專利名稱：一種低保真dna聚合酶及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及體外基因誘變方法領(lǐng)域，與體外基因定向改良方法有關(guān)。
背景技術(shù)：
TaqDNA聚合酶是從水生棲熱菌(Thermus aquaticusYTl)中分離純化的一種DNA聚合酶， 該酶具有很好的熱穩(wěn)定性，在72 — 74。C具有最高活性，是PCR (Polymerase Chain Reaction)) 反應(yīng)的關(guān)鍵酶，被廣泛用于醫(yī)療診斷，法醫(yī)鑒定和生命科學(xué)研究等領(lǐng)域。然而，TaqDNA聚合酶不 具有3' —5'的校正活性，在PCR過程中，有大約萬分之一的堿基會發(fā)生堿基替換導(dǎo)致分子誘變， 因此，Ste匿r利用這一性質(zhì)建立了 DNA改組(英文名稱為DNA shuffling, Ste隨r, W. P. Ripid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling ， Nature, 1994 370:389-391)，己經(jīng)廣 泛用于體外定向分子進(jìn)化。但是，野生型Taq DNA聚合酶其誘變效率是很低的，盡管有人用Mn+ +取代Mg++可降低Taq DNA聚合酶的保真度，但是，由于\&!++是Taq DNA聚合酶的抑制劑，常 常會影響PCR的正常擴(kuò)增。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不能定向選擇AT堿基定向誘變的技術(shù)難題，利用互補(bǔ)兼 并引物誘變方法對Taq DM聚合酶進(jìn)行誘變，以獲得一個能選擇性地將堿基AT轉(zhuǎn)換為GC的 低保真DNA聚合酶，該酶可通過PCR程序應(yīng)用于DNA分子的體外誘變和髙AT含量基因的體外 改良。本發(fā)明篩選獲得一個低保真DNA聚合酶,并發(fā)現(xiàn)該酶具有選擇AT堿基轉(zhuǎn)換為GC的特性， 這一特性不僅可用于DNA分子的體外誘變而且對于富含AT基因的定向改良以及富集GC含量將 是非常有用的。
本發(fā)明通過以下方案實施
申請人獲得一種低保真TaqDNA聚合酶，它具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，其 661位為纈氨酸，666位為異亮氨酸(如圖l和序列表SEQ ID NO: 1所示)。
同時申請人獲得了一種能夠編碼上述低保真Taq DNA聚合酶的DNA序列，它具有如SEQ
ID NO: l所示的核苷酸序列。
進(jìn)而，申請人制備了一種重組的DNA載體，該載體含有SEQ ID NO; 1所述的核苷酸序 歹U。該重組DNA載體是pQE60-Taq，其保藏號為CCTCC NO: M206052。
用于制備上述重組載體的特異引物，它如下列序列構(gòu)成 正向引物5 ， -ATGVKVVKKKVKKVVYYKYVVYWVYYVWWVKKKKWVVWVWYVGGC;
反向弓！物5, -GCCKWYKYKKYVVVVKYY畫KYW訓(xùn)VWWKKVVKVVVKKVKCAT 。 一種低保真Taq DNA聚合酶的制備方法，包括下列步驟
1) 用重組DNA載體pQE60-Taq (保藏號為CCTCC NO: M206052)轉(zhuǎn)化大腸桿菌；
2) 利用高壓細(xì)胞破碎儀破碎大腸桿菌的細(xì)胞，收集細(xì)胞抽提液；
3) 利用綠色熒光蛋白的發(fā)光特性鑒別T叫DNA聚合酶保真度的高低，和
4) 通過DNA測序進(jìn)一步驗證低保真度TaqDNA聚合酶對DNA堿基突變的選擇性，得到所 述的低保真Taq DNA聚合酶。
詳細(xì)技術(shù)方案如下所示 1、 pQE60-Taq重組質(zhì)粒的構(gòu)建
以含有Taq dna聚合酶的質(zhì)粒pLSGl (參見Lawyer,等，Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquatiCUS The Journal of Biology Chemistry 1989 264:6427-6437)為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其引物如下
正向引物為5 ， —ATACCATGGGGGGGATGCTGCCCCTCTT
反向引物為5' -ACTAGATCTTGGGGCCTCGAGGACCAG 反應(yīng)體系(50ul): IX PCR緩沖液Tris-Hcl pH7.8, 1. 5mM Kcl, 1. 5mM Mgcl 10mM ATP, lOmM GTP, lOmM TTP， lOraM CTP, 10pM引物，2. 5單位DNA聚合酶(購自New England Biolabs公司)。
PCR條件94。C預(yù)熱3分鐘，94°C 40秒，50°C 72°C 3分鐘，25個循環(huán)。
酶解PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶解，酶解反應(yīng)(50ul)含有5ul IOX酶解緩沖液(購自 Qiagen公司)，20y 1 PCR產(chǎn)物，1-2u 1限制性內(nèi)切酶(購自Qiagen公司)，加水至終體積為 50u l.在37'C下保溫2-5小時。
酶解產(chǎn)物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒及操作程序進(jìn)行.具體過程是取150ulPB 緩沖液(購自Qiagen公司)與50 u 1酶解產(chǎn)物混合，上純化柱(購自Qiagen公司)，以14000 轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘,棄去流出液，再加750ul PE緩沖液(購自Qiagen公司)，用同上步驟 離心洗一次，最后，加50y l.無離子水，同上離心收集純化酶解DNA。
連接連接反應(yīng)(20ul)含有2ul IX連接緩沖(購自Qiagen公司)，2-4ul預(yù)先酶解好 的載體pQE60(購自Qiagen公司)，2-4 y 1酶解PCR產(chǎn)物'1 y 1 T4DNA連接酶(購自Qiagen 公司)，加水至終體積20u1.放4'C保溫過夜。
