體外制備輪狀病毒雙層類病毒顆粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及輪狀病毒雙層類病毒顆粒的制備方法，包括從裂解上清中純化輪狀病毒VP6蛋白，由VP2蛋白和VP6蛋白構(gòu)成的雙層類病毒顆粒的體外組裝，所述蛋白和類病毒顆?？捎糜陬A(yù)防或減輕輪狀病毒感染導(dǎo)致的臨床癥狀。
【專利說明】體外制備輪狀病毒雙層類病毒顆粒的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)、分子生物學(xué)和分子病毒學(xué)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP6蛋白，其制備方法，以及包含其的類病毒顆粒體外組裝的方法，所述蛋白及其類病毒顆?？捎糜陬A(yù)防或減輕輪狀病毒感染所導(dǎo)致的腹瀉。
【背景技術(shù)】
[0002]輪狀病毒(rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，1973年Bishop在胃腸炎病人十二指腸發(fā)現(xiàn)(Bishop, Davidson et al.1973)。研究表明，95%以上的兒童在5歲前至少感染過一次輪狀病毒，據(jù)WHO統(tǒng)計，每年因輪狀病毒感染而導(dǎo)致的死亡高達60萬，而腹瀉病例則高達2億，僅在美國，每年因輪狀病毒感染而造成的經(jīng)濟損失就高達1億美兀(Hsu, Staat et al.2005; Tate, Burton et al.2011),造成嚴重的經(jīng)濟負擔和社會負擔。
[0003]輪狀病毒為無包膜RNA病毒，基因組由11條雙鏈RNA組成，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4，VP6 和 VP7)和 6 種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP6) (Estes and Cohen 1989)。輪狀病毒為二十面體對稱，其衣殼由三個同心層構(gòu)成，即由VP1、VP2和VP3構(gòu)成的核心層，由VP6構(gòu)成的內(nèi)衣殼，以及由VP4和VP7構(gòu)成的外衣殼。其中VP6為組特異性抗原，根據(jù)其抗原性不同可將輪狀病毒分為A-G 7個組，其中A組輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，該蛋白具有較強的免疫原性，盡管不是中和抗原，卻能夠產(chǎn)生較好的免疫保護效果(Sahara, Frenchick et al.1994)。VP4和VP7為主要中和抗原，根據(jù)二者抗原性的不同可將A組輪狀病毒分為不同的P血清型和G血清型，根據(jù)二者基因的不同可分為不同的基因型。G型和P型相互獨立又相互影響，常見的組合`包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G4P[8]，近年來，G9P[8]和G9P[6]的流行顯著增加(Li, Liu et al.2009)。
[0004]目前尚無針對輪狀病毒的特效藥，安全有效的疫苗是控制輪狀病毒感染的重要手段。經(jīng)過多年的研究，歷經(jīng)單價減毒疫苗，多價基因重配疫苗和基因工程疫苗三個階段，目前已有四種輪狀病毒疫苗相繼上市，包括惠氏的四價人-猿基因重配疫苗，蘭州所的單價減毒疫苗、默克的五價人-?；蛑嘏湟呙绾透鹛m素史克的單價減毒疫苗。但這些疫苗均為減毒活疫苗，存在較大的安全隱患，其中惠氏的疫苗由于腸套疊問題上市半年后即被撤回(Murphy，Gargiullo et al.2001);默克和葛蘭素史克的疫苗盡管經(jīng)過大量的臨床實驗證實其安全性和有效性(Bernstein, Sack et al.1999; Vesikari, Matsonet al.2006;Linhares,Velazquez et al.2008;Vesikari,Itzler etal.2009;Snellingj Andrews et al.2011)，但在亞洲和非洲等輪狀病毒死亡率較高的國家和地區(qū)的保護效率遠低于歐美等發(fā)達國家(Armah，Sow et al.2010; Zaman，Anh etal.2010;Madhi，Cunliffe et al.2011)，且越來越多的證據(jù)表明，二者接種后均產(chǎn)生排毒并可導(dǎo)致病毒的水平傳播(Anderson 2008;Rivera, Pena et al.2011; Yen, Jakob etal.2011)，也有研究表明，免疫缺陷兒童接種疫苗后可產(chǎn)生嚴重胃腸炎(Steele，Cunliffeet al.2009; Patel, Hertel et al.2010);蘭州所的疫苗上市十多年，至今尚未發(fā)現(xiàn)嚴重問題，但僅能預(yù)防嚴重腹瀉，不能預(yù)防輪狀病毒的感染(Fu，Wang et al.2007)。