專利名稱：華南美麗葡萄花青素還原酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及通過合成華南美麗葡萄cDNA、PCR和重組表達(dá)技術(shù)獲得花青素還原酶基因及其編碼產(chǎn)物，屬于分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物有效成分(次生代謝產(chǎn)物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，經(jīng)濟(jì)作物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究成為熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，這些基因的克隆將為解析經(jīng)濟(jì)作物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制和解釋作物品質(zhì)的形成提供理論依據(jù)，同時為利用生物技術(shù)進(jìn)行作物品質(zhì)改良、分子遺傳育種和作物抗逆性等帶來廣闊的應(yīng)用前景。原花青素(Proanthocyanidins, PA)又稱縮合單寧,是高等植物特有并廣泛存在的聚多酚類化合物。具有抗紫外線、抗病、抗蟲、清除自由基、調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)等生理功能；從食物中攝取寡聚原花青素可以抗衰老，預(yù)防心血管疾病、癌癥、阿茲海默氏病等疾病，享有多方面的保健和藥用價值?；ㄇ嗨剡€原酶(anthocyanidin reductase,ANR)是原花青素類化合物合成下游途徑中的關(guān)鍵酶，也是原花青素單體合成的直接酶類，在原花青素生物合成途徑中具有重要的調(diào)節(jié)作用。葡萄除作為重要的經(jīng)濟(jì)作為外，其葡萄籽和皮中原花青素含量豐富，是提取原花青素的主要原材料。目前，我國葡萄種植主要為歐洲品種，本土豐富的野生資源未有得到開發(fā)利用。因此從野生葡萄資源中獲得花青素還原酶基因，將為通過代謝工程手段改良葡萄或其他作物品質(zhì)和分子遺傳育種等提供重要基礎(chǔ)。在本次發(fā)明公布之前，僅有歐洲釀酒葡萄(Vitis vinifera)有關(guān)花青素還原酶基因的報道，尚未有公開或報道過野生葡萄--華南美麗葡萄(Vitis bellula)花青素還原酶基因及其氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種華南美麗葡萄花青素還原酶基因(ANR)及其編碼的蛋白與應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種華南美麗葡萄花青素還原酶基因，核苷酸序列為:(I)SEQ ID N0.1 的 DNA 序列；或(2)編碼SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有上述SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的華南美麗葡萄花青素還原酶。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含 有上述的華南美麗葡萄花青素還原酶基因全部或部分序列的重組載體。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有上述的華南美麗葡萄花青素還原酶基因全部或部分序列的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述的華南美麗葡萄花青素還原酶基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和代謝工程手段在葡萄或牧草品質(zhì)改良、農(nóng)產(chǎn)品脫澀、茶多酚分子育種、作物抗病蟲害中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的花青素還原酶基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明提供的花青素還原酶基因可以通過生物技術(shù)提高葡萄中原花青素類活性成分的含量，同時可以進(jìn)行牧草品種改良、農(nóng)產(chǎn)品脫澀、茶多酚的分子育種、作物抗病蟲害的提高等，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1:華南美麗葡萄總RNA和ANR基因的PCR擴(kuò)增電泳圖；圖2:大腸桿菌表達(dá)載體pET_32a(+)/ANR構(gòu)建圖；圖3:重組花青素還原酶表達(dá)和純化SDS-PAGE圖；M，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1，重組菌破壁后上清液；2，重組菌全菌；3，重組菌破壁后沉淀部分；4，空載體重組菌；Trx-VbANR，純化的重組花青素還原酶；圖4:重組花青素還原酶活性HPLC檢測圖；a，花青素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖；b，Trx-VbANR酶促反應(yīng)產(chǎn)物HPLC圖(EC，表兒茶素)。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供一種華南美麗葡萄花青素還原酶基因(ANR)。本發(fā)明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的華南美麗葡萄花青素還原酶(ANR)，為以下核苷酸序列之一:(I)SEQ ID N0.1 的 DNA 序列；(2)編碼SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；本發(fā)明所提供的華南美麗葡萄花青素還原酶(ANR)，其特征在于，是一下氨基酸序列之一:具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；含有本發(fā)明的華南美麗葡萄花青素還原酶基因全序列或部分序列的重組載體，如原核類載體，真核類表達(dá)載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