轉(zhuǎn)化將連接混合物與100W大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a (購自New England Biolabs公司) 混合，冰浴放置30分鐘，42°C處理90秒，加800ul LB培養(yǎng)基(見Molecular Cloning, A laboratory manual, 1982， p68) , 37。C保溫1小時.鋪含氨芐青霉素lOOPg/ml LB平皿，37
'C保溫12小時，獲得含有pQE60-Taq重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。
pQE60-Taq重組質(zhì)粒制備將含有pQE60-Taq重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子接到3ml含有氨節(jié)青霉 素(100ixl/ml) LB培養(yǎng)基(W胰蛋白胨，O. 5%Nacl, 1%酵母粉pH7. 5見Molecular Cloning, A laboratory manual, 1982， p68)，在37。C培養(yǎng)過夜，按Qiagen公司質(zhì)粒制備試劑盒和操 作程序抽提質(zhì)粒。方法如下以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心培養(yǎng)物，收集菌體；加250ml緩沖液A (購自Qiagen公司)懸浮菌體；加250ml緩沖液B (購自Qiagen公司)混勻；再加300ul緩 沖液C (購自Qiagen公司)，混勻。以14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。收集上清液上柱，加750 yl PE緩沖液(購自Qiagen公司)，同上離心，棄去流出液，最后，用80ul無離子水洗脫 質(zhì)粒DNA。
2. 、建立隨機(jī)突變文庫
以pQE60-T叫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其步驟如下 互補(bǔ)兼并引物設(shè)計根據(jù)與Taq DNA聚合酶序列設(shè)計互補(bǔ)兼并引物
正向引物為5' -ATGVKVVKKKVKKVVYYKYVVYWVYYVWWVKKKKWVVWVWYVGGC 反向引物為5 ， -GCCKWYKYKKYVVVVKYYKWWKYWKKWVWWKKVVKVVVKKVKCAT 在互補(bǔ)兼并引物設(shè)計中，野生型堿基為91%，其它三個兼并堿基為9%(每種堿基占3%.例如 野生型基因序列是AGTC,則兼并引物為Y=91%A+(3%T+3%G+3%C) ; K=91%G+(3%T+3%A+3%C); W=91%T+(3%G+3%A+3%C); V=91%C+(3%T+3%A+3%G)。
反應(yīng)體系(20ul) : lx PCR緩沖液(Expand Long PCR System ，購自Roche公司)，200MM dNTP， 10pM互補(bǔ)兼并引物，0.5單位DNA聚合酶(購自Roche公司)。
擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性2分鐘；然后，94'C, 30秒；50'C， 40秒；68°C， 7分鐘；16 個循環(huán)。
化M酶解根據(jù)限制性內(nèi)切酶"p/7l特異識別甲基化序列的特性，用限制性內(nèi)切酶Z p/7l處 理PCR產(chǎn)物混合物，由于PCR產(chǎn)物是體外合成的DNA分子，沒有被甲基化，不能被"/OTl所識 別，而模扳DNA是來自具有"pM甲基化酶活性的大腸桿菌細(xì)胞，能被Z o/71識別而酶解。
反應(yīng)體系20ul PCR產(chǎn)物混合物，加l W 37。C保溫l小時。
轉(zhuǎn)化酶解混合物直接與100W大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a混合，放置冰浴30分鐘，42°C 處理90秒，加800W LB培養(yǎng)基，37'C保溫1小時；鋪含氨芐青霉素lOOPg/ml LB平皿，37°C 保溫12小時,挑取菌落供篩選。其詳細(xì)制備步驟見圖2所示。
3、 DNA聚合酶制備
l)細(xì)胞抽提液制備從文庫中挑單菌落接種于10ml LB液體培養(yǎng)基(見Molecular Cloning, A laboratory manual, 1982, p68)中，37。C培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1%接種量接入500 ml LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)006。。=0.4時，加入異丙基流代-e-D-半乳糖苷使終濃度為0.5線繼 續(xù)搖7小時，離心5分鐘以6000轉(zhuǎn)/分鐘，棄去上清液。將沉淀物懸浮在20ml緩沖液A (5QmM
三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽pH7.9,50mM葡萄糖，lmM乙二胺四乙酸二鈉)，在室溫下放置15 一20分鐘，力口 20ml緩沖液B (50mMKcl， lmM乙二胺四乙酸二鈉，0. 5mM苯甲基磺酰，0.5% 吐溫20， 0. 5%Nonidet-P40 )，用高壓細(xì)胞破碎儀(購自Aim-Aminco公司)破碎細(xì)胞，條件是 在1100磅/每平方英寸壓力下破碎兩次，破碎液在75 °C保溫25分鐘，以14000轉(zhuǎn)/分鐘 離心15分鐘，棄去細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞抽提液。
DNA聚合酶純化在上清液中加10%聚1， 2-亞乙基亞胺到最終濃度為0.15%。在室溫 放置10分鐘。以8000rpm/min離心20分鐘，收集沉淀，用緩沖液I (0. 025M Kcl- 20mM N-2-羥乙基哌嗉-N， -2-乙磺酸pH7.9- lmM乙二胺四乙酸二鈉-0. 5mM苯甲基磺酰-0.5%吐溫 20-0. 5MNonidet-P40)洗一次，然后，用緩沖液II (0. 25M Kcl-20mM N-2-羥乙基哌嗪-N， -2-乙磺酸pH7.9- lmM乙二胺四乙酸二鈉-0.5mM苯甲基磺酰-0.5%吐溫20- 0.5% Nonidet-P40)洗脫，洗脫液對透析液(20mM HEPES pH7. 9- lmM乙二胺四乙酸二鈉-0. 5mM 苯甲基磺酰-100 mM Kcl- 二巰基蘇糖醇-50%甘油)在4。C下透析過夜。分裝保存在一20 'C備用。
