一種與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)的分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子標記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種作為綿羊標記輔助選擇應用的與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)的分子標記的制備方法及其應用。所述的分子標記由FSHR基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。在序列表SEQIDNO：1的第88bp處有1個T88-C88的堿基替換，導致BsiEⅠ-RFLP酶切多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴增FSHR基因部分DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性檢測的方法，為綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。
【專利說明】一種與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)的分子標記及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子標記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種作為綿羊標記輔助選擇應 用的與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)的分子標記的制備方法及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)FA0(2012)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國現(xiàn)有綿羊1. 87億只，占世界飼養(yǎng)量（11. 69億只） 的16%，居世界首位（http://www. fao. org/home/en/)，是最大的羊肉生產(chǎn)和消費國。綿羊 的群體遺傳改良對保障羊肉供給，促進國民經(jīng)濟發(fā)展和提高人們生活水平具有重要意義。 綿羊的繁殖性狀，尤其產(chǎn)羔數(shù)是現(xiàn)代養(yǎng)羊生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟性狀之一。隨著國家生態(tài)保 護戰(zhàn)略的實施，放牧養(yǎng)羊的空間越來越小，要滿足不斷增加的羊肉市場需求，只能增加舍飼 養(yǎng)羊的數(shù)量。舍飼養(yǎng)羊的成本中，母羊飼養(yǎng)的成本占飼養(yǎng)成本的60%以上，提高每只母羊的 產(chǎn)羔數(shù)能顯著增加養(yǎng)羊生產(chǎn)者的經(jīng)濟效益。我國部分地方綿羊品種具有一年四季發(fā)情、產(chǎn) 羔率高等優(yōu)良種質(zhì)特性，其中湖羊和小尾寒羊尤為突出。由于我國地域遼闊、生態(tài)經(jīng)濟條件 多樣，養(yǎng)羊生產(chǎn)受自然條件的制約比較明顯，羊肉生產(chǎn)的主體仍是適應性強、繁殖力低、產(chǎn) 肉性能低的地方品種及其雜種群體。同時，盡管湖羊和小尾寒羊等品種繁殖性能突出，已經(jīng) 成為原產(chǎn)區(qū)乃至部分引種成功地區(qū)規(guī)模化舍飼養(yǎng)羊的當家母本，由于其肉用性能與國外引 進的專門化肉用品種相比仍有很大的差距，在繁育體系不健全、雜交無序的雜種優(yōu)勢利用 方式下，相當一部分群體容易在引入地被國外引進的專門化肉用品種改良，其中二代以上 的雜種群體繁殖性能明顯下降。顯然，我國綿羊群體的繁殖性能總體仍然比較低，在舍飼養(yǎng) 羊比重不斷增大的大背景下，繁殖性能和產(chǎn)肉性能的遺傳改良是當前乃至今后一段時間內(nèi) 我國綿羊群體遺傳改良的重點，而繁殖性能遺傳改良的重點應放在產(chǎn)羔數(shù)性狀上。
[0003] 繁殖性狀屬閾性狀，是一種低遺傳力（平均0. 1)的性狀，并且在不同環(huán)境和不 同飼養(yǎng)條件下產(chǎn)羔數(shù)也受到一定影響，因此常規(guī)育種方法遺傳改良進展緩慢，亟需人們 加深對繁殖性狀遺傳機制的了解，以促進綿羊繁殖性狀的遺傳改良。繁殖性狀受微效多 基因控制，而且為加性-顯性基因作用模式。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標記 已在綿羊生產(chǎn)中廣泛應用，并取得了一定成績。對于綿羊繁殖性狀候選基因的研究，最 早且作用機制相對最清楚的是FecB基因，它是于1980年由Davis在Booroola綿羊的 常染色體上發(fā)現(xiàn)的，具有提高排卵率和產(chǎn)蓋數(shù)等生物學作用（Davis GH等，Segregation of a major gene influencing fecundity in progeny of Booroola sheep. NZJ Agric Res, 1982，25:525-529 ;C. J. H. Souza 等，Secretion of Inhibin A and Follicular Dynamics throughout the Estrous Cycle in the Sheep with and without the Booroola Gene (FecB). Endocrinology，1997，138 (12) : 5333-5340)。之后，Mulsant 等和 Wilson 等幾乎同時報道 了將FecB基因定位于綿羊6號染色體6q23-31，并發(fā)現(xiàn)該基因是由于BMPR-IB基因高度保 守的胞內(nèi)激酶信號區(qū)域一個突變（Q249R)的結(jié)果（Wilson T等，Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular (ALK-6) that is expressed in both oocyte sand granulosa cells. Biol Reprod，2001，1225-1235 ;Mulsant P 等，Mutation in bone morphogenetic protein receptor-IB is associated with increased ovulation rate in Booroola Merino ewes. Proc Natl Acad Sci USA, 2001，98: 5104-5109)。