因此，盡管輪狀病毒減毒疫苗的研究取得了可喜的結(jié)果，但也還存在一定的問題，其安全性和有效性還有待進一步提高，發(fā)展更加安全、有效的疫苗勢在必行。非復(fù)制型疫苗是目前輪狀病毒疫苗研究的主要方向，其中基因工程疫苗由于成本低，安全、有效等特點而備受關(guān)注。
[0005]基因工程疫苗主要指通過基因工程方法表達輪狀病毒的抗原，免疫動物或人，從而達到免疫保護的作用。這類疫苗包括核酸疫苗、合成肽疫苗、重組表達抗原疫苗和類病毒顆粒(virus-like particles, VLPs)疫苗。目前類病毒顆粒疫苗的有效性和安全性已在HBV、HEV和HPV疫苗上得到了充分的證實，已經(jīng)成為世界公認的新一代最具研究價值的候選疫苗。RV-VLPs疫苗的研究始于上世紀八十年代，且大量的動物實驗結(jié)果表明，RV-VLP疫苗具有較好的保護性，并可介導(dǎo)廣泛的異型保護。
[0006]RV-VLP指由結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然病毒顆粒相似，且保留了病毒顆粒的天然構(gòu)象卻不含病毒核酸的類病毒顆粒。該顆粒分為兩類，即:一類是由VP2、VP4、VP6.VP7構(gòu)成的三層顆粒，或由VP6和VP4、VP7構(gòu)成的雙層顆粒，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體(Crawford, Estes et al.1999; Jiang, Estes et al.1999);另一類是由 VP2 和 VP6 構(gòu)成的雙層顆粒，以及由VP6構(gòu)成的單層顆粒，由于不含中和抗原，因此不能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，但由于可以刺激機體產(chǎn)生較強的細胞免疫，因此也具有較好的保護效果(Coste，Sirardet al.2000; Yuan, Geyer et al.2000;Nguyen, 1sef et al.2003),由于 VP6變異性相對較小，因此該顆?？梢援a(chǎn)生廣泛的異型保護。相對第一類顆粒，第二類顆粒由于具有同樣的保護效果，但成分較少，大大降低了其工藝難度和成本，因此更受青睞。
[0007]VP2/6-VLP疫苗研制的關(guān)鍵是能夠大量高效的制備均一的VLP樣品。目前常用的是昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中共表達輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP6可以自發(fā)形成VLP (Bertolott1-Ciarlet, Ciarlet et al.2003),但真核表達系統(tǒng)成本高,周期長,操作復(fù)雜，表達量低，并且組裝 過程中常常非特異性包裹雜蛋白和核酸，難以實現(xiàn)高效、可控的組裝(Palomares and Ramirez 2009);盡管目前也有對輪狀病毒類病毒顆粒的體外組裝進行了異性的研究，但其得率較低，限制了 RVVLP疫苗的進一步發(fā)展。
[0008]而原核表達系統(tǒng)具有成本低，操作簡便等優(yōu)勢，但原核表達系統(tǒng)由于缺少特定的翻譯后修飾，導(dǎo)致很多蛋白在原核系統(tǒng)表達中形成包涵體。目前，已有研究通過原核系統(tǒng)表達輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，包括VP6、VP4、VP7，但或以包涵體的形式表達，不能有效復(fù)性(Zhao, Chen et al.2011)，或融合表達(Choi, Basu et al.2000)，盡管融合表達有助于目的蛋白的純化，但融合蛋白的切除往往需要價格昂貴的酶，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。
