專利名稱：一種設(shè)計(jì)堿基替換或插入缺失的snp分子標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于SNP檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種設(shè)計(jì)堿基替換或插入缺失的SNP分子標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記技術(shù),屬于新一代的標(biāo)記技術(shù)。常用來表不不同生物個(gè)體在同一等位基因處個(gè)別堿基的差異，常常出現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性有堿基替換、堿基的插入缺失。目前，SNP是所發(fā)現(xiàn)的生物中存在最廣泛的變異類型，即使在不同生物個(gè)體中序列差異不大的基因中也存在一定數(shù)量的SNP位點(diǎn)，因此是植物遺傳研究中理想的分子標(biāo)記。作為新興的分子標(biāo)記，SNP有如下優(yōu)點(diǎn):數(shù)量多分布廣，SNP比微衛(wèi)星標(biāo)記密度更高，是等位基因間序列差異最為普遍的類型；SNP具有二態(tài)性特點(diǎn)，其不再以DNA序列長度的不同來檢測多態(tài)性，能夠用不同的方法進(jìn)行基因的檢測；在啟動子區(qū)的SNP可能對基因的表達(dá)造成影響，而在編碼序列的SNP可能會影響到所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，是目前遺傳研究的熱點(diǎn)。目前，檢測SNP的方法很多，常用的有如下幾種:利用生物信息學(xué)的方法在已有的DNA數(shù)據(jù)庫中搜索SNP，這種方法比較直接、快捷；單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)，通過個(gè)別堿基的變化影響DNA的構(gòu)象的原理來檢測SNP，操作簡單、經(jīng)濟(jì)、適用面廣。但影響因素較多，如電泳溫度、凝膠濃度均可影響其靈敏性，所以穩(wěn)定性不高；酶切法，基因中個(gè)別堿基的變化，可造成原來基因中部分酶切位置的變化，通過特異酶切割所擴(kuò)增的序列，產(chǎn)生大小不一的切割片段，再利用簡單的檢測手段來可達(dá)到區(qū)分該位點(diǎn)的目的。酶切檢測法方便、準(zhǔn)確，但只能分析酶切位點(diǎn)處的SNP，而不能檢測酶切位點(diǎn)以外的SNP，所以有一定局限性；雜交法，如DNA芯片技術(shù)，可以大大提高檢測速度，但價(jià)格較昂貴；測序法，對不同個(gè)體等位基因片段進(jìn)行測序分析，檢測序列中的堿基變異。該法直觀、準(zhǔn)確，但工作量大，價(jià)格昂貴；PCR法，利用引物序列3'端的SNP不能與模板有效結(jié)合，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增結(jié)果的不一，通過特定的手段檢測PCR結(jié)果來達(dá)到確定SNP位點(diǎn)的目的。PCR法方便快捷但受較多其它因子的干擾，重復(fù)性較差。利用SNP標(biāo)記，人們已成功標(biāo)記了一些抗病、抗逆和優(yōu)質(zhì)基因(Buren etal.2000 ；Brooks et al.2006 ；Mondini et al.2012)。從以上方法可以看出，目前常用的方法存在穩(wěn)定性不高、有一定局限性、價(jià)格較昂
貴、重復(fù)性差等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種設(shè)計(jì)堿基替換或插入缺失的SNP分子標(biāo)記的方法，在獲得基因序列后，針對該基因的變異開發(fā)相應(yīng)的功能標(biāo)記，對研究基因的功能并有效利用該基因提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種設(shè)計(jì)堿基替換或插入缺失的SNP分子標(biāo)記的方法，該方法將所發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物3'位置；該方法通過兩次PCR，再通過技術(shù)檢測PCR結(jié)果，確定出個(gè)體SNP位點(diǎn)的基因型。