Souza 等將 Booroola羊與普通綿羊的cDNA進行比對時發(fā)現(xiàn)830bp處有一個A>C突變，使BMPR-IB 的胞內(nèi)信號區(qū)第249位氨基酸由Glu變成Arg (Q249R)，從而導致Booroola母羊出現(xiàn)超 多產(chǎn)蓋數(shù)基因型（Souza C J 等，The Booroola (FecB) Phenotype is assoeiated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type IB (BMPR-IB) gene. J Endoerinol, 2001，169(2) :1-6)。隨后FecXI、FecXH、FecX2W、⑶F9等影響綿羊繁殖性狀的候選基因相 繼被鑒定出來，其中 FecXI、FecXH 被定位于 Χρ11·2_ρ11.4 (Davis GH. Discovery of the inverdale gene (fecXI). Proceeding of the New Zealand Society of Animal Production, 1995(55) :289-290)。儲明星等采用PCR-SSCP的方法對BMP4基因進行多態(tài)性分析，發(fā) 現(xiàn)其也是影響小尾寒羊產(chǎn)蓋數(shù)的基因 （Chun Μ X等，Polymorphism of BMP4 Gene and Its Relationship with Prolificacy of Small Tail Han Sheep. Journal of Agricultural Biotechnology. 2008, 16(2) :237-241)。董文艷等采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)ESR基因?qū)虍a(chǎn) 羔數(shù)也有顯著的影響(董文艷.湖羊ESR基因的檢測及基因型與多態(tài)性能的關(guān)系.杭州：浙 江大學.2009)。
[0004] FSHR (促卵泡素受體）屬G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的糖蛋白亞家族成員，由胞外 區(qū)、跨膜區(qū)和C-末端區(qū)構(gòu)成。它包括至少10個亮氨酸豐富的重復單位（LPR)，每個約有24 個氨基酸殘基。與FSH產(chǎn)生特異性結(jié)合的位點位于LPR5-LPR10之間；7個α螺旋構(gòu)成的 跨膜結(jié)構(gòu)是G蛋白偶聯(lián)受體家族的特征性基序。FSHR基因的cDNA于1990年首次被克隆 (Sprengel R等，The testicular receptor for follicle-stimulating hormone: structure and functional expression of cloned cDNA. Mol Endocrinol, 1990, 4(4) :525-530), FSHR 突變對生殖表型具有深刻的影響（Aittomaki K等，Mutation in the folliclestimulating hormone receptor gene causes hereditary hypergonadotropic ovarian failure. Cell，1995,82(6) :959-968)。FSHR在動物繁殖活動中具有傳遞促卵泡生長發(fā)育生物學 信息的作用，其基因突變可能增強或削弱轉(zhuǎn)導FSH信息的功能，對生殖表型具有深刻的影 響。人的FSHR基因位于2號染色體短臂2區(qū)1帶，包括10個外顯子和9個內(nèi)含子（Gmmoll J 等，Localization of the human FSH receptor to chromosome 2 p21 using a genomic probe comprising exon 10,Mol. EndocrinoL，1994 (12):265-271 ;Rousseau_Merck 等，The chromosomal localization of the human follicle-stimulating hormone receptor gene on 2p21-pl6 is similar to that of the luteinizing hormone receptor gene, Genomics, 1993(15) : 222-224)。Satoko Sudo 等（2002)用 PCR-SSCP 分析 FSHR 基因 多態(tài)性，檢測其基因型頻率，研究表明激素水平及一些婦科病與FSHR基因多態(tài)性相關(guān)。國 內(nèi)在二花臉豬上檢測到了 FSHR基因座位的多態(tài)性，研究結(jié)果表明，在FSHR基因座位發(fā)現(xiàn)的 這個PCR-SSCP標記與二花臉豬的產(chǎn)活仔數(shù)顯著相關(guān)，基因型的不同可導致豬的產(chǎn)活仔數(shù) 有顯著差異（陳杰等，二花臉豬足嗍位PCR-SSCP標記與產(chǎn)活仔數(shù)的關(guān)系.南京農(nóng)業(yè)大學學 報，2002,25(3):53-56)。1^1 &1等報道，牛？5冊基因的第10外顯子存在多態(tài)性（1^1&1? 等，Polymorphisms in the bovine follicle -stimulating hormone receptor gene. Anita Genet, 2000, 31 (4) :280-281)。雷雪芹等以秦川牛和荷斯坦奶牛的雙胎母牛和單胎母牛為 實驗材料，以牛的FSHR基因的第10個外顯子作為標記牛雙胎性狀的候選基因，用SNP法進 行了多態(tài)檢測，得出FSHR基因的第10個外顯子有可能作為雙胎性狀的候選基因的這一結(jié) 論(雷學芹等，牛FSHR基因第10外顯子單核苷酸多態(tài)性及其與雙胎性狀的關(guān)系.中國生物 化學與分子生物學報.2004,10(1) :34-37)。
