專利名稱：一次復(fù)合pcr反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯病毒和類病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物病毒分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。利用PCR技 術(shù)， 一次反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)同時(shí)檢測(cè)5種馬鈴薯(類)病毒的方法(m-RT-PCR)。 本發(fā)明還涉及到m-RT-PCR反應(yīng)中引物設(shè)計(jì)方法，以及同時(shí)檢測(cè)5種馬鈴薯病毒的反應(yīng)體系參 數(shù)和程序參數(shù)。
背景技術(shù)：
病毒檢測(cè)是馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，是脫毒種薯的質(zhì)量保證。目前，植物病毒檢 測(cè)大多采用基于抗血清的酶聯(lián)免疫吸附(ELASA),該技術(shù)檢測(cè)時(shí)，每一個(gè)病毒必須制備相應(yīng) 的特異抗血清，每個(gè)病毒必須獨(dú)立檢測(cè)，因而檢測(cè)成本髙，檢測(cè)程序煩瑣。為了提高病毒檢 測(cè)效率，近年來，基于PCR技術(shù)的病毒檢測(cè)技術(shù)正在形成中(Singh and Singh, Potato virus Y detection: sensitivity of RT-PCR depends on the size of fragment amplified, 1997, Ca". /VaW 尸a,/w/. 19， 149-155; Singh,， Reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of viruses from plants and aphids， 1998， f^ro/jWisiTzocfe. 74: 125-138; Nie and Singh,, Detection of multiple potato viruses using an oligo(dT) as a common cDNA primer in multiplex RT-PCR. 2000， F/ra/她/Zzo(is， 86: 179-185; Sharman等，Development of a multiplex immunocapture PCR with colourimetric detection for viruses of banana. 2000, Mra/ A/"/20A, 75: 75-88; Kuroda等, Multiplex reverse transcription polymerase chain reaction for simultaneous detection of viruses in gentian, 2002，/ Ge". /VaW iWio/, 68: 169-172; Li and Mock,， An improved reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the detection of two cherry flexiviruses inPrunusspp， 2005, Mro/MeAo血129: 162-169;吳志明等，應(yīng)用RT-PCR法快速檢測(cè)馬鈴薯 巻葉病毒，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，23: 77-79:路平等，馬鈴薯巻葉病毒的RT-PCR快速檢測(cè)， 2005，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000， 40: 532-534)。但目前大部分報(bào)道的基于PCR檢測(cè)技術(shù)， 一次反應(yīng)檢測(cè)的病毒種類在1~3種，僅柑桔有一例報(bào)道可以在一次反應(yīng)中檢測(cè)6種RNA病毒 禾口 1禾中DNA病毒(Roy等，A multiplex polymerase chain reaction method for reliable, sensitive and simultaneous detection of multiple viruses in citrus trees. ， 2005， P7/"o/Afef/iocfa. 129: 47-55)。
馬鈴薯中目前最好的結(jié)果是Shalaby and Mazyad (2002)和袁青等(2004)報(bào)道的在一 次PCR反應(yīng)中檢測(cè)3種病毒(Virus detection: PVY, PVX and PLRV multiplex-RT-PCR. recAw'ca/ WeWNo. 12;三重RT-PCR同步檢測(cè)馬鈴薯多種病毒影響因素，微生物學(xué)通報(bào)，31: 1-4)。但 他們的報(bào)道均為PCR擴(kuò)增條件的研究，還沒有形成穩(wěn)定的實(shí)用技術(shù)。在袁青等(2004)的報(bào) 道中，其病毒樣品是根據(jù)田間表型確定而不是采用的標(biāo)準(zhǔn)毒源，而馬鈴薯病毒往往是幾種病 毒同時(shí)侵染，根據(jù)表型很難準(zhǔn)確確定病毒種類，因此，該報(bào)道的結(jié)果很難確定所檢測(cè)的即為 目的病毒。同時(shí)，在復(fù)合PCR病毒檢測(cè)中，同時(shí)檢測(cè)多種病毒，需要所設(shè)計(jì)的引物的擴(kuò)增條