[0009]因此，本領(lǐng)域仍然需要具有低成本，能夠?qū)崿F(xiàn)體外高效、可控的組裝，可大規(guī)模生產(chǎn)的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白和類病毒顆粒的制備技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種新的制備輪狀病毒雙層類病毒顆粒的方法，該雙層顆粒由輪狀病毒VP2蛋白和VP6蛋白組成。
[0011]本發(fā)明人經(jīng)研究出人意料的發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6在大腸桿菌內(nèi)能夠以可溶形式表達，純化后的VP6以三聚體形式存在，可自組裝形成單層類病毒顆粒6-VLP，也可與病毒樣顆?；蚍遣《緲宇w粒狀態(tài)的VP2共組裝形成雙層類病毒顆粒2/6-VLP，且VP6蛋白及其類病毒顆?？捎糜陬A(yù)防或減輕輪狀病毒感染引起的臨床癥狀。
[0012]因此，本發(fā)明涉及A組輪狀病毒VP6蛋白，該蛋白在大腸桿菌中的表達及純化；含該蛋白的類病毒顆粒2/6-VLP的體外組裝；VP6蛋白及其類病毒顆粒在預(yù)防或減輕輪狀病毒感染引起的腹瀉中的用途。具體如下:
[0013]1.本發(fā)明涉及一種從大腸桿菌中純化輪狀病毒VP6蛋白的方法，包括該蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達和含有該蛋白的裂解上清的純化。
[0014]在一個優(yōu)選實施方案中，獲得VP6蛋白的方法包括:
[0015]a)在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達VP6蛋白；
[0016]b)將表達了 VP6蛋白的大腸桿菌裂解，分離得到上清液；
[0017]c)向b)上清液中加入0.05%~0.5%的聚乙烯亞胺(PEI)或其類似物，也可加入10~80mM的金屬離子如MnCl2、MgCl2、CaCl2、CuCl2、AlCl3等，沉淀核酸和部分雜蛋白，分離得到上清液；
[0018]d)向c)上清液中加入硫酸銨，經(jīng)充分沉淀，收集沉淀；
[0019]e)將d)中沉淀在高鹽緩沖液中重新溶解，分離得到溶液，其中含純度至少85%的VP6蛋白；
[0020]f )將e)中純度至少85%的VP6蛋白經(jīng)色譜層析進一步純化,可得到純度大于98%的VP6蛋白，經(jīng)鑒定，純化后的VP6蛋白在溶液中以非顆粒形式存在。
[0021]2.本發(fā)明再一方面涉及輪狀病毒雙層類病毒顆粒2/6-VLP的體外組裝工藝。
[0022]在一個優(yōu)選實施方案中，2/6-VLP的體外組裝工藝如下:將純化后的VP6蛋白與非顆粒狀態(tài)的VP2蛋白混合，并將緩沖液更換至組裝緩沖液，主要包括以下方面:
[0023]a)組裝緩沖液的pH介于3.0~7.0，優(yōu)選ρΗ4.0~6.4，最優(yōu)選ρΗ6.4:
[0024]b)組裝緩沖液中含0-2M鹽，優(yōu)選NaCl，更優(yōu)選150mM~1M NaCl，最優(yōu)選300mMNaCl ；
[0025]c)VP2蛋白和VP6蛋白的質(zhì)量比介于1:1~1:10，優(yōu)選1:2~1:3，最優(yōu)選1:2.6 ；
[0026]3.本發(fā)明再一方面涉及VP6、6_VLP和2/6-VLP在預(yù)防或減輕輪狀病毒感染引起的腹瀉中的用途。免疫途徑包括但不限于皮下免疫和肌肉注射，佐劑包括但不限于鋁佐劑和弗氏佐劑。
[0027]本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋
[0028]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“大腸桿菌表達系統(tǒng)”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的，在此舉例但不限于:ER2566, BL21(DE3)，TGI, DH5α 及 JM109。
