專利名稱：在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸c4生物合成途徑的基因及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一種含氧元素和氮元素的碳?xì)浠衔?，是生物體合成四氫吡咯的前體，還是卟啉、(亞鐵)血紅素、葉綠素以及維生素B12的結(jié)構(gòu)類似物。ALA是一種生理活性非?；钴S的非蛋白類氨基酸，其應(yīng)用范圍非常廣闊。在農(nóng)業(yè)上，作為一種光活化綠色無公害的除草劑、殺蟲劑、抗微生物藥劑和植物生長促進(jìn)劑而得到廣泛應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)上，ALA被應(yīng)用到癌癥的光動力學(xué)治療和診斷上；還具有促進(jìn)血紅素生成的作用。另外，5-氨基乙酰丙酸作為外用藥可用于痤瘡的治療和作為生發(fā)劑使用。ALA在生物體內(nèi)存在著兩條合成途經(jīng)(如

圖1所示)，一種途徑稱為碳四途徑(C4pathway),存在于動物、真菌和α家族細(xì)菌中，由5_氨基乙酰丙酸合酶(ALA synthase,ALAS)催化琥珀酰COA和甘氨酸縮合成ALA。另一條途徑被稱為碳五途徑(C5 pathway)，存在于植物、藻類以及大部分細(xì)菌中，ALA來源于谷氨酸的碳骨架，由3個酶催化。由碳四途徑和碳五途徑獲得的ALA均被共同的下游代謝酶ALA脫水酶催化形成膽色素原，然后進(jìn)一步向下游轉(zhuǎn)化。大腸桿菌本身通過C5途徑合成ALA，但是，由于大腸桿菌不需要合成葉綠素，僅需要以ALA為前體合成少量的維生素B12等四吡咯類化合物，因此其天然的ALA合成能力很弱。

目前，ALA的合成方法分為化學(xué)法和生物法兩種?；瘜W(xué)合成法合成步驟復(fù)雜，原料來途徑窄，合成造價較高，致使目前ALA產(chǎn)品市場價格昂貴(約326美元/克)，制約了它的推廣應(yīng)用。生物合成ALA因工藝簡單、產(chǎn)率高，具有工業(yè)化生產(chǎn)前景。近年來，國內(nèi)外研究者利用基因工程菌生產(chǎn)ALA已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。Kiatpapan和Murooka將類球紅細(xì)菌iM.sphaeroides)的ALA合成酶的基因在費(fèi)氏丙酸菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，ALA積累量達(dá)到
1.1g/L。Mariet和Zeikus通過過表達(dá)獲co/i重組菌,ALA發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了 3.79 g/L。Xie L.等利用含有基因的重組大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，ALA產(chǎn)量達(dá)到
5.2g/L。浙江大學(xué)Lin J.等通過優(yōu)化基因的表達(dá)和發(fā)酵條件，ALA產(chǎn)量達(dá)到7.3 g/L。但是上述有關(guān)ALA的合成方法中，只是針對基因進(jìn)行分子操作，所構(gòu)建的基因工程菌都僅限于過表達(dá)ALA合成酶一個基因，沒有強(qiáng)化C4生物合成途徑中的中間物的合成和強(qiáng)化ALA的分泌途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因及其構(gòu)建方法，對ALA合成酶基因(Ad)、輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(cat)以及ALA分泌基因(7^i)進(jìn)行基因操作，借助pETDuet-Ι共表達(dá)載體，構(gòu)建了一株具有較高表達(dá)水平的基因，通過共表達(dá)和YBi使細(xì)胞外ALA的產(chǎn)量達(dá)到1124 mg/L。 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所釆取的技術(shù)方案是:
一種在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因，借助pETDuet-Ι載體，共表達(dá)三個基因:ALA合成酶基因Ad、輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因cat和ALA分泌基因7仍.，所述工程菌序列如下:
權(quán)利要求
1.一種在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因，其特征在于借助pETDuet-Ι載體，共表達(dá)三個基因:ALA合成酶基因Ae▲輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因cat和ALA分泌基因！Si，所述基因序列如下:
2.一種如權(quán)利要求1所述的在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因的構(gòu)建方法，其特征在于其按照以下步驟順序進(jìn)行: (1)以Rhodobacter sphaeroides基因組為模板，利用引物hemA -F和hemA -R擴(kuò)增hemA基因; (2)通致以Propionibacteriumshermanil基因組為模板，利用和擴(kuò)增Cat基因； (3)ALA分泌基因Wi借助啟動子表達(dá)-.V丄Escherichiacoli基因組為模板，通過重疊PCR，利用引物Prom-F、Prom-R, Yb1-F、7況-7 得到含有完整表達(dá)盒的YBi基因； (4)各基因片段經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，并與pMD18-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化萬.co7i DH5a ； (5)涂布在含100μ g/L Amp的LB固體培養(yǎng)基上，藍(lán)白斑篩選的陽性克隆經(jīng)質(zhì)粒PCR及酶切鑒定后進(jìn)行測序； (6)共同表達(dá)載體pETA、pETAC、pETACY的構(gòu)建 