件一致，而擴(kuò)增片段又有顯著差異才能在一個(gè)凝膠電泳中呈現(xiàn)出差異帶型，因此，在PCR擴(kuò) 增中，不同引物要實(shí)現(xiàn)相同的退火溫度和擴(kuò)增條件往往是十分困難的。正因?yàn)槿绱?，在一?檢測(cè)中每增加一種病毒，在引物設(shè)計(jì)和建立擴(kuò)增條件上就增加了一個(gè)級(jí)別的難度，這也是目 前所報(bào)道的復(fù)合PCR檢測(cè)馬鈴薯病毒最多還只能檢測(cè)3種病毒的原因。在中國，馬鈴薯主要 病毒檢測(cè)病毒為馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯巻葉病毒(PLRV)、 馬鈴薯S病毒(PVS)和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTV)。目前，種薯質(zhì)量檢測(cè)采用ELISA 技術(shù)對(duì)這些病毒進(jìn)行檢測(cè)，其主要步驟是，首先必須根據(jù)病毒制備不同的抗血清，抗血清的 制備與PCR引物的合成相比，其過程復(fù)雜，成本高；其次，ELISA檢測(cè)由于靈敏度的關(guān)系， 不能對(duì)潛伏期的低濃度病毒進(jìn)行檢測(cè)，只能在生長(zhǎng)季節(jié)取植物葉片進(jìn)行，而不能對(duì)種薯(塊 莖)進(jìn)行直接檢測(cè)，因此檢測(cè)中心需要在生長(zhǎng)季節(jié)到實(shí)地取材，再帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，遠(yuǎn)距離 大批量取樣(葉片)十分不便。利用特異引物和適當(dāng)條件，PCR技術(shù)可以對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行特 異擴(kuò)增，因此可以對(duì)塊莖潛伏病毒進(jìn)行檢測(cè)，其樣品取樣、攜帶和貯藏均十分方便，從而使 大批量種薯質(zhì)量檢測(cè)成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，針對(duì)我國馬鈴薯多種主要侵染病毒的一次性檢測(cè) 問題，本發(fā)明包括設(shè)計(jì)具有相同退火溫度、且擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小差異明顯的不同病毒引物，建 立一種新的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增體系，從而實(shí)現(xiàn)一次PCR反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)4種馬鈴薯病毒(例 如馬鈴薯X病毒PVX;馬鈴薯Y病毒PVY;馬鈴薯巻葉病毒PLRV;馬鈴薯S病毒PVS) 和1種類病毒即馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTV)的檢測(cè)效果。。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
第一步PCR引物設(shè)計(jì)
從NCBI庫中搜索目前已登記的馬鈴薯PVX, PVY， PLRV， PVS所有序列，根據(jù)CLUSTAL 序列分析(version 1.82)結(jié)果，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件(見version 5.0， premier Biosoft International) 分別設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)引物通過不斷調(diào)整，直到在一次反應(yīng)中可以擴(kuò)增出不同病毒差異明顯的
特異帶。
表1_本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的PCR引物_
引 物 序 列5'-3' 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(bp)
PVY(正向) TGTGATGAATGGGCTTATG
181
(反向) TCTGCAAC ATCTGAGAAA
PVS (正向) GCTGTTYaARbATGGAAATCC
275
(反向) CRTACARCCTRCACACYTT PSTV(正向) AAACTCGTGGTTCCTGTGG 341
(反向) CGGTTCCAAGGGCTAAAC
PLRV(正向) GGA AATGTC AATGGTGGT
(反向) GGGGTCCAACTCATAAGC
P VX(正向) YACTGC AGGCGC AACTCC
(反向) GTCGTTGGATTGYGCCCT
391
565
第二歩樣品總RNA小量抽提
葉片樣品總RNA抽提采用改良酚/SDS小量提取法將300—500mg葉片凍干粉(液氮研 磨)置入5ml離心管中，隨即加入lml葉片抽提變性液(0.1M NaCl; 2% SDS 50 mM Tris-HCl， pH9;10mM EDTA)，混勻后冰上保留10min，再加入200pl苯酚和200^1氯仿，混勻后離心 5min.，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中，加入50nl乙酸鈉(pH4.6)和lml乙醇，混勻置于一 7tTC保留20min.后離心15min，沉淀RNA，最后RNA溶解在25^1去核酸酶的無菌水中。所 有離心均在12000rpm， 4'C下進(jìn)行。