進(jìn)一步，該方法引物設(shè)計(jì)方法為:兩個(gè)個(gè)體相同的基因處有一個(gè)T堿基和C堿基的替換，由Allelel特異位點(diǎn)T設(shè)計(jì)特異引物P1，同樣由Allele2特異位點(diǎn)C設(shè)計(jì)特異引物P2 ;兩對引物在Genotypel中擴(kuò)增時(shí)，Pl引物能夠正常擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，P2引物不能正常擴(kuò)增而沒有PCR產(chǎn)物，確定該基因的基因型為TT ;用相同的方法擴(kuò)增可以確定Gen0type2基因型為CC ;若兩者都能得到擴(kuò)增產(chǎn)物，可確定Genotype3基因型為TC，從而分析出SNP位點(diǎn)。本發(fā)明提供的方法針對由于平常所用的TaqDNA聚合酶要進(jìn)行正常擴(kuò)增，其5'可以不需要與模板完全匹配，而其3'要求完全配對。針對這個(gè)特性，可以特異地將所發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物3'位置；針對突變型的基因設(shè)計(jì)的引物與野生型的基因會形成3'端錯(cuò)配，導(dǎo)致不能正常擴(kuò)增；同樣以野生基因設(shè)計(jì)的引物與突變型基因的3'端產(chǎn)生錯(cuò)配，也同樣在突變型個(gè)體基因組中不能正常擴(kuò)增。本發(fā)明通過兩次PCR，再通過特定技術(shù)檢測PCR結(jié)果，可以方便地知道該個(gè)體SNP位點(diǎn)的基因型。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的等位基因特異PCR技術(shù)原理圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的AS-PCR引物設(shè)計(jì)；黑體表示加入的錯(cuò)配堿基；圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的AS-PCR引物組合篩選圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的部分F2后代基因分型結(jié)果；泳道1-20為F2代第300-319個(gè)單株的基因型結(jié)果；`圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的AS-PCR引物在24個(gè)品種中的擴(kuò)增；M:DNA Ladder ；1中國春；2蘭考大粒；3長武0318 ；4鄭麥366 ；5煙農(nóng)192 ；6西農(nóng)979 ；7皖麥38 ；8濟(jì)麥22 ；9鄭麥9623 ；10皖麥50 ；11小偃22 ；12周麥18 ；13四川大粒；14陜麥229 ；15淮麥20 ；16西農(nóng) 2611 ;17 西農(nóng) 9871 ;18 蘭考 185 ;19 鄭麥 0856 ；20 明賢 169 ；21BYL3 ;22 大地 98 ;23 宿7075 ;24 徐麥 9074 ；圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的5個(gè)品種的籽粒圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。如圖1表示的是該技術(shù)引物設(shè)計(jì)原理，兩個(gè)個(gè)體相同的基因處有一個(gè)T堿基和C堿基的替換。這樣可以由Al I e I e I特異位點(diǎn)T設(shè)計(jì)特異引物PI，同樣由Al I e I e2特異位點(diǎn)C設(shè)計(jì)特異引物P2(圖1A)。兩對引物在Genotypel中擴(kuò)增時(shí)，Pl引物能夠正常擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，P2引物不能正常擴(kuò)增而沒有PCR產(chǎn)物(圖1B)，可以確定該基因的基因型為TT;用相同的方法擴(kuò)增可以確定Genotype2基因型為CC ;若兩者都能得到擴(kuò)增產(chǎn)物,可確定Genotype3基因型為TC。這樣可通過簡單的電泳技術(shù)來分析該SNP位點(diǎn)(圖1C)。