4、低保真DNA聚合酶的篩選
pQE60-GFP突變文庫的構(gòu)建以含有綠色熒光蛋白基因的載體pEGFP (購自Clontech公 司)作為模板，用上述制備的不同突變體DNA聚合酶和野生型Taq DNA聚合酶(分別進(jìn)行？CR 擴(kuò)增正向引物為5' -GTACCATGGGTAAGGGAGAAGAACTT ; 反向引物為 5' -TCGAGATCTTATTTGTATAGTTCATCCA。擴(kuò)增條件為94。C， 2分鐘；94。C， 40秒;50。C， 30秒；72°C， 50秒；30個循環(huán)。將不同擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Afco I和^^1I雙酶解后連 接到預(yù)先用Afco/《 7II處理的大腸桿菌表達(dá)載體pQE60(購自Qiagen公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感 受態(tài)細(xì)胞DH5a (購自New England Biolabs公司)。
低保真DNA聚合酶的篩選利用轉(zhuǎn)化子的綠色熒光蛋白的發(fā)熒光特性的差異通過熒光顯 微鏡觀察突變率，根據(jù)不同保真DNA聚合酶和野生型Taq DNA聚合酶所產(chǎn)生綠色熒光蛋白表 型突變頻率的比較，可直接判斷不同DNA聚合酶突變體的保真度的高低，通過DNA測序進(jìn)一步 驗證該低保真度Taq DNA聚合酶對DNA堿基突變的選擇性，得到所述的低保真Taq DNA聚合 酶。本發(fā)明獲得的一株低保真DM聚合酶突變株，即大腸桿菌DH5a/Lfm DNA-pol,于2i)06 年6月9日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCCNO: M206052,其 構(gòu)建過程如圖2所示。 5、低保真DNA聚合酶的序列測定
含有低保真DNA聚合酶基因重組質(zhì)粒的制備將含有低保真DNA聚合酶基因重組質(zhì)粒的菌 落接種3ml含有氨芐青霉素100 li g /ml LB培養(yǎng)基，于37'C培養(yǎng)過夜，按Qiagen公司說明 書所示的常規(guī)方法制備質(zhì)粒。方法如下以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心培養(yǎng)物，收集菌體。加250ml 緩沖液A (購自Qiagen公司)，懸浮菌體；加250ml緩沖液B (購自Qiagen公司)，混勻；
再加300ul 3M醋酸鈉pH5.，混勻。離心5分鐘以14000轉(zhuǎn)/分鐘。收集上清液上柱(購自 Qiagen公司)，用750ul 70%乙醇洗一次，然后，用80ul無離子水洗脫質(zhì)粒DNA。
序列測定用上述含有低保真DNA聚合酶基因重組質(zhì)粒作為模扳，測序PCR反應(yīng)體系為(20 nl): 8ul序列反應(yīng)混合液(購自Qiagen公司)，2ul含有低保真DNA聚合酶基因重組質(zhì)粒 DNA(200yg)， 0.41U引物(10pM), 9.6" 去離子水。PCR條件為95°C預(yù)變性5分鐘； 然后，94°C變性15秒，50'C退火15秒，60'C延伸4分鐘，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用于序列測 定。序列測定發(fā)現(xiàn)，與野生型DNA聚合酶相比，本發(fā)明制備的低保真DNA聚合酶基因的1981 位的堿基由G變?yōu)镃, 1997位的A變?yōu)門，如序列表SEQ ID NO: 1所示。由此導(dǎo)致低保真DNA 聚合酶的氨基酸序列的661位的丙氨酸和666位的天門冬酰氨分別被脯氨酸和異亮氨酸所取 代，如SEQ ID NO: l所示的氨基酸序列。
6、本發(fā)明一個轉(zhuǎn)換AT堿基為GC的誘變方法的應(yīng)用 具體按照以下程序
低保真DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)
IOXPCR緩沖液 5ul
dNTP (10mM) ly 1
模板DNA 1 U 1
引物1 (lOuM) lu 1
引物2(10uM) lixl
低保真DNA聚合酶(2.5U/ii 1) lul ,
H20 加至50p1
IXPCR緩沖液:Tris-Hcl pH7. 8, 1. 5認(rèn)cl， 1. 5mM Mgcl
dNTP: 10mM ATP-lOmM GTP-lOmM TTP-lOmM CTP
PCR條件94。C預(yù)熱3分鐘，94。C分鐘，45°C-65°C , 72°C 1-5分鐘，25-30個循環(huán)。
酶解PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶解酶解，酶解反應(yīng)(50ul)含有5yl 10X酶解緩沖液(購 自New England Boilabs公司)，20u 1 PCR產(chǎn)物'1-2u 1限制性內(nèi)切酶，加水至終體積為50 u 1.在37'C下保溫2-5小時。
酶解產(chǎn)物純化按Qiagen公司PCR純化試劑盒及操作程序進(jìn)行.具體過程是取150ulPB 緩沖液與50 ii 1酶解產(chǎn)物混合，上純化柱(購自Qiagen公司)，以14000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘， 棄去流出液，再加750ul PE緩沖液(購自Qiagen公司)，同上離心洗一次，最后，加50ul.無 離子水，同上離心收集純化酶解DNA。
連接連接反應(yīng)(20u l)含有2nl IX連接緩沖(購自New England Boilabs公司)，2-4 n 1預(yù)先酶解好的載體PQE60 (購自Qiagen公司)，2-4 y 1酶解PCR產(chǎn)物，1" 1 T4DNA連接酶 (購自New England Boilabs公司)，加水至終體積20u1.放4。C保溫過夜。
轉(zhuǎn)化將連接混合物與100W大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci混合，冰浴放置30分鐘，42。C處 理90秒，加800ul LB培養(yǎng)基，37。C保溫1小時.鋪含氨芐青霉素lOO^g/ml LB平皿，37。C保溫 12小時,挑取菌落保存?zhèn)溆谩?br>

