一種pcr試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法，通過(guò)具體分析陽(yáng)性模板核酸序列，在特定條件下將用做陽(yáng)性對(duì)照的模板縮短50-100bp左右的堿基，完成相關(guān)PCR反應(yīng)后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳即可觀察和區(qū)分出待檢樣品的陽(yáng)性條帶是真陽(yáng)性還是因操作失誤造成待檢樣品中污染陽(yáng)性對(duì)照而產(chǎn)生的假陽(yáng)性。本發(fā)明能不改變反應(yīng)過(guò)程的情況下直觀反映各種樣品檢測(cè)的真實(shí)信息，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。
【專利說(shuō)明】—種PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中的PCR類檢測(cè)試劑盒所用陽(yáng)性對(duì)照，一般是將目的片段突變某一個(gè)或數(shù)個(gè)位點(diǎn)后插入某一質(zhì)粒中，將該質(zhì)粒線性化后作為陽(yáng)性對(duì)照。由于陽(yáng)性對(duì)照目的片段進(jìn)行了突變，因此通過(guò)測(cè)序可確定檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品是真陽(yáng)性，還是因反應(yīng)體系污染陽(yáng)性對(duì)照模板而導(dǎo)致的假陽(yáng)性。但是測(cè)序工作一般需要交由測(cè)序公司進(jìn)行，從送交樣品算起大概需要一周左右的時(shí)間，大大浪費(fèi)了時(shí)間。此外，對(duì)于某些有保密要求的樣品來(lái)說(shuō)，送交公司測(cè)序增加了泄密的可能性。
[0003]并且，PCR試劑盒中通常以含有擴(kuò)增片段目的基因的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照的模板，PCR靈敏度高，操作過(guò)程中容易造成陽(yáng)性質(zhì)粒污染待檢測(cè)的樣品，從而造成待檢樣品假陽(yáng)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法，用以克服上述技術(shù)缺陷。 [0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法，比較分析具體的陽(yáng)性模板核酸序列，將用做陽(yáng)性對(duì)照的模板縮短50-100bp左右的堿基，縮短后的陽(yáng)性對(duì)照模板與原陽(yáng)性對(duì)照模板相比，必須符合以下條件:1)兩者具有相同或相近的GC百分比；2)未增加或減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)；3)基本未增加或減少二聚體、錯(cuò)配的S G值；4)擴(kuò)增片段超過(guò)450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短lOObp。低于450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短50bp ；5)盡量不在靠近上下游引物的地方刪減堿基。以該模板為陽(yáng)性對(duì)照，完成相關(guān)PCR反應(yīng)后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳即可觀察和區(qū)分出待檢樣品的陽(yáng)性條帶是真陽(yáng)性還是因操作失誤造成待檢樣品中污染陽(yáng)性對(duì)照而產(chǎn)生的假陽(yáng)性，同時(shí)不影響反應(yīng)過(guò)程。
[0006]進(jìn)一步，以新城疫檢測(cè)技術(shù)為例，該具體過(guò)程為:
[0007]步驟a，陽(yáng)性模板制備；根據(jù)新城疫檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16550-2008)提供引物擴(kuò)增的片段序列，人工合成或利用其他分子生物學(xué)方法在片段中間刪減lOObp，使片段長(zhǎng)度為435bp，連接T載體后作為陽(yáng)性模板；
[0008]步驟b，檢測(cè)；
[0009]按照新城疫檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16550-2008)提供條件對(duì)陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)。
[0010]進(jìn)一步,上述步驟a中，人工合成的序列為:
[0011]序列2:
[0012]ATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCCCTGATGCTGACTGTCCGACTTGTGCTGGCACTGAGTTGCGTCTGCCCGACCAGCTCCCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGGAGACAAGGC
AGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTCCCAAATATCAAGAGTCTGTGACCAC
ATCTGGAGGAGGGAAACAGGGACGTCTTATAGGCGCCATTATCGGTGGTGCGGCTCTCGGGGTTGCAACCGCTGCAC
AGATAACAGCAGCCTCGGCTCTAATACAAGCCAATCAAAATGCTGCCAACATTCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCT
GCAACCAATGAGGCTGTGCACGAGGTCACTGACGGATTATCACAACTAGCAGTGGCAG。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明通過(guò)分析具體核酸序列，在符合下述條件的情況下將用做對(duì)照的模板減少50-100bp左右的堿基:1)兩者具有相同或相近的GC百分比；2)未增加或減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)；3)基本未增加或減少二聚體、錯(cuò)配的δ G值；
4)擴(kuò)增片段超過(guò)450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短lOObp。低于450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短50bp；
5)盡量不在靠近上下游引物的地方刪減堿基。不影響擴(kuò)增效果的同時(shí)，通過(guò)PCR反應(yīng)結(jié)束后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果即可判斷待檢樣品是真陽(yáng)性還是假陽(yáng)性，能有效防止假陽(yáng)性的出現(xiàn)；并且本發(fā)明能直觀反映 各種樣品檢測(cè)的真實(shí)信息，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明I陽(yáng)性和陰性樣品沒(méi)有被陽(yáng)性對(duì)照污染；
[0015]圖2為本發(fā)明2陽(yáng)性和陰性樣品被陽(yáng)性對(duì)照污染；
[0016]圖3為本發(fā)明3陽(yáng)性樣品被陽(yáng)性對(duì)照污染；
