一種檢測(cè)Ⅱ型豬嗜淋巴皰疹病毒引物、探針和試劑盒和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種特異性檢測(cè)Ⅱ型豬嗜淋巴皰疹病毒檢測(cè)用的引物對(duì)，所述上游引物PLHV?2 D F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物PLHV?2 D R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；一種與所述引物對(duì)配合使用的熒光探針，探針PLHV?2 D P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；一種檢測(cè)Ⅱ型豬嗜淋巴皰疹病毒的試劑盒和應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)Ⅱ型豬嗜淋巴皰疹病毒具有檢測(cè)準(zhǔn)確，靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的檢測(cè)能力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種檢測(cè)n型豬嗜淋己瘡疹病毒引物、探針和試劑盒和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測(cè)技術(shù)，具體設(shè)及一種用于檢測(cè)n型豬嗜淋己瘤疹病毒的引 物、探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬是人類(lèi)器官移植的動(dòng)物代替源中最有發(fā)展前景的供體，但豬的體內(nèi)也攜帶有各 類(lèi)病毒，并已有研究發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)具有多種可W感染人體的病毒，但運(yùn)些病毒在豬體內(nèi)并不 發(fā)病，不容易被人類(lèi)所認(rèn)識(shí)。根據(jù)科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，豬嗜淋己瘤疹病毒（Porcine Lymphotropic Herpesviruses,化HV-1, -2, and -3)廣泛分布在豬的群屬中，并與人類(lèi) 的丫型致病性瘤疹病毒（HHV-4,-8)有著密切的聯(lián)系。運(yùn)用全瘤疹病毒PCR檢測(cè)法， Chmielewicz等(2003a)分析了采集自294頭豬的495份血液和組織樣品，128份(26%)檢測(cè)到 PLHV序列，運(yùn)些分子水平流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示商業(yè)豬場(chǎng)PLHV感染是普遍存在的。而且，通過(guò)實(shí) 驗(yàn)性的器官移植試驗(yàn)，PLHV-1和化HV-2被證實(shí)在豬群屬中會(huì)引起移植后淋己增殖性疾病 (PTLD)，而運(yùn)種在豬種屬中發(fā)生的移植后淋己增殖性疾病與人體經(jīng)過(guò)器官或同源異體的骨 髓移植過(guò)后引發(fā)的淋己增殖性疾病(HHV-4)有著十分相似的臨床性狀。n型豬嗜淋己瘤疹 病毒(PLHV-2)作為嗜淋己病毒成員，在血液的外周血細(xì)胞、淋己結(jié)、脾臟和扁桃體等組織經(jīng) ?？蓹z測(cè)到其序列片段。通過(guò)豬的細(xì)胞、組織和器官對(duì)人體進(jìn)行異種器官移植可能會(huì)激活 潛伏在豬體內(nèi)的PLHV-2并具有傳播到人體內(nèi)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，運(yùn)將會(huì)引起人體的移植后淋己增 殖性疾病或相關(guān)疾病，危害人體健康。
[0003] 實(shí)時(shí)巧光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，W巧光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定 量分析的方法。實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)具使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的 準(zhǔn)確性。同時(shí)，祀序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低;綜合了PCR技術(shù)、巧光標(biāo) 記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高；由于巧光信號(hào) 的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，通過(guò)巧光信號(hào)的檢測(cè)可W直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定 量，所W其線(xiàn)性關(guān)系好、線(xiàn)性范圍寬；同時(shí)該方法操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、不易污 染。將該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用到化HV-2病毒的檢測(cè)當(dāng)中，該檢測(cè)手段更加靈敏、準(zhǔn)確、高效，效果 更佳。