本發(fā)明的生物材料樣品即重組DNA載體的大腸桿菌DH5 a /Lfm DNA-pol，于2006年6月 9日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO: M206052; 序列表SEQ ID NO: 1是本發(fā)明改造的低保真Taq DNA聚合酶的核苷酸序列； 圖1是本發(fā)明改造的低保真Taq DNA聚合酶的氨基酸序列；
圖1中第10行倒數(shù)第7個氨基酸，即英文字母"P"(以黑體和下劃線表示)和第10行 倒數(shù)第2個氨基酸，即英文字母"I"(以黑體和下劃線表示)為突變位點(diǎn)。
圖2是本發(fā)明Taq DNA聚合酶突變文庫的構(gòu)建和低保真Taq DNA聚合酶的篩選流程。
具體實施例方式
實施例l
低保真DNA聚合酶對綠色熒光蛋白基因突變頻率的測定 以含有綠色熒光蛋白基因的重組載體pQE60-GFP作為模板，分別用野生型T叫DNA聚合酶 (對照)和本發(fā)明的低保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增正向引物為 5' -CGGATAACAATTTCACACAG;反向引物為5, -GTTCTGAGGTCATTACTGG。
反應(yīng)系統(tǒng)為
IOXPCR緩沖液 5 Pi
dNTP (10mM) lp 1
pQE60-GFP DNA 1 u 1
正向引物1 (lOuM) lu 1
反向引物2 (lOuM) In 1
低保真DNA聚合酶(2.5U/U1) lul
加H20至 50 ti 1
擴(kuò)增條件為94'C預(yù)變性2分鐘；94。C變性40秒；50'C退火30秒；72'C延伸50秒；30 個循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物用辰o I和SWII酶解后插入預(yù)先用Afco/^^II處理的大腸桿菌表達(dá)載體 pQE60(購自Qiagen公司)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ,分別獲得來自野生型Taq DNA聚 合酶和低保真DNA聚合酶兩個擴(kuò)增的隨機(jī)突變文庫。
轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒制備分別從兩個文庫中挑取30和26個轉(zhuǎn)化子接種含有氨芐青霉素100 u g/mlLB液體培養(yǎng)基3ml， 37。C搖12小時，以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘.收集菌體,加250ml緩 沖液(50tnM葡萄糖-25mM 3-羥甲基氨基甲烷-10 mM乙二胺四乙酸二鈉)，懸浮菌體；加
250ml緩沖液(0. 2M氫氧化鈉-1%十二烷基磺酸鈉)，混勻，再加3M醋酸鈉pH5. 5，混勻。 以14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。將上清液上柱(購自Qiagen公司)，用750 pl 70%乙醇洗一 次，然后，用80ul無離子水洗下質(zhì)粒DNA。
綠色熒光蛋白基因的序列分析以來自不同文庫的質(zhì)粒為模扳進(jìn)行測序，PCR引物為 5' -CGGATAACAATTTCACACAG。
測序反應(yīng)體系為8pl序列反應(yīng)混合液(購自Qiagen公司)，2ul質(zhì)粒DNA (200 u g) ， lul 引物(10pM ), 9^1去離子水.PCR條件為95'C預(yù)變性5分鐘；94°C變性15秒，50°C 退火15秒，6(TC延伸4分鐘，30個循環(huán).PCR產(chǎn)物用于序列測定。
結(jié)果表明本發(fā)明的低保真DNA聚合酶不僅具有高突變頻率的性質(zhì)而且具有轉(zhuǎn)換為GC的 特性。與野生型Taq DNA聚合酶相比，其突變頻率高18倍。野生型Taq DNA聚合酶對綠色熒 光蛋白基因的AT堿基的突變率為9.3X10—5,占總突變頻率的57%，而本發(fā)明的低保真DNA聚 合酶的AT堿基的突變率為2.91X10—3,占總突變頻率的97% (參見表1)。 表1本發(fā)明的低保真DNA聚合酶與野生型Taq DNA聚合酶對DNA分子誘變頻率的比較
DNA聚合酶 測定DNA堿基數(shù) 突變堿基類型及突變數(shù)突變頻率 AT突變率
43200 T~1
G ~1
野生型Taq DNA T ~>C 2 1.6X10—4 9.3X19'
聚合酶 C "M1 2
A ~>G 1
A "^G 18
本發(fā)明低保真 10400 T ~>C 12 3X10—3 2.91X10—
DNA 聚合酶 A ~K 1
G ~1
序列表
SEQUENCE LISTING
〈110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120〉 一種低保真DNA聚合酶及應(yīng)用
<130>
<141> 2006-06-27 <160〉 2
<170> Patentln version 3. 1 〈210〉 1 <211> 2499 〈212〉 DNA
<213> 水生棲熱菌(Thermus aquaticus) <220>
<221〉 gene <222> (1). (2499) <223> <220〉
〈221〉 CDS 〈222〉 (1)..(2499)
<223> <220〉
<221〉 primer_bind <222〉 (1972).. (2016)
<223> 〈220〉
<221> mutation <222〉 (1997)., (1997)
<223> <220>
<221> mutation <222〉(腿)，.(腿) 〈223〉 〈400〉 1
atg agg ggg atg ctg ccc Met Arg Gly Met Leu Pro 1 5 gtg gac ggc cac cac ctg Val Asp Gly His His Leu 20
etc acc acc age egg ggg Leu Thr Thr Ser Arg Gly 35
aag age etc etc aag gcc
10