[0029]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體”一詞指的是，可將某編碼蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細胞中獲得表達。舉例來說，載體包括:質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“色譜層析“包括但不限于:離子交換色譜(例如陽離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析以及親和層析色譜。
[0031 ] 根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得VP2和VP6蛋白的方法中，緩沖液是指可在一定范圍內(nèi)維持pH值穩(wěn)定的溶液，包括但不限于，Tris-HCl緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。
[0032]根據(jù)本發(fā)明，所述原核宿主細胞破碎包括但不限于通過勻漿器破碎、均質(zhì)機破碎、超聲波處理、研磨、高壓勻漿、溶菌酶處理中的一項或者多項方法來實現(xiàn)；
[0033]根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得VP6蛋白的方法中，所用的鹽包括但不限于中性鹽，特別是堿金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽，碳酸氫鹽，磷酸鹽或磷酸氫鹽，特別是NaCl、KC1、NH4C1、(NH4) 2S04中的一種或幾種，優(yōu)選NaCl。
[0034]根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得VP6蛋白的方法中，所用聚乙烯亞胺及其類似物是指表面帶正電荷的聚合物，包括但不限于直鏈聚乙烯亞胺、支鏈聚乙烯亞胺及其衍生物，其分子量介于1300~750000，優(yōu)選分子量750000的聚乙烯亞胺。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明獲得VP6蛋白的方法中，所用二價和三價金屬離子包括但不限于 Ca2+、Μη2.、Mg2.、Zn2+、Cu2+ 和 Al3.等，優(yōu)選 Ca2+ 和 Mn2+,最優(yōu)選 Ca2+。
[0036]根據(jù)本發(fā)明，獲得類病毒顆粒2/6-VLP的方法中，緩沖液是指能在一定范圍內(nèi)維持弱酸性pH (pH3.0~7.0)穩(wěn)定的溶液，包括但不限于，磷酸鹽緩沖液，MES緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液等等。
[0037]發(fā)明的有益效果
[0038]目前輪狀病毒VLP制備均米用真核表達系統(tǒng)，應(yīng)用最多的是昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)。
[0039]在真核表達系統(tǒng)中表達的VP2、VP6蛋白構(gòu)象更接近天然蛋白，能夠在體內(nèi)自發(fā)形成VLP，但是真核表達系統(tǒng)表達周期長，操作復(fù)雜，表達量低，組裝過程中常常非特異性包裹雜蛋白和核酸，特別是多蛋白共表達過程中會形成不同類型的病毒樣顆粒，后期純化困難，難以實現(xiàn)高效、可控的組裝，再加上高昂的成本，給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了極大困難。
[0040] 而原核表達系統(tǒng)特別是大腸桿菌表達系統(tǒng)具有成本低，周期短，表達量大的優(yōu)勢，是重組蛋白最常用、最成熟的表達系統(tǒng)。但在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達的輪狀病毒衣殼蛋白往往不能形成正確構(gòu)象，以包涵體形式表達，而包涵體復(fù)性難度大、效率低，難以用于大規(guī)模生產(chǎn)。融合表達可實現(xiàn)VP6的可溶性表達，但融合蛋白的切割往往需要價格昂貴的酶，無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0041]本發(fā)明在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達了 A組輪狀病毒內(nèi)衣殼蛋白VP6，經(jīng)過PEI或金屬離子沉淀預(yù)處理可去除大部分的核酸和部分雜蛋白，而VP6蛋白仍以可溶形式保留于上清中，進一步通過鹽析和色譜層析純化，可獲得純度高于95%的VP6蛋白；經(jīng)分析，該蛋白在溶液中以三聚體的形式存在，保持了 VP6蛋白的正確構(gòu)象。