本發(fā)明用克隆的小麥粒重基因TaGW2的大小粒品種堿基差異為例，該基因全長cDNA1275bp,大粒品種蘭考大粒在977bp處和小粒品種中國春相比有一個(gè)“T”堿基的插入，其余部分堿基基本相同，如圖2所示，在突變位點(diǎn)處，根據(jù)蘭考大粒的序列設(shè)計(jì)了三個(gè)引物:F4、F6和R4。其中F4、F6為上游引物分別在其3'端第2位和第3位加入錯(cuò)配堿基G ；R4為下游引物在其3'端第2位加入了錯(cuò)配堿基G。由中國春的序列設(shè)計(jì)一個(gè)引物F5，在其3 ^端第2位引入錯(cuò)配堿基G。此外，還分別在突變位點(diǎn)兩側(cè)200bp處設(shè)計(jì)一對內(nèi)參引物F3和R3，擴(kuò)增片段長度約540bp。通過特異引物F4、F5、F6和R4分別與內(nèi)參引物F3和R3組合，便形成了 4 套引物組合(TaGW2-AS-Pl、TaGW2_AS_P2、TaGW2_AS_P3 和 TaGW2_AS_P4)，用于擴(kuò)增蘭考大粒和中國春的特異序列。以蘭考大粒特異引物組合(TaGW2-AS-Pl、TaGW2-AS-P3和TaGW2-AS-P4)結(jié)合中國春特異引物組合(TaGW2_AS_P2)可鑒定基因型。引物序列列于表I中，由大連寶生物生物工程有限公司合成。表I AS-PCR引物設(shè)計(jì)；黑體表示加入的錯(cuò)配堿基
權(quán)利要求
1.一種設(shè)計(jì)堿基替換或插入缺失的SNP分子標(biāo)記的方法，其特征在于，該方法以已知功能基因SNP突變位點(diǎn)為參照，將此位點(diǎn)設(shè)計(jì)在特異引物的3'位置；通過分別設(shè)計(jì)Allelel和Allele2特異位點(diǎn)兩對引物，通過兩次PCR，再通過技術(shù)檢測PCR結(jié)果，確定出個(gè)體SNP位點(diǎn)的基因型，通過標(biāo)記功能驗(yàn)證及穩(wěn)定性檢測，將該分子標(biāo)記用于輔助選擇育種。
2.如權(quán)利要求1所述的設(shè)計(jì)堿基替換或插入缺失的SNP分子標(biāo)記的方法，其特征在于，該方法引物設(shè)計(jì)方法為: 兩個(gè)個(gè)體相同的基因處有一個(gè)T堿基和C堿基的替換，由Allelel特異位點(diǎn)T設(shè)計(jì)特異引物PI，同樣由Al I e I e2特異位點(diǎn)C設(shè)計(jì)特異引物P2 ;兩對引物在Genotype I中擴(kuò)增時(shí)，PI引物能夠正常擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，P2引物不能正常擴(kuò)增而沒有PCR產(chǎn)物，確定該基因的基因型為TT ;用相同的方法擴(kuò)增可以確定Gen0type2基因型為CC ;若兩者都能得到擴(kuò)增產(chǎn)物，可確定Genotype3基因型為 TC，從而分析出SNP位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種設(shè)計(jì)堿基替換或插入缺失的SNP分子標(biāo)記的方法，該方法針對由于平常所用的TaqDNA聚合酶要進(jìn)行正常擴(kuò)增，其5′可以不需要與模板完全匹配，而其3′要求完全配對。針對這個(gè)特性，可以特異地將所發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物3′位置；針對突變型的基因設(shè)計(jì)的引物與野生型的基因會形成3′端錯(cuò)配，導(dǎo)致不能正常擴(kuò)增；同樣以野生基因設(shè)計(jì)的引物與突變型基因的3′端產(chǎn)生錯(cuò)配，也同樣在突變型個(gè)體基因組中不能正常擴(kuò)增。本發(fā)明通過兩次PCR，再通過特定技術(shù)檢測PCR結(jié)果，可以方便地確定該個(gè)體SNP位點(diǎn)的基因型。
文檔編號C12Q1/68GK103146823SQ201310062218
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月27日
發(fā)明者李學(xué)軍, 楊子博, 李立群, 吳青霞, 楊林, 邵慧, 冉從福 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)