etc ttt gag ccc aag ggc Leu Phe Glu Pro Lys Gly 10
gcc tac cgc acc ttc cac Ala Tyr Arg Thr Phe His 25
gag ccg gtg cag gcg gtc Glu Pro Val Gin Ala Val 40
etc aag gag gac ggg gac
egg gtc etc ctg 48 Arg Val Leu Leu 15
gcc ctg 33g ggc 96 Ala Leu Lys Gly 30
tac ggc ttc gcc 144 Tyr Gly Phe Ala 45
gcg gtg ate gtg 192 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val lie Val
50 55 60
gtc ttt gac gcc aag gcc ccc tec ttc cgc cac gag gcc tac ggg ggg 240 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80
tac aag gcg ggc egg gcc ccc acg ccg gag gac ttt ccc egg caa etc 288 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gin Leu
85 90 95
gcc etc ate aag gag ctg gtg gac etc ctg ggg ctg gcg cgc etc gag 336 Ala Leu lie Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
gtc ccg ggc tac gag gcg gsc gac gtc ctg gcc age ctg gcc aag ￡iag 384 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
gcg gaa aag gag ggc tac gag gtc cgc ate etc acc gcc gac aaa gac 432 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg lie Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
ctt tac cag etc ctt tec gac cgc ate cac gtc etc cac ccc gag ggg 480 Leu Tyr Gin Leu Leu Ser Asp Arg lie His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160
tac etc ate acc ccg gcc tgg ctt tgg gaa aag tac ggc ctg agg ccc 528 Tyr Leu lie Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
gac cag tgg gcc gac tac egg gcc ctg acc ggg gac gag tec gac aac 576 Asp Gin Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
ctt ccc ggg gtc aag ggc ate ggg gag aag acg gcg agg aag ctt ctg 624 Leu Pro Gly Val Lys Gly lie Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
gag gag tgg ggg age ctg gaa gcc etc etc犯g犯c ctg gac egg ctg 672 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
aag ccc gcc ate egg gag aag ate ctg gcc cac atg gac gat ctg aag 720 Lys Pro Ala lie Arg Glu Lys lie Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240
etc tec tgg gac ctg gcc aag gtg cgc acc gac ctg ccc ctg gag gtg 768 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
gac ttc gcc a肌agg egg gag ccc gac egg gag agg ctt agg gcc ttt 816 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
ctg gag agg ctt gag ttt ggc age etc etc cac gag ttc ggc ctt ctg 864 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285
gaa age ccc aag gcc ctg gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa ggg 912 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
gcc ttc gtg ggc ttt gtg ctt tec cgc aag gag ccc atg tgg gcc gat 960 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320
ctt ctg gcc ctg gcc gcc gcc agg ggg ggc egg gtc cac egg gcc ccc 1008 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
gag cct tat aaa gcc etc agg gac ctg aag gag gcg egg ggg ctt etc 1056 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