馬鈴薯塊莖樣品總RNA提取采用本申請(qǐng)人馬鈴薯實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的方法目卩，將300 — 500mg 馬鈴薯塊莖凍干粉(液氮研磨遣入5ml離心管中，隨即加入lml塊莖抽提變性液(4M Guanidine Hydrochloride, 4M Urea and 1.5%. Thiourea)混勻，再加入7pl巰基乙醇，lml乙醇，200pl氯 仿，5(Hxl異戊醇和乙酸鈉，充分混勻后冰上保留15min， 4。C下10000rpm離心25min.， 上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積異戊醇，-2(TC保留lh.。 4t下8600rpm離心25min.， 棄出上清液后用500|11去核酸酶的無菌水溶解，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1) 充分混勻，然后4。C下13000rpm離心20min.，上清液再轉(zhuǎn)入另一離心管中加入等體積氯仿/異 戊醇(24:1)混勻，然后4。C下13000rpm再離心20min.，取上清液在另一離心管中，同時(shí)加 入100nl乙酸鈉和lml異戊醇，混勻后-20'C保留15min.，再用前一次同樣的條件離心，棄上 清液后用乙醇洗一次，RNA最后溶解在25pl的去核酸酶的無菌水中。
所述的葉片樣品總RNA抽提變性液為0.1M NaCl; 2% SDS 50 mM Tris-HCl, pH 9; 1 OmM EDTA。所述的馬鈴薯塊莖樣品總RNA抽提變性液為4M Guanidine Hydrochloride, 4M Urea and 1.5%. Thiourea。 第三步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
cDNA合成按照如下體系完成在一個(gè)反應(yīng)管中加入l]iil50pmol的隨機(jī)引物，lng第二步 抽提的RNA, 8pldNTP混合物(每種核甘酸2.5mM)， 0.5plRNase抑制劑(20U)和lpl反 轉(zhuǎn)錄酶(AMV),混勻室溫保留10min,后再在42'C下保留lh.，最后在冰上保留2min.即可用 于下一步操作。第四步復(fù)合PCR擴(kuò)增
復(fù)合PCR反應(yīng)體系為2pl的PCR buffer, 1.5)^1的25mM MgCl2， 2plde的2mM dNTP， 0.2pl的DNA聚合酶，1 ^第三步合成的cDNA和第一步中的病毒引物，其中PVX, PVS, PLRV 各0.3pl， PVY,PSTV各0.5^1，反應(yīng)體系總體積20^d 。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 1.5min.; 94 °C 45s; 53°C 45s; 72°C lmin.; 72°C 5min， 4'C終止反應(yīng)。
第五步檢測(cè)結(jié)果判定
制備2c/。的瓊脂糖EB膠，EB膠加入濃度為0.5ng/ml,取第四步擴(kuò)增產(chǎn)物lOpl點(diǎn)樣，電泳 電壓設(shè)置5V/cm，電泳時(shí)間為1.5h.。電泳結(jié)束后，在凝膠儀下直接觀察照相。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn) 在于
本發(fā)明所檢測(cè)的5種馬鈴薯(類)病毒是我國各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)廣泛侵染的病毒，也是我國 脫毒馬鈴薯種薯必須檢測(cè)的病毒，因此，本發(fā)明具有廣泛的實(shí)用性；其次，本發(fā)明的方法一 次檢測(cè)所需的時(shí)間短，從樣品RNA提取到結(jié)果檢出，只需4小時(shí)，而目前所用的ELISA檢 測(cè)通常需要2天；第三，ELISA檢測(cè)需要不同病毒的抗血清，每個(gè)病毒單個(gè)檢測(cè)，而本發(fā)明 只需目前分子生物學(xué)常用試劑，在一次反應(yīng)中檢測(cè)5種病毒。本發(fā)明還具有檢測(cè)效率高，靈 敏性強(qiáng)，成本低的特點(diǎn)；第四，本發(fā)明可以直接對(duì)種薯(塊莖)進(jìn)行檢測(cè)，取樣方便，樣品 容量大，可以實(shí)現(xiàn)真正意義的種薯檢測(cè)，而不是種薯植株檢測(cè)；第五，本方法采用樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，只要樣品攜帶病毒即可檢出，勿需進(jìn)行病毒RNA純化富集。


圖1.本發(fā)明操作流程圖。
圖2.是本發(fā)明的其中實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果，含有標(biāo)準(zhǔn)馬鈴薯病毒病毒源的葉片樣品，經(jīng)一次復(fù) 合PCR同時(shí)檢測(cè)4種病毒(PVX, PLRV， PVS, PVY)和1種類病毒(PSTV)的電泳結(jié)果圖。
圖3.是本發(fā)明的其中實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果，不同海拔實(shí)地取樣，抽提葉片總RNA，每一葉片 采用一次復(fù)合PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果圖。
圖中實(shí)地取樣地點(diǎn)在中國湖北省恩施地區(qū)，圖3中自上至下，M-為分子量標(biāo)準(zhǔn)；其它分 別為取自不同海拔的不同品種樣品，括號(hào)中標(biāo)注的是該品種的取樣地海拔高度。
圖4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)地收獲的馬鈴薯塊莖，采用一次復(fù)合PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:馬鈴薯病毒和類病毒基本檢測(cè)方法的建立
第一步引物合成
將本發(fā)明所設(shè)計(jì)的5種病毒引物序列(見表l),提交給"中國上海生工生物工程技術(shù)服 務(wù)公司"合成引物， 一般合成量為每引物10OD (可稀釋體積2500p1,用于5000—8000次反應(yīng))。
第二步葉片樣品總RNA小量抽提