[0004] 中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利201310728131.7公開(kāi)了一種利用實(shí)時(shí)巧光定量PCR特異性檢測(cè) PLHV-3的方法及相應(yīng)的探針、引物和試劑盒，該技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)， 具有良好的檢測(cè)能力。但PLHV-3與PLHV-2的基因同源性較低，只有66%的氨基酸序列同源 性。雖有報(bào)道豬嗜淋己瘤疹病毒不同基因型間的DNA聚合酶(DP0L)的編碼基因較為保 守，但二者間仍存在超過(guò)50個(gè)堿基對(duì)的差異，實(shí)質(zhì)上無(wú)法通過(guò)化HV-3的檢測(cè)方法推導(dǎo)出 化HV-2的檢測(cè)方法。綜上所述，為有效利用豬器官作為供體對(duì)于人體進(jìn)行安全穩(wěn)定的異種 器官移植，從移植的源頭上消除用于異種移植的豬的體內(nèi)的器官和組織中的淋己瘤疹病毒 意義重大，為能夠給移植后的人機(jī)體具有穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境和良好的健康狀態(tài)提供保障，本發(fā) 明提供一種高靈敏度、高特異性、高效率的對(duì)于PLHV-2的快速分析手段，W從源頭確保移植 器官及組織的安全性和穩(wěn)定性，具有寶貴的醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明公開(kāi)一種能準(zhǔn)確、快速檢測(cè)n型豬嗜淋己瘤疹病毒的引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種與上述引物對(duì)配合使用的巧光探針。
[0007] 本發(fā)明的第=個(gè)目的是提供檢測(cè)n型豬嗜淋己瘤疹病毒的檢測(cè)試劑、試劑盒及其 反應(yīng)體系。
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種用于檢測(cè)n型豬嗜淋己瘤疹 病毒的PCR引物對(duì)，其上游引物的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的核巧酸 序列如沈Q ID NO.2所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種與上述引物對(duì)配合使用的巧 光探針，其序列為PLHV-2 D P1如SEQ ID N0.3所示；所述探針的5'端標(biāo)記有巧光報(bào) 告基團(tuán)，3 '端標(biāo)記有巧光澤滅基團(tuán)。
[0010] 所述巧光報(bào)告基團(tuán)為FAM、皿乂、106、￥1(：、肥0中的任一種；所述巧光澤滅基團(tuán)為 MGB、B冊(cè)-1、B冊(cè)-2、TAMRA 中的任一種。
[0011] 本發(fā)明中，所述探針為化qMan探針。
[0012]本發(fā)明通過(guò)從GenBank下載n型豬嗜淋己泡疹病毒所有同源基因序列，根據(jù)n型 豬嗜淋己泡疹病毒標(biāo)準(zhǔn)株(GeneBankNo.AY170317)的所有同源基因序列，用DNAStar軟件 進(jìn)行同源性比對(duì)，篩選出一段高度保守序列（如SEQ ID NO.4所示），并W之作為模板，用 Primer Express 5.0軟件，設(shè)計(jì)出引物及化qMan探針。
[0013] 本發(fā)明所述檢測(cè)化HV-2的引物對(duì)設(shè)計(jì)遵循W下原則：引物與模板的序列要緊密 互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不能在模板的非目的位點(diǎn) 引發(fā)DNA聚合反應(yīng)；引物長(zhǎng)度設(shè)定在20-25bp，Tm值在55-70°C，GC含量在40%-60%，產(chǎn)物 大小在100-25化P之間；引物的3'端避免使用堿基A，引物3'端避免出現(xiàn)3個(gè)W上連續(xù)相同 的堿基;為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。
[0014] 在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于豬嗜淋己泡疹病毒研究最多的為化HV-1，且已獲得較多的基 因組序列，雖對(duì)于化HV-2的基因組序列也有研究，但是被公開(kāi)報(bào)道的基因組序列很少，研究 仍停留在初級(jí)階段，對(duì)于PLHV-2病毒的基因組序列及其特性仍有待進(jìn)一步深入探究。由于 不同的目標(biāo)片段其性質(zhì)并不一致，尤其是對(duì)引物的敏感度不同，在沒(méi)有完全獲知引物特異 性擴(kuò)增目標(biāo)片段的機(jī)理情況下，設(shè)計(jì)能特異性檢測(cè)PLHV-2的特異性引物是仍存在一定的 難度，尤其反應(yīng)體系更是無(wú)法通過(guò)有限次的實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出來(lái)。運(yùn)也是現(xiàn) 有技術(shù)仍未有設(shè)計(jì)出一種高特異性的引物來(lái)解決運(yùn)一難題。本發(fā)明通過(guò)對(duì)n型病毒標(biāo)準(zhǔn)株 的 DP0L基因化eneBanWo.AF191043、AY170314 和 AY170317)進(jìn)行篩選比對(duì)，篩選出PLHV- 2 DP0L編碼基因中一段高度保守的化HV-2 DP化基因保守片段，進(jìn)而設(shè)計(jì)出一對(duì)能特異 性檢測(cè)PLHV-2的特異性引物。為確保引物探針的特異性，將設(shè)計(jì)好的序列在BLAST中核實(shí) 一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，將重新設(shè)計(jì)探針。