gcc aaa gac ctg age gtt ctg gcc ctg agg gaa ggc ctt ggc etc ccg 1104 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
ccc ggc gac gac ccc atg etc etc gcc tac etc ctg gac cct tec aac 1152 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
acc acc ccc gag ggg gtg gcc egg cgc tac ggc ggg gag tgg acg gag 1200 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400
gag gcg ggg gag egg gcc gcc ctt tec gag agg etc ttc gcc aac ctg 1248 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
tgg ggg agg ctt gag ggg gag gag agg etc ctt tgg ctt tac egg gag 1296 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
gtg gag agg ccc ctt tec get gtc ctg gcc cac atg gag gcc acg ggg 1344 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
gtg cgc ctg gac gtg gcc tat etc agg gcc ttg tec ctg gag gtg gcc 1392 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
gag gag ate gcc cgc etc gag gcc gag gtc ttc cgc ctg gcc ggc cac 1440 Glu Glu lie Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480
ccc ttc aac etc aac tec egg gac cag ctg gaa agg gtc etc ttt gac 1488 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
gag eta ggg ctt ccc gcc ate ggc aag acg gag aag acc ggc aag cgc 1536 Glu Leu Gly Leu Pro Ala lie Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
tec acc age gcc gcc gtc ctg gag gcc etc cgc gag gcc cac ccc ate 1584 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro lie 515 520 525
gtg gag aag ate ctg cag tac egg gag' etc acc aag ctg aag age acc 1632 Val Glu Lys lie Leu Gin Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
tac att gac ccc ttg ccg gac etc ate cac ccc agg acg ggc cgc etc 1680 Tyr lie Asp Pro Leu Pro Asp Leu lie His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560
cac acc cgc ttc aac cag acg gcc acg gcc acg ggc agg eta agt age 1728 His Thr Arg Phe Asn Gin Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
tec gat ccc aac etc cag aac ate ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg cag 1776 Ser Asp Pro Asn Leu Gin Asn lie Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gin
580 585 590
鄉(xiāng)ate cgc egg gcc ttc ate gcc gag gag ggg tgg eta ttg gtg gcc 1824 Arg lie Arg Arg Ala Phe lie Ala Glu Glu Gly Trp Leu Uu Val Ala
595 600 605
ctg gac tat age cag ata gag etc agg gtg ctg gcc cac etc tec ggc 1872 Leu Asp Tyr Ser Gin lie Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
gac gag aac ctg ate egg gtc ttc cag gag ggg egg gac ate cac acg 1920 Asp Glu Asn Leu lie Arg Val Phe Gin Glu Gly Arg Asp lie His Thr 625 630 635 640
gag acc gcc age tgg atg ttc ggc gtc ccc egg gag gcc gtg gac ccc 1968 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
ctg atg cgc egg ccg gcc aag acc ate ate ttc ggg gtc etc tac ggc 2016 Leu Met Arg Arg Pro Ala Lys Thr lie lie Phe Gly Val Uu Tyr Gly
660 665 670
atg tcg gcc cac cgc etc tec cag gag eta gcc ate cct tac gag gag 2064 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gin Glu Leu Ala lie Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