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含有本發(fā)明的華南美麗葡萄花青素還原酶基因全序列或部分序列的宿主細(xì)胞，如含有上述的重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述宿主細(xì)胞為有價值的活性材料。本發(fā)明的華南美麗葡萄花青素還原酶基因的應(yīng)用，包括用所述的重組載體，如植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因的植物發(fā)根系；或者用所述的發(fā)根細(xì)胞再生植株；或者用所述的華南美麗葡萄花青素還原酶基因全序列或部分序列轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因生物體。本發(fā)明技術(shù)方案中涉及的概念具體內(nèi)容如下:“華南美麗葡萄花青素還原酶”基因(ANR)指:編碼具有華南美麗葡萄花青素還原酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中第1-1017位核苷酸序列?！叭A南美麗葡萄花青素還原酶蛋白或多肽(ANR) ”指:具有華南美麗葡萄花青素還原酶活性的SEQ ID N0.2序列的多肽。該術(shù)語還包括華南美麗葡萄花青素還原酶的活性片段和活性衍生物，還包括能夠可操作地連于信號肽、啟動子或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列所組成的衍生物。本發(fā)明還包括花青素還原酶或多肽的類似物。這些類似物與天然華南美麗葡萄花青素還原酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。所述修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括:體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化修飾的酶(如哺乳 動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明中的華南美麗葡萄花青素還原酶多肽時，可以將華南美麗葡萄花青素還原酶基因的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成華南美麗葡萄花青素還原酶表達(dá)載體。所述“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其他植物細(xì)胞。發(fā)明還可用Northern印跡法技術(shù)分析華南美麗葡萄花青素還原酶基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析華南美麗葡萄花青素還原酶的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在和數(shù)量。此外，本發(fā)明可用作探針的核酸分子通常具有華南美麗葡萄花青素還原酶基因核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼華南美麗葡萄花青素還原酶的核酸分子。本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在華南美麗葡萄花青素還原酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于華南美麗葡萄花青素還原酶核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。實(shí)施例1、華南美麗葡萄cDNA的合成1、華南美麗葡萄總RNA的提取與檢測取華南美麗葡萄(Vitis bellula)嫩葉2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末，快速轉(zhuǎn)移至 65 °C 預(yù)熱的 IOmL 提取緩沖液中[CTAB (W/V) 2 %，Tris-HCl (pH8.0) IOOmmoI/L，EDTA25mmol/L, NaC12.0mol/L，PVP402 %，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% ]，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提2次，7500g離心15min。上清液加入1/4體積的IOM LiCl,混合后放置 4 °C 沉淀過夜；7500g 離心 20min,沉淀用 500 μ L SSTE[SDS0.5 %, NaCllmol/L,Tris-HCl (pH8.0) 10mmol/L, EDTAlmmol/L],在 65°C溶解 5min。用等體積氯仿抽提，13000g離心5min，上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2h，4°C 13000g離心20min，沉淀室溫干燥IOmin后溶于100 μ LDEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用Eppendorf核酸定量儀測定Α260、Α280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA米用mRNA純化試劑盒(PolyATractmRNA isolation system III,Promega公司)分離mRNA后,采用TaKaRa公司提供的PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒,合成蛇足石杉mRNA第一互補(bǔ)鏈DNA。實(shí)施例2、花青素還原酶基因的克隆從NCBI中搜索花青素還原酶基因相關(guān)的核苷酸序列和EST序列，通過比對分析，利用vector NTI軟件設(shè)計一對擴(kuò)增引物ANR-F (ATGGCCACCCAGCAC CCCAT)和ANR-R (TCAATTCTGCAATAGCCCCTTGGC)。以華南美麗葡萄的cDNA為模板，按照以下體系[IOXEx PCR buffer 5.0 μ L, dNTP(2.5mM)4.Ομ L,弓丨物 LDC-F 和 LDC-R(IOpmol)各l.0yL, Ex Taq 聚合酶 0.25 μ L, cDNA4.0 μ L，補(bǔ)加 ddH20 至終體積 50.0yL]擴(kuò)增 LDC 基因；反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)；72°C終延伸10min，4°C保存。擴(kuò)增結(jié)果于I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0 純化 PCR產(chǎn)物,然后克隆到pMD 19_T