[0005] 通過以上資料我們可以得出FSHR基因參與動物繁殖調(diào)控過程并發(fā)揮著重要的作 用。尋找基因中的變異位點，通過與性狀間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)基因與性狀間的關(guān)系是研究基 因功能的一個重要手段，也是進行標記輔助選擇的基礎(chǔ)。為此開展了綿羊FHSR基因部分 5' -UTR (Untranslated Regions，非翻譯區(qū)）序列的克隆和SNP篩查、檢測及與產(chǎn)羔數(shù)性狀 關(guān)聯(lián)分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克隆一種作為綿羊標記輔助選擇的與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)的 分子標記，并建立適用于綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的分子標記的方法。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 申請人:從綿羊FSHR基因片段中克隆得到一種作為綿羊標記輔助選擇的與產(chǎn)羔數(shù)性狀 相關(guān)的分子標記，它位于綿羊FSHR基因5' -UTR，其序列如序列表SEQ ID N0 :1所示。該序 列的第88bp處有一個T88- C88的堿基替換，并導致BsiE I -RFLP酶切多態(tài)性。
[0008] 本發(fā)明還提供用于檢測上述分子標記的引物或探針。所述引物至少能特異性地擴 增SEQ ID N0 :1所示的序列或其特異性片段，該片段至少包括所述序列的第88位堿基。本 領(lǐng)域技術(shù)人員只要從樣品中特異性地擴增出該片段，通過現(xiàn)有的檢測手段即可判斷所述序 列的第88bp處是否發(fā)生了 T88- C88的堿基替換，從而能夠?qū)d羊進行分子輔助選擇。對于 所述的特異性引物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以遵照《分子克隆實驗指南》第三版的相關(guān)內(nèi)容進行 設(shè)計和篩選，或者是按照本領(lǐng)域的公知常識進行設(shè)計和篩選。
[0009] 優(yōu)選地，用于檢測所示序列SEQ ID NO : 1的第88bp處有一個T88-C88的堿基替換 的引物對的DNA序列如下所示： 正向引物：5' - CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3'， 反向引物：5 ' - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 '。
[0010] 本發(fā)明還提供含有上述引物或探針的檢測試劑盒。
[0011] 應用常規(guī)的PCR-RFLP的方法對序列表SEQ ID NO : 1的第88位堿基突變進行了檢 測，同時 申請人:將上述克隆的分子標記成功地應用于與綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)分子標記輔助 選擇的關(guān)聯(lián)分析上，表明本發(fā)明的分子標記及相關(guān)檢測手段能夠有效地對綿羊進行分子輔 助選擇，為綿羊育種提供了良好的技術(shù)手段，降低了成本，提高了效率，具有廣闊的應用前 旦 -5^ 〇

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1 :綿羊H1SR基因部分5' -UTR片段和PCR-RFLP檢測的DNA片段凝膠電泳圖。
[0013] 圖2 :是本發(fā)明中綿羊FSHR基因 BsiE I -RFLP的三種基因型（CC，TC，TT)電泳 結(jié)果。圖中M :DNA分子量標準（DL2000 ladder)，其中2、3、6、8、9、11、15泳道為TT型，1、4、 5、7、10、13、14泳道為TC型，12和16泳道為CC型。
[0014]

【具體實施方式】： 以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明 精神和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0015] 實施例1、FSHR基因部分5' -UTR序列的克隆 (1)引物設(shè)計 根據(jù)綿羊FSHR基因序列（GenBank收錄號：NC_019460. 1)，利用Primer5. 0軟件設(shè)計上 下游引物M_F和M-R，序列如下 FHSR ： M-F ：5 ; - CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3 ;, M-R :5 7 - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 7。
[0016] (2) PCR產(chǎn)物的克隆和測序 將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-18 T載體(購自Takara)在4°C水浴連接過夜；無菌狀態(tài) 下取10(Γ120 μ 1感受態(tài)細胞于1. 5 ml Ependorff管中，將5 μ 1的連接產(chǎn)物加入混勻，在 冰上放置30 min，42°C熱激90 s，后冰浴3?4 min，加入400 μ 1無抗生素的LB液體培養(yǎng)基， 37°C振蕩培養(yǎng)45 min。取100 μ 1涂布于異丙基硫代一 β -D -半乳糖苷（IPTG)X-gal的瓊 脂平板上，37°C平放1 h后倒置培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，接種于疒3ml LB中，37°C 300r/ min培養(yǎng)過夜。用1. 5ml EP管12, 000r/min離心數(shù)秒收集菌體進行制備少量的質(zhì)粒。驗證 后的重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由上海桑尼 生物技術(shù)有限公司完成，得到一條長度為244bp的UTR序列（見SEQ ID N0 :1所示)，該序列 的第88bp處有一個T88- C88的堿基替換。