gcc cag gcc ttc att gag cgc tac ttt cag age ttc ccc aag gtg egg 2112 Ala Gin Ala Phe lie Glu Arg Tyr Phe Gin Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
gcc tgg att gag aag acc ctg gag gag ggc agg agg egg ggg tac gtg 2160 Ala Trp lie Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720
gag acc etc ttc ggc cgc cgc cgc tac gtg cca gac eta gag gcc egg 2208 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
gtg aag age gtg egg gag gcg gcc gag cgc atg gcc ttc aac atg ccc 2256 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
gtc cag ggc acc gcc gcc gac etc atg aag ctg get atg gtg aag etc 2304 Val Gin Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765
ttc ccc agg ctg gag gaa atg ggg gcc agg atg etc ctt cag gtc cac Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gin Val His
770 775 780
gac gag ctg gtc etc gag gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg gcc Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800
egg ctg gcc aag gag gtc atg gag ggg gtg tat ccc ctg gcc gtg ccc Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
ctg gag gtg gag gtg ggg ata ggg gag gac tgg etc tec gcc aag gag Leu Glu Val Glu Val Gly lie Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830
tga
<210> 2 〈211〉 832 <212> PRT
<213> 水生棲熱菌(Thermus aquaticus) <400〉 2
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly 1 5 10
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His
20 25 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gin Ala Val
35 40 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp 50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu 65 70 75
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe
85 90 Ala Leu lie Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu
100 105 Val Pro Gly Tyr Glu Ala A印Asp Val Leu Ala Ser
115 120 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg lie Leu Thr 130 135 140
Leu Tyr Gin Leu Leu Ser Asp Arg lie His Val Uu 145 150 155
Tyr Leu lie Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr
165 170 Asp Gin Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly lie Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
Arg
Ala
Tyr
45
Ala
Val
Leu
30
Gly
Val
Leu Leu 15
Lys Gly Phe Ala lie Val
Ala Tyr Gly Gly 80
Pro Arg Gin Leu 95
Ala Arg Leu Glu 110
Leu Ala Lys Lys 125
Ala Asp Lys Asp
His Pro Glu Gly 160
Gly Leu Arg Pro 175
Glu Ser Asp Asn
2352
2400
2448
2496
2499
210 215 220
Lys Pro Ala lie Arg Glu Lys lie Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu lie Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 4.90 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala lie Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro lie
515 520 525