將含有馬鈴薯PVY、 PVX、 PVS、 PLRV、 PSTV毒源的試管苗，在MS基本培養(yǎng)基附加 3%蔗糖的培養(yǎng)基中繁殖，待試管苗生長(zhǎng)4周后，每一毒源分別取500mg左右葉片，獨(dú)立提取 總RNA。 RNA抽提方法是500mg葉片樣品立即投入液氮中研磨成粉狀，然后將其置入5ml 離心管中，隨即加入lml葉片變性液(如上所述)，混勻后冰上保留lOmin.,再加入200pl苯 酚和200^1氯仿，混勻后離心5min.，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中，加入50|il乙酸鈉(pH4.6) 和lml乙醇，混勻置于一7(TC保留201^11.后離心15min,沉淀RNA,最后RNA溶解在25^1去 核酸酶的無菌水中。所有離心均在12000rpm， 4。C下進(jìn)行。 第三步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
cDNA合成按照如下體系完成在一個(gè)反應(yīng)管中加入lpl50pmol的隨機(jī)引物，lng第二步 抽提的RNA， 8(aldNTP混合物(每種核甘酸2.5mM)， 0.5^1 RNase抑制劑(20U)和lpl反 轉(zhuǎn)錄酶(AMV)，混勻室溫保留10mia后再在42t:下保留lh.，最后在冰上保留2min.即可用
于下一步操作。
第四步復(fù)合PCR擴(kuò)增檢測(cè)
復(fù)合PCR反應(yīng)體系為2^1的PCRbuffer, 1.5pl的25mMMgCl2， 2plde的2mM dNTP， 0.2^的DNA聚合酶，第三步合成的cDNA和第一步中的病毒引物，其中PVX, PVS， PLRV 各0.3ial， PVY，PSTV各0.5ial，反應(yīng)體系總體積2(Hil 。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 1.5min.; 94 。C 45s; 53°C 45s; 72°C lmin.; 72°C 5min.， 4t終止反應(yīng)。
第五步檢測(cè)結(jié)果判定
制備2%的瓊脂糖EB膠，EB濃度為0.5^ig/tnl加入，取第四步擴(kuò)增產(chǎn)物10^1點(diǎn)樣，5V/cm 設(shè)置電泳電壓，電泳時(shí)間為1.5h.。電泳結(jié)束后，在凝膠儀下直接觀察照相。
本實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果見附圖2。
實(shí)施例2:不同海拔種植的馬鈴薯葉片中馬鈴薯病毒和類病毒的檢測(cè)
第一步引物合成
操作步驟同實(shí)施例1第1步。
第二步異地葉片取樣
取樣地點(diǎn)為湖北恩施，共4個(gè)不同海拔高度(IOOM、 500M、 IIOOM、 1640M)。在馬鈴
薯種植地選擇有病毒表現(xiàn)癥狀的植株，用剪刀剪取植株頂端向下的展開葉片，取樣量為5片 葉左右，每取完一個(gè)植株樣品，剪刀用75%酒精消毒，再進(jìn)行下一個(gè)取樣。每一樣品單獨(dú)裝 入一聚乙烯食品袋中，再投入取樣盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室。取樣盒冰袋在取樣前一天置于冰箱預(yù)冷。
第三步各地葉片樣品總RNA小量抽提
操作步驟同實(shí)施例l第2步。 第三步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
同實(shí)例1第3步。 第四步復(fù)合PCR擴(kuò)增檢測(cè)
同實(shí)例1第4步。
第五步結(jié)果檢測(cè)
同實(shí)例1第5步。 本實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果見附圖3。
實(shí)施例3:馬鈴薯塊莖中馬鈴薯病毒和類病毒的檢測(cè)
第一步引物合成 同實(shí)施例1第1步。 第二步塊莖取樣
馬鈴薯塊莖病毒檢測(cè)取樣地點(diǎn)在中國湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了 10個(gè)品種，其中5個(gè)為溫室缽載種植塊莖，5個(gè)為實(shí)驗(yàn)地種植塊莖。溫室種植的5個(gè)品種取 樣，采取每缽取l個(gè)塊莖，實(shí)驗(yàn)地種植的5個(gè)品種取樣方法是，每品種隨機(jī)選取5株，每株 取1個(gè)塊莖。塊莖帶回實(shí)驗(yàn)室后，先用自來水洗去泥土，然后用雙蒸水再清洗2次，室溫晾 干水分。用小刀將每個(gè)品種5個(gè)塊莖切成小塊混合后，取500mg用于抽提總RNA。 第二步馬鈴薯塊莖樣品總RNA小量抽提
取500mg上述馬鈴薯塊莖樣品在液氮中研磨成粉狀，然后將其置入5ml離心管中，隨即 加入lml變性液混勻，再加入7ial巰基乙醇，lml乙醇，20(^l氯仿，50^1異戊醇和150^1乙 酸鈉，充分混勻后冰上保留15min., 4"下10000rpm離心25min.，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中， 加入等體積異戊醇，-20°<:保留111.。 4'C下8600rpm離心25min.，棄出上清液后用500pl去核 酸酶的無菌水溶解，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)充分混勻，然后4"C下 13000rpm離心20min.，上清液再轉(zhuǎn)入另一離心管中加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混勻，然 后4。C下13000rpm再離心20min.,取上清液在另一離心管中，同時(shí)加入,1乙酸鈉和lml
異戊醇，混勻后-2(TC保留15min.，再用前一次同樣的條件離心，棄上清液后用乙醇洗一次， RNA最后溶解再25pl的去核酸酶的無菌水。 第三步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