該工藝操作簡便，成本低廉，得率較高，可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。通過以上步驟獲得純化后的VP6蛋白可以自組裝為單層顆粒6-VLP，也可與顆?；蚍穷w粒狀態(tài)的VP2共組裝形成雙層顆粒2/6-VLP，其工藝簡單、可控且組裝效率高于95%，顯著高于真核表達自組裝的效率；經(jīng)小鼠實驗證實，原核表達的VP6蛋白及其類病毒顆粒具有較高的免疫原性和較好的保護性，具有成為輪狀病毒候選疫苗的潛力。
[0042]由此可見，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明的制備方法既不需要真核表達的高昂成本，復(fù)雜工藝，也不需要昂貴的酶，操作簡便，成本低廉；純化工藝中沒有經(jīng)過劇烈的變性、復(fù)性，保留了 VP6蛋白的正確構(gòu)象，該蛋白可自組裝形成6-VLP或與VP2共組裝形成2/6-VLP,具有較好的免疫原性，且在小鼠實驗中表現(xiàn)出較好的免疫保護性；本發(fā)明的VP6蛋白和類病毒顆粒的制備方法可用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明的VP6蛋白及其類病毒顆?？捎糜陬A(yù)防輪狀病毒感染引起的腹瀉。
[0043]下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1顯示了實施例1中不同純化階段的VP6蛋白經(jīng)10%SDS_PAGE分離的結(jié)果。圖1A顯示了 PEI沉淀的結(jié)果，1:裂解上清，2~9:不同PEI濃度條件下40%硫酸銨沉淀的結(jié)果，2:無 PEI，3:0.05%PEI ；4:0.08%PEI ；5:0.1%PEI ；6:0.15%PEI ；7:0.2%PEI，8:0.3%PEI ；
9:0.5%PEI ;圖1B顯示了金屬離子沉淀+40%硫酸銨沉淀的結(jié)果，1:20mM MnCl2，2:10mMCaCl2，3:20mM CaC2，4:50mM CaCl2，5:100mM CaCl2 ;其中以 20mM CaCl2 條件下的純度最高；圖1C顯示了 20mM CaC12沉淀一25%硫酸銨沉淀一Phenyl-HP純化的結(jié)果，1:菌體裂解上清；2:CaC12沉淀后上清；3:硫酸銨沉淀后溶解上清；4: Phenyl-HP 2M NaCl洗脫組分。結(jié)果顯示，通過二價離子沉淀、硫酸銨沉淀粗純后，VP6的純度由10%左右提高到85%左右，進一步通過疏水層析純化后其純度達到98%以上。
[0045]圖2顯示了實施例2中不同純化階段VP2蛋白經(jīng)10%SDS_PAGE分離的結(jié)果。1:菌體裂解上清；2:PEI沉淀上清；3:硫酸銨沉淀后溶解上清；4:SP FF 500mM NaCl洗脫組分。結(jié)果顯示，通過PEI沉淀、硫酸銨沉淀粗純后，VP2純度從5%左右，提高到了約80%左右，進一步通過陽離子交換色譜純化后其純度達到95%左右。
[0046]圖3顯示了純化后的VP2蛋白和VP6蛋白經(jīng)SDS-PAGE、分子篩層析和分析超離鑒定的結(jié)果。其中圖A顯示了 SDS-PAGE鑒定的結(jié)果，1為分子量Marker ;2_5為純化后的VP2蛋白，6-9為純化后的VP6蛋白，其中2&5為上樣緩沖液含巰基乙醇，100°C水浴lOmin的結(jié)果，3&6為上樣緩沖液含巰基乙醇，未經(jīng)熱處理的結(jié)果，4&8為上樣緩沖液中不含巰基乙醇，100°C水浴lOmin的結(jié)果；5&9為上樣緩沖液中不含巰基乙醇，無熱處理的結(jié)果?？梢姡琕P2蛋白和VP6蛋白的純度均達到95%以上，VP2蛋白以單體形式存在，可能SDS破壞了 VP2單體間的相互作用，而VP6以聚體形式存在。圖B顯示了純化后的VP2蛋白和VP6蛋白經(jīng)Sepherdex200分子篩層析鑒定的結(jié)果，VP2蛋白和VP6蛋白的保留時間分別為27.34min和33.91min。圖3C顯示了 VP2蛋白經(jīng)分析超離鑒定的結(jié)果，其分子量為204.4±5.6KD，接近二聚體的分子量。圖3D顯示了 VP6蛋白經(jīng)分析超離鑒定的結(jié)果，其分子量為114.9±1.6KD,接近三聚體的分子量。