Val Glu Lys lie Leu Gin Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr lie Asp Pro Leu Pro Asp Leu lie His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gin Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser
Arg
Leu
Asp 625 Glu
Leu
Met
Ala
Ala 705 Glu
Val
Val
Asp
lie
Asp 610 Glu
Thr
Met
Ser
Gin 690 Trp
Thr
Lys
Gin
Phe Pro 770 Asp Glu 785
Arg Leu
Pro
Arg 595 Tyr
Asn
Ala
Arg
Ala 675 Ala
lie
Leu
Ser
Gly 755 Arg
Leu Ala Leu Glu Val
Asn 580 Arg
Ser
Leu
Ser
Arg 660 His
Phe
Glu
Phe
Val 740 Thr
Leu
Val
Lys
Glu
820
Leu
Ala
Gin
lie
Trp 645 Pro
Arg
lie
Lys
Gly 725 Arg
Ala
Glu
Leu
Glu 805 Val
Gin
Phe
lie
Arg 630 Met
Ala
Leu
Glu
Thr 710 Arg
Glu
Ala
Glu
Glu 790 Val
Gly
Asn
lie
Glu 615 Val
Phe
Lys
Ser
Arg 695 Leu
Arg
Ala
Asp
lie
Ala 600 Leu
Phe
Gly
Thr
Gin 680 Tyr
Glu
Arg
Ala
Leu 760 Gly
Pro 585 Glu
Arg
Gin
Val
lie 665 Glu
Phe
Glu
Tyr
Glu 745 Met
Val Arg
Glu Gly
Val Leu
Glu Gly 635 Pro Arg 650
lie Phe
Leu Ala
Gin Ser
Gly Arg 715 Val Pro 730
Arg Met
Met 775
Ma Pro Met Glu lie Gly
Lys Leu
Ala Arg Met
Lys Glu Arg 795
Gly Val Tyr
810 Glu Asp Trp
825
Thr Pro Leu Gly Gin 590
Trp Leu Leu Val Ala 605
Ala. His Leu Ser Gly 620
Arg Asp lie His Thr 640
Glu Ala Val Asp Pro 655
Gly Val Leu Tyr Gly 670
lie Pro Tyr Glu Glu 685
Phe Pro Lys Val Arg 700
Arg Arg Gly Tyr Val 720
Asp Leu Glu Ala Arg 735
Ala Phe Asn Met Pro 750
Ala Met Val Lys Leu 765
Leu Leu Gin Val His 780
Ala Glu Ala Val Ala 800
Pro Leu Ala Val Pro 815
Leu Ser Ala Lys Glu 830
權(quán)利要求
1、一種低保真Taq DNA聚合酶，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低保真TaqDNA聚合酶，其特征在于，所述的氨基酸序列的661 位為纈氨酸，666位為異亮氨酸。
3、 編碼權(quán)利要求1或2的低保真TaqDNA聚合酶的DNA序列，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示。
4、 一種重組的DNA載體，其特征在于含有權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。
5、 權(quán)利要求4所述的重組DNA載體，該載體是pQE60-Taq,其保藏號為CCTCC NO: M206052。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的DNA序列,其特征在于，其引物如下列組成 正向引物5 ， -ATGVKVVKKKVKKVVYYKYVVYWVYYVWWVKKKKWVVWVWYVGGC;反向引物5' -GCCKWYKYKKYVVVVKYYKWWKYWKKWVWWKKVVKVVVKKVKCAT 。
7、 一種低保真T叫DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，1) 用權(quán)利要求4或5的重組DNA載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌；2) 利用高壓細(xì)胞破碎儀破碎大腸桿菌的細(xì)胞，收集細(xì)胞抽提液；3) 利用綠色熒光蛋白的發(fā)光特性鑒別T叫DNA聚合酶保真度的高低，和4) 通過DNA測序進(jìn)一步驗證低保真度TaqDNA聚合酶對DNA堿基突變的選擇性，得到所 述的低保真Taq DNA聚合酶。
8、 包含低保真TaqDNA聚合酶突變株的大腸桿菌DH5a/LfmDNA-po1，其保藏號為CCTCC NO: M206052;
9、 權(quán)利要求l、 2或3所述的低保真Taq DNA聚合酶在突變體篩選中的應(yīng)用，其中包含將 堿基AT轉(zhuǎn)換為堿基GC的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求l、 2或3所述的低保真Taq DNA聚合酶在堿基轉(zhuǎn)換中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。公開了一種低保真Taq DNA聚合酶突變體，其保真度比野生型低18倍，且具有能使AT轉(zhuǎn)換為GC的特性。本發(fā)明提供了獲得該低保真DNA聚合酶突變體的方法；含有該低保真DNA聚合酶突變體基因的重組質(zhì)粒以及利用該DNA聚合酶突變體建立的能使堿基AT轉(zhuǎn)換為GC的誘變方法。
文檔編號C12N15/52GK101096659SQ20061001948
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日
發(fā)明者劉子鐸, 喻子牛, 張煉輝, 洪玉枝 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)