[0017] DNA序列同源性檢索鑒定： 通過美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi. nlm.nih.gov)網(wǎng)站的 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基 因進行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。檢索結(jié)果表明所測序列與 綿羊FSHR基因 DNA(GenBank收錄號：NC_019460. 1)的部分序列同源性達96%。
[0018] 實施例2、PCR-RFLP診斷方法的建立 (1)、引物序列 FSHR: M-F ：5 ; - CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3 ;, M-R :5 7 - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 7。
[0019] (2)PCR擴增條件 PCR反應總體積20μ 1，其中綿羊基因組DNA約100ng，含IX的buffer (購自Promega 公司），1. 5 mmol/L MgCl2, dNTP 終濃度為 150 μ mol/L，引物終濃度為 0· 4 μ mol/L，2U Taq DNA 聚合酶（Promega)。PCR 擴增程序是：94°C 3 min，循環(huán) 35 次 94°C 30 s，58°C 30 s，然后 72°C 25s，最后72°C延伸5min。PCR反應產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖1所示。 擴增獲得244bp特異片段，該片段位于5'-UTR。測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該244bp片段中存在一 個BsiE I酶切位點（CGRY丨CG)，其中第90bp處為多態(tài)性切點，位于5'-UTR中。
[0020] (3 ) PCR-RFLP 檢測條件 PCR產(chǎn)物酶切反應體積是10μ 1，其中l(wèi)Xbuffer 1μ 1，PCR產(chǎn)物：Γ5 μ 1，限制性內(nèi)切 酶BsiE I 0. 3μ1 (10U)^H20補足10μ1，將樣品混勻后離心，37°C水浴4h，用2%瓊脂糖 凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，在紫外燈下拍照，并記錄基因型。對該位點兩個純合子的測序結(jié)果 顯示，當?shù)?8bp位置是T時，則該BsiE I酶切位點不存在，BsiE I酶切后檢測結(jié)果只有1 個片段，長度是244bp (定為等位基因 T);但存在T88 - C88的替換時，其結(jié)果導致第90bp 處一個BsiE I酶切位點的產(chǎn)生，得到2個片段，長度分別為90bp和154bp (定為等位基因 C)，三種基因型TT，TC，CC如圖2所示。
[0021] (4)本發(fā)明的分子標記在綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)分析中的應用 試驗共檢測了 18只杜泊羊，761只湖羊，869只小尾寒羊，106只杜湖匕代（?杜泊羊X 湖羊早），144只美湖南非肉用美利奴X湖羊早）的多態(tài)性，確定其基因型，并進行 基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析。
[0022] 建立如下所述的最小二乘模型： Υ?Λ1=μ + Breedi+Pk+SfCombinatiorv1· ε ijklm。
[0023] 其中,Yijkl是性狀觀察值，μ為總體均數(shù),Genotypei為基因型效應,Breedj為品種 效應，P k為胎次效應，Si為季節(jié)效應，C〇mbinati〇ni為組合的效應，ε ijkl為隨機誤差，假定 ￡$1相互獨立，服從N(0, 〇2)分布?；蛐蜋z測結(jié)果表明在1898個個體中CC基因型， 有55個，TC基因型有1177個個體，TT基因型有666個個體?；蛐团c性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié) 果是基因與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān)。
[0024] 由表1可知，基因 SNP位點對產(chǎn)羔數(shù)有極顯著影響（P〈0. 01)，其中CC基因型 個體的產(chǎn)羔數(shù)極顯著，顯著高于TC和TT基因型個體的對應值，TC基因型個體的對應值居 中，TT基因型個體的對應值最低。

【權(quán)利要求】
1. 一種克隆的與綿羊產(chǎn)蓋數(shù)性狀相關(guān)的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，所述序列的第88bp處有1個T88- C88的堿基替換。
2. 用于檢測權(quán)利要求1所述分子標記的PCR引物或探針。
3. 檢測權(quán)利要求1所述分子標記的堿基突變引物對，所述引物對的正向引物為5' -CGTATCTTTCCACGCCCTCT - 3'，反向引物為 5' - CCATCCACCCGATTGCTT - 3 '。
4. 含有權(quán)利要求2的引物或探針或權(quán)利要求3所述的堿基突變引物對的檢測試劑盒。
5. 權(quán)利要求1所述的分子標記、權(quán)利要求2所述的引物或探針、權(quán)利要求3所述的堿基 突變引物對或權(quán)利要求4所述檢測試劑盒在綿羊標記輔助選擇中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046626SQ201410246539
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】李發(fā)弟, 王維民, 翁秀秀, 劉世佳, 潘香羽, 馬友記, 唐德富, 李沖 申請人:蘭州大學