質(zhì)粒pETDuet-Ι和質(zhì)粒pMD18-T- hemA分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，用T4DNA連接酶將兩片段連接得到質(zhì)粒pETA ;將質(zhì)粒pETA和質(zhì)粒pMD18-T-fei分別用限制性內(nèi)切酶Nde I進(jìn)行單酶切，回收兩目的片段，將Cat基因片段作為插入片段連接到PETA單酶切得到的較大片段上，得到重組質(zhì)粒pETAC ； 質(zhì)粒pETAC和質(zhì)粒pMD 18-T-7Si分別用限制性內(nèi)切酶Not I進(jìn)行單酶切，回收兩目的酶切片段，將ALA分泌基因Wi連接到pETAC單酶切得到的較大片段上，得到重組質(zhì)粒pETACY ;將以上構(gòu)建得到的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化萬.coli DH5 a，提取質(zhì)粒，采用酶切和PCR方法鑒定陽性克?。? (7)重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pETA、pETAC、pETACY分別轉(zhuǎn)化到E.coli BL21 (DE3)中，菌株分別命名為E.coli K,B.coli AC,B.coli ACY，挑取含重組質(zhì)粒的BL21 (DE3)單菌落，接種至含50 μ g/L Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，加入的甘氨酸終濃度為IOOmM ； 然后以1:100的比例接種至20mL的液體LB培養(yǎng)基中，37°C放大培養(yǎng)至0D600為0.6 0.8，然后降溫至28°C，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至終濃度為I mM，繼續(xù)培養(yǎng)12小時； (8 ) PT-PCR驗(yàn)證基因的轉(zhuǎn)錄 采用多糖多酚植物總RNA快速提取離心柱型試劑盒提取菌株疋coli ACY中的RNAJf提取的RNA作為第一鏈cDNA合成的模板，采用20 μ I的反應(yīng)體系，加入各種反應(yīng)試劑，輕輕混勻，42°C孵育 30min,85°C加熱 5min 使 EasyScript 失活； 取2μ I的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板，分別擴(kuò)增Xai及!Si基因，陽性對照組分別以pETA、pETAC、pETACY質(zhì)粒為模板擴(kuò)增、Cat及YBi。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因的構(gòu)建方法，其特征在于:所述的步驟(I)中的引物的序列為CGGAATTCGATGGACTACAATCTGGCACTCGATACCGC T ；hemA-R 的序列為 ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCAACGACCTCGGCG ； 相應(yīng)的酶切位點(diǎn)分別為EcoR I和Not I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建新型的5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑大腸桿菌基因的方法，其特征在于:所述的步驟(2)中的引物Cat-F的序列為GGAATTCCATATGAACGAACGCATCTCCA ； Cat-R 的序列為 GGAATTCCATATGTCAACGGTAGTGCGAAAGC ;相應(yīng)的酶切位點(diǎn)分別為 Nde I。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因的構(gòu)建方法，其特征在于:所述的步驟(3)中的引物/的序列為AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCCGCATAATCGAAATTAATAC ； Prom-R 的序列為 ACGTAATGAACCAGGCATTATATCTCCTTCTTATACTT ； 7辦i的序列為 AGAAGGAGATATAATGCCTGGTTCATTACGT ； Yb1-R 的序列為 AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATTAATGTCTAATTCTTTTAT 'Prom-F取 Yb1-R 的酶切位點(diǎn)為Not I。
全文摘要
本發(fā)明公開了在大腸桿菌構(gòu)建5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的基因及其構(gòu)建方法，通過分析5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途徑的限速步驟、中間體供給及產(chǎn)物分泌等問題，克隆Rhodobactersphaeroides來源的ALA合成酶基因(hemA)、Propionibacteriumshermanil來源的輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(Cat)以及Escherichiacoli來源的ALA分泌基因(YBi)，借助pETDuet-1共表達(dá)載體，共表達(dá)了合成5-氨基乙酰丙酸的hemA、生成5-氨基乙酰丙酸合成的中間體琥珀酸COA的Cat和促進(jìn)5-氨基乙酰丙酸的分泌的Ybi，三個基因的共表達(dá)加強(qiáng)了5-氨基乙酰丙酸的生物合成，通過本發(fā)明所制備的具有C4生物途徑的基因，提高了Escherichiacoli的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量，分泌到細(xì)胞外的ALA達(dá)到1124mg/L。
文檔編號C12N15/70GK103146694SQ20131006323
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者馮惠勇, 劉天佳, 李天明, 戴寶新, 劉靜文 申請人:河北科技大學(xué)