載體中，提取陽性克隆子送TaKaRa公司測序，獲得華南美麗葡萄花青素還原酶相關(guān)基因序列。利用Vector NTI軟件分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有完整開放閱讀框，長度為1017 bp，可編碼338個氨基酸，將該基因分別命名為ANR。實(shí)施例3、花青素還原酶基因的原核表達(dá)1、原核表達(dá)載體的構(gòu)建以T 載體中的 ANR 為模板，利用引物 Pl (CATGCCATGGCCACCCAG CACCCCAT)和 P2 (CCGCTCGAGTCAATTCTGCAATAGCCCCTTG)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測和純化后，用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I在37°C酶切2h，采用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物；同時利用Nco I和Xho I在37°C酶切pET-32a(+)載體2h，利用試劑盒回收大片段。將回收的兩個片段混合，在DNA連接酶作用下于16°C反應(yīng)12h，連接產(chǎn)物利用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，在氨芐和氯霉素抗性平板上進(jìn)行抗性篩選，并對克隆子進(jìn)行全菌PCR檢測，將陽性克隆子接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行Nco I和Xho I雙酶切分析，瓊脂糖凝膠電泳鑒定完全酶切后存在兩個片段，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。命名為:pET-32a(+) /ANR (圖 2)。2、花青素還原酶基因的可溶性表達(dá)將篩選獲得的陽性克隆子接種到含有氨芐青霉素(終濃度100 μ g/mL)和氯霉素(終濃度170μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 150r/min培養(yǎng)3_4h后使用分光光度計檢測菌體密度，0D_約為1.0時添加IPTG (終濃度260 μ g/mL)誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，取1mL菌液于1.5mL離心管中，離心收集菌體，用ImL的PBS(50mM pH7.0)洗滌和重懸菌體，重懸菌液分2份，其中一份加入2μ L溶菌酶(100mg/mL)，室溫靜置10min后在液氮中反復(fù)凍融3次，12000rpm離心IOmin,分別收集上清液和沉淀。分別在上清、沉淀、全菌中加入等體積的2 X loading buffer,沸水浴3min,短暫離心后使用10%的SDS-PAGE電泳檢測分析(圖3)。實(shí)施例4、重組花青素還原酶的純化和活性鑒定1、重組花青素還原酶的純化大量培養(yǎng)重組菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，PBS反復(fù)洗滌3次，使用N1-NTASefinoseTM Resin蛋白純化試劑盒(上海生工)中的binding buffer重懸菌體,溶菌酶酶解，冰浴超聲破碎細(xì)胞，12000rpm離心30min收集上清；根據(jù)融合蛋白上的His-Tag采用N1-NTA純化柱純化重組花青素還原酶，分管收集純化液，10%的SDS-PAGE電泳檢測純化效果(圖3)。2、重組花青素還原酶活性鑒定在檸檬酸緩沖液(lOOmM，pH4.0)中配制酶反應(yīng)體系(ImL)，使各試劑終濃度分別為:花青素(cyanidin) 100 μ M、NADPHl.0mM,500 μ g 重組酶(Trx-VbANR)。將反應(yīng)體系于40°C水浴45min，然后加入2mL乙酸乙酯萃取酶反應(yīng)產(chǎn)物，離心收集萃取液，濃縮至干，用50 μ L甲醇溶解。 高效液相色譜(HPLC)檢測:采用LC-20A高效液相色譜儀(島津，日本)，色譜條件:色譜柱 Diamonsil C18 (250_Χ 4.6mm, 5 μ m)、流動相甲醇-0.08Μ 醋酸銨(25: 75)、流速lmL/min、檢測波長280nm、柱溫25°C、進(jìn)樣量20 μ L。分別吸取花青素標(biāo)準(zhǔn)品(底物)和酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析(圖4)以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種華南美麗葡萄花青素還原酶基因，其特征在于，核苷酸序列為:(1)SEQ ID N0.1 的 DNA 序列；或 (2)編碼SEQID N0.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
2.一種具有權(quán)利要求1所述SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的華南美麗葡萄花青素還原酶。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的華南美麗葡萄花青素還原酶基因全部或部分序列的重組載體。
4.一種含有權(quán)利要求1所述的華南美麗葡萄花青素還原酶基因全部或部分序列的宿主細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的華南美麗葡萄花青素還原酶基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和代謝工程手段在葡萄或牧 草品質(zhì)改良、農(nóng)產(chǎn)品脫澀、茶多酚分子育種、作物抗病蟲害中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種華南美麗葡萄花青素還原酶基因及其編碼的蛋白與用途，該基因?yàn)槭状螐娜A南美麗葡萄的cDNA中獲得，填補(bǔ)了我國葡萄資源中分子克隆出花青素還原酶基因的空白。本發(fā)明所提供的花青素還原酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明提供的花青素還原酶基因可以通過生物技術(shù)提高葡萄中原花青素類活性成分的含量，同時可以進(jìn)行牧草品種改良、農(nóng)產(chǎn)品脫澀、茶多酚的分子育種、作物抗病蟲害的提高等，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/02GK103146719SQ20131006133
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者彭清忠, 杜次, 朱越, 李菁 申請人:吉首大學(xué)