[0047]圖4顯示了實施例4 中RV類病毒顆粒2-VLP的透射電鏡結(jié)果，視野中可見大量直徑50-60nm的類病毒顆粒，與理論值相符。
[0048]圖5顯示了實施例5中所得類病毒顆粒6-VLP鑒定的結(jié)果。A為透射電鏡觀察結(jié)果，可見大量直徑70nm左右的顆粒，結(jié)構(gòu)較為松散；B為動態(tài)光散射的結(jié)果，6-VLP的水花分子動力學(xué)半徑為40.36nm，顆粒組裝百分比為100% ；C為G5000PWXL分子篩層析的結(jié)果，6-VLP的保留時間為10.551min，顆粒組裝效率高于95%。[0049]圖6顯示了實施例5中通過兩步法組裝的類病毒顆粒2/6-VLP鑒定的結(jié)果。A為分析型超速離心的結(jié)果為pH6.0條件下透射電鏡觀察的結(jié)果，可見直徑60nm左右的類
病毒顆粒。
[0050]圖7顯示了實施例5中不同緩沖體系下2/6-VLP鑒定的結(jié)果。A:5(MM MES6.0，可見大量直徑70nm左右的單層顆粒；B:50MM MES6.0+150mM NaCl，可見直徑70nm左右的單層顆粒和60nm左右的雙層顆粒；C:50MM MES6.0+300mM NaCl，可見直徑60nm左右的雙層顆粒，大小均一 ；D:5(MM MES6.0+500mM NaCl，可見直徑60nm左右的雙層顆粒，大小均一 ；E:PB5.8+300mM NaCl，可見直徑60nm左右的雙層顆粒；F:PB6.0+300mM NaCl，可見直徑60nm左右的雙層顆粒；G:PB6.4+300mM NaCl可見直徑60nm左右的雙層顆粒，大小均一 ；H:6-VLP對照，可見直徑70nm左右的單層顆粒。
[0051]圖8顯示了實施例5中VP2和VP6不同比例下2/6-VLP鑒定的結(jié)果。A為透射電鏡觀察的結(jié)果，在VP2和VP6的質(zhì)量比介于1:2-1:6的條件下，視野中均為直徑60nm左右的雙層顆粒2/6-VLP，而在VP2與VP6的質(zhì)量比為1:10的條件下，視野中則既有直徑60nm左右的2/6-VLP，也有直徑70nm左右的6-VLP ；B和C為實施例4中通過兩步法組裝的2/6-VLP分析超離的結(jié)果，其沉降系數(shù)在251-264S，VP2和VP6的最佳質(zhì)量比為1:2.6。
[0052]圖9顯示了實施例5中最佳條件下2/6-VLP鑒定的結(jié)果。A為透射電鏡觀察的結(jié)果，可見大量直徑60nm左右的類病毒顆粒，為雙層結(jié)構(gòu)，大小和形態(tài)與理論相符，均勻一致為動態(tài)光散射的結(jié)果，其水化分子動力學(xué)半徑為34.27nm，顆粒組裝百分比為100% ；C為G5000PWXL分子篩層析的結(jié)果，2/6-VLP的保留時間為10.821min，組裝效率高于95%。
[0053]圖10顯示了實施例1中的VP6蛋白，實施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104細胞培養(yǎng)的A組輪狀病毒免疫后小鼠血清中VP6抗體的滴度，與培養(yǎng)病毒相比，VP6，6-VLP以及2/6-VLP均具有較高的免疫原性。
[0054]圖11顯示了實施例1中的VP6蛋白，實施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104細胞培養(yǎng)的A組輪狀病毒10ug劑量下經(jīng)肌肉注射免疫三次后母鼠和乳鼠血清中針對VP6的抗體滴度，其中A為不同免疫組母鼠血清抗體滴度，B為不同免疫組乳鼠血清抗體滴度。
[0055]圖12顯示了實施例1中的VP6蛋白，實施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104細胞培養(yǎng)的A組輪狀病毒母傳抗體對乳鼠感染輪狀病毒后發(fā)生腹瀉的情況。
[0056]圖13顯示了實施例1中的VP6蛋白，實施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104細胞培養(yǎng)的A組輪狀病毒母傳抗體對乳鼠感染輪狀病毒后排毒的影響及保護效果，其中A為不同免疫組小腸內(nèi)溶物通過ELISA檢測的病毒滴度的情況，B為不同免疫組與對照組相t匕排毒量降低的比例。
[0057]序列信息
[0058]本發(fā)明涉及的序列的信息提供于下面的表1中
[0059]表1:引物列表
【權(quán)利要求】
