fā)明的生產(chǎn)紫杉二烯的酵母菌相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)更為環(huán)保、成本低廉，為紫杉二烯的生產(chǎn)提供了一種可行的方法。
文檔編號(hào)C12N15/60GK103146728SQ201310063739
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者元英進(jìn), 閆慧芳, 丁明珠, 賈云婧 申請(qǐng)人:天津大學(xué)