同實(shí)施例1第3步。 第四步復(fù)合PCR擴(kuò)增檢測(cè)
同實(shí)施例1第4步。
第五步結(jié)果檢測(cè)
同實(shí)施例1第5步。 本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果見附圖4。
權(quán)利要求
1、一次復(fù)合PCR反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯病毒和類病毒的方法，其步驟包括1)依次合成馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯X病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的特異引物；2)抽提待測(cè)馬鈴薯樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；3)將所述的引物置于一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以步驟2)所述的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4)用瓊脂糖EB凝膠電泳，根據(jù)檢測(cè)帶型判定樣品是否攜帶所述的馬鈴薯病毒或類病毒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中馬鈴薯Y病毒擴(kuò)增引物對(duì)如下 正向TGTGATGAATGGGCTTATG;反向TCTGCAACATCTGAGAAA; 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為181bp。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中馬鈴薯S病毒擴(kuò)增的引物對(duì)如下-正向GCTGTTYaARbATGGAAATCC;反向CRTAC ARCCTRC AC AC YTT;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為275bp。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中擴(kuò)增馬鈴薯巻葉病毒的引物對(duì)如下正向GGAAATGTCAATGGTGGT; 反向GGGGTCCAACTCATAAGC; 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為391bp。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中擴(kuò)增馬鈴薯X病毒的引物對(duì)如下 正向YACTGCAGGCGC AACTC ;反向GTCGTTGGATTGYGCCCT;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為565bp。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中馬鈴薯紡錘塊莖類病毒擴(kuò)增的引物對(duì)如下 正向AAACTCGTGGTTCCTGTGG; 反向CGGTTCCAAGGGCTAAAC; 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為341bp。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的塊莖總RNA抽提變性液為4M Guanidine Hydrochloride, 4M Urea and 1.5%. Thiourea。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的PCR反應(yīng)體系為lpl的PCRbuffer, 1.5^1 的25mMMgCl2， 2plde的2mM dNTP， 0.2^il的DNA聚合酶，1^1步驟2)所述的cDNA和 權(quán)利要求2-6所述的引物，其中PVX,PVS,PLRV各0.3^， PVY， PSTV各0.5^1，反應(yīng)體系總 體積20nl ;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4。C 1.5min,; 94°C 45s; 53°C 45s; 72°C lmin; 72°C 5min, 4'C終 止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物病毒分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及馬鈴薯病毒和類病毒分子檢測(cè)。本發(fā)明的特征是，通過一次復(fù)合PCR，同時(shí)檢測(cè)四種馬鈴薯病毒和一種馬鈴薯類病毒。本發(fā)明還公開了馬鈴薯病毒和類病毒的特異引物設(shè)計(jì)及其檢測(cè)方法?？捎糜隈R鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯S病毒(PVS)和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTV)的特異檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)，檢測(cè)效率高和成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101096702SQ20061001948
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2006年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日
發(fā)明者M.佩蒙, 宋波濤, 俊 柳, 聶碧華, 謝從華 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)