1.一種制備輪狀病毒雙層類病毒顆粒的方法，所述雙層類病毒顆粒包含輪狀病毒VP2蛋白和VP6蛋白，所述方法包括以下步驟:a)在原核表達系統(tǒng)中以可溶形式表達VP6，并進行純化，純化后的VP6蛋白保持其正確構(gòu)象，以三聚體形式存在；b)將純化后的VP6與與顆?；蚍穷w粒狀態(tài)的VP2共組裝形成雙層顆粒2/6-VLP。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述VP6蛋白通過以下步驟制備:1)在大腸桿菌中表達輪狀病毒VP6蛋白；2)向含VP6蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亞胺(PEI)或其類似物，或二價或三價金屬離子，以沉淀核酸和部分雜蛋白，PEI的濃度介于0.05%-0.2%，優(yōu)選0.1% ;金屬離子包括但不限于 Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+和 Al3+,優(yōu)選 Mn2+和 Ca2+,最優(yōu)選 Ca2+ ；Ca2+ 的濃度介于 10 ~80mM,優(yōu)選15~50mM，最優(yōu)選20mM ；3)離心，使蛋白質(zhì)上清液經(jīng)歷鹽析和色譜層析純化。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述鹽析使用飽和硫酸銨進行。
4.權(quán)利要求2的方法， 其中所述色譜層析包括:疏水相互作用色譜和離子交換色譜，優(yōu)選疏水作用色譜，其中最優(yōu)選3M NaCl條件下經(jīng)Phenyl HP (GE)，其中核酸穿透，VP6蛋白在2M NaCl條件下洗脫，雜蛋白在無鹽條件下洗脫。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述VP2蛋白是通過以下步驟制備的非顆粒狀態(tài)的VP2蛋白:1)在大腸桿菌中表達輪狀病毒VP2蛋白；2)向含VP2蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亞胺(PEI)，PEI的濃度介于0.05%_1%，優(yōu)選0.3%-0.5%,最優(yōu)選 0.5% ；3)離心，使蛋白上清液經(jīng)鹽析和色譜層析純化。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述鹽析使用硫酸銨進行。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述色譜層析包括離子交換色譜和疏水相互作用色譜，優(yōu)選陽離子交換色譜，最優(yōu)選Tris-HCl (?!18.0)條件下通過5? FF (GE)進行純化，其中核酸和部分雜蛋白穿透或在150mM NaCl條件下洗脫，VP2蛋白在500mM NaCl條件下洗脫。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述顆粒狀態(tài)的VP2是由VP2蛋白組成的單層類病毒顆粒2-VLP。
9.權(quán)利要求1-8任一項的方法，其中所述雙層類病毒顆粒2/6-VLP的組裝包括將VP6和VP2蛋白混合后，將緩沖液更換至組裝緩沖液而組裝成雙層類病毒顆粒，其中:a)VP2、VP6為未組裝成顆粒的純化的蛋白，其純度為95%以上；b)組裝緩沖液為磷酸鹽緩沖液，MES緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液，其pH介于3.0~7.0，優(yōu)選ρΗ4.0~ρΗ6.4，最優(yōu)選地，該緩沖液的pH為6.4 ;c)組裝緩沖液含0~2M的鹽離子，優(yōu)選NaCl，更優(yōu)選地，該緩沖液含150-2MNaCl，最優(yōu)選地，該緩沖液含300mM NaCl ；d)VP2和VP6的質(zhì)量比介于1:1~1:10，優(yōu)選地，該比例為1:2~1:3，最優(yōu)選地，該比例為1:2.6。
【文檔編號】C12N7/04GK103667199SQ201210350365
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月20日
【發(fā)明者】葛勝祥, 李廷棟, 郭清順, 徐飛海, 張軍, 夏寧邵 申請人:廈門大學(xué), 廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司