[0017]圖4為本發(fā)明4陰性樣品被陽(yáng)性對(duì)照污染。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0019]本發(fā)明通過(guò)比較分析具體核酸序列，將用做陽(yáng)性對(duì)照的模板在符合下述條件的情況下縮短50-100bp左右的堿基:1)兩者具有相同或相近的GC百分比；2)未增加或減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)；3)基本未增加或減少二聚體、錯(cuò)配的SG值；4)擴(kuò)增片段超過(guò)450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短lOObp。低于450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短50bp ；5)盡量不在靠近上下游引物的地方刪減堿基。完成相關(guān)PCR反應(yīng)后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳即可觀察和區(qū)分出待檢樣品的陽(yáng)性條帶是真陽(yáng)性還是因操作失誤造成待檢樣品中污染陽(yáng)性對(duì)照而產(chǎn)生的假陽(yáng)性。
[0020]以新城疫檢測(cè)技術(shù)為例，該具體過(guò)程為:
[0021]步驟a，陽(yáng)性模板制備；
[0022]根據(jù)新城疫檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16550-2008)提供引物擴(kuò)增的片段序列(序列長(zhǎng)度535bp)(序列見(jiàn)“序列I”)，人工合成或利用其他分子生物學(xué)方法在片段中間刪減lOObp，使片段長(zhǎng)度為435bp(序列見(jiàn)“序列2”)，連接T載體后作為陽(yáng)性模板。
[0023]步驟b，檢測(cè)；
[0024]按照新城疫檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16550-2008)提供條件對(duì)陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照為按照本發(fā)明提供的方法制備。
[0025]檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)如下4種情況。
[0026]說(shuō)明:下面4個(gè)模式圖中，泳道I為核酸分子量標(biāo)志；泳道2為陽(yáng)性對(duì)照；泳道3為陽(yáng)性待檢樣品；泳道4為陰性待檢樣品。
[0027]圖1中，I陽(yáng)性和陰性樣品沒(méi)有被陽(yáng)性對(duì)照污染；[0028]圖2中，2陽(yáng)性和陰性樣品被陽(yáng)性對(duì)照污染；
[0029]圖3中，3陽(yáng)性樣品被陽(yáng)性對(duì)照污染；
[0030]圖4中，4陰性樣品被陽(yáng)性對(duì)照污染。
[0031]上述4種情況涵蓋檢測(cè)過(guò)程中所有可能出現(xiàn)的情況，由于陽(yáng)性對(duì)照條帶與陽(yáng)性樣品條帶大小不同，所以無(wú)論出現(xiàn)何種情況，本發(fā)明均能直觀反映樣品檢測(cè)的真實(shí)信息，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。
[0032]本發(fā)明不限于以上所述的實(shí)施例，而是可在隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行修改，只需滿足本發(fā)明的 技術(shù)構(gòu)思和主要精神。
【權(quán)利要求】
1.一種PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法，其特征在于，通過(guò)分析具體核酸序列，在符合下述條件下將用做陽(yáng)性對(duì)照的模板縮短50-100bp左右的堿基:1)兩者具有相同或相近的GC百分比；2)未增加或減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)；3)未增加或減少二聚體、錯(cuò)配的S G值；4)擴(kuò)增片段超過(guò)450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短10bp ;低于450bp，陽(yáng)性對(duì)照模板縮短50bp ；5)不在靠近上下游引物的地方刪減堿基； 完成相關(guān)PCR反應(yīng)后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳即可觀察和區(qū)分出待檢樣品的陽(yáng)性條帶是真陽(yáng)性還是因操作失誤造成待檢樣品中污染陽(yáng)性對(duì)照而產(chǎn)生的假陽(yáng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法，其特征在于，以新城疫病毒檢測(cè)方法為例，該具體過(guò)程為: 步驟a，陽(yáng)性模板制備；根據(jù)新城疫檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16550-2008)提供引物擴(kuò)增的片段序列，人工合成或利用其他分子生物學(xué)方法在片段中間刪減lOObp，使片段長(zhǎng)度為435bp，連接T載體后作為陽(yáng)性模板； 步驟b，檢測(cè)； 按照新城疫檢測(cè)技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16550-2008)提供條件對(duì)陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PCR試劑盒中防止陽(yáng)性對(duì)照污染待測(cè)樣品的方法，其特征在于，以新城疫檢測(cè)為 例，上述步驟a中，人工合成的序列為: 序列2:
ATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCCCTGATGCTGACTGTCCGACTTGTGCTGGCACTGAGTTGCGTCTGCCCGACCAGCTCCCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGGAGACAAGGCAGTCAACATATACACCTCATCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTCCCAAATATCAAGAGTCTGTGACCACATCTGGAGGAGGGAAACAGGGACGTCTTATAGGCGCCATTATCGGTGGTGCGGCTCTCGGGGTTGCAACCGCTGCACAGATAACAGCAGCCTCGGCTCTAATACAAGCCAATCAAAATGCTGCCAACATTCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAGGCTGTGCACGAGGTCACTGACGGATTATCACAACTAGCAGTGGCAGo
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104031998SQ201410246787
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】張永強(qiáng), 劉朔, 趙永剛, 吳曉東, 李金明, 王志亮 申請(qǐng)人:中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心