[0015] 鑒于化HV-2的引物設(shè)計(jì)對(duì)引物擴(kuò)增區(qū)的要求較高，所W本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)較普 通引物設(shè)計(jì)難度更大，要設(shè)計(jì)出優(yōu)良的引物，需要在各種生物信息軟件評(píng)估的基礎(chǔ)上進(jìn)行 費(fèi)時(shí)的篩選。由于所設(shè)計(jì)的引物具有高度的選擇特異性，在進(jìn)行對(duì)PLHV-2的檢測(cè)時(shí)，要求 引物所針對(duì)的祀序列位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)相當(dāng)保守，運(yùn)樣所建立的反應(yīng)體系才具有普遍的適用性。研 究中也可W設(shè)計(jì)一些兼并引物W增強(qiáng)應(yīng)用的廣泛性，但兼并度過(guò)高的引物會(huì)對(duì)擴(kuò)增造成負(fù) 面影響。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中祀序列的長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)控制在23化P左右，才有利于 擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，過(guò)長(zhǎng)會(huì)給反應(yīng)起始物的形成與后期循環(huán)反應(yīng)帶來(lái)困難，有時(shí)甚至在1 h 內(nèi)沒(méi)有明顯擴(kuò)增。對(duì)于一些具有GC含量高、變異性強(qiáng)、保守區(qū)離散等特點(diǎn)的目的序列，沒(méi) 有辦法設(shè)計(jì)出非常適用的引物，使PCR技術(shù)的應(yīng)用受到限制。
[0016] 通過(guò)不斷的試驗(yàn)優(yōu)化，分別在反應(yīng)體系和反應(yīng)條件兩方面進(jìn)行摸索，W期得到最 佳的試劑濃度和反應(yīng)溫度。反應(yīng)體系方面：針對(duì)烙解溫度、引物使用濃度和探針的使用濃 度進(jìn)行反復(fù)試驗(yàn)，分別對(duì)相關(guān)試劑進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)玫狡湓隗w系中的最佳反應(yīng)濃度和溫度。 例如:烙解溫度(Tm)作為引物的一個(gè)重要參數(shù)，當(dāng)50%的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分 子時(shí)的溫度?；瘜?duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，W保證引 物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，W減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55°C到 7(TC。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低fTC。本發(fā)明采用近鄰分析法設(shè)計(jì)引物的Tm值，通過(guò) 計(jì)算機(jī)程序從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性，通過(guò)oligo軟件自 動(dòng)計(jì)算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時(shí)可W如下進(jìn)行：W低于估算的Tm 5°C作為起始的退 火溫度，為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性 產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)fTC， 就會(huì)由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同， 將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低fTC?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可W在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火 溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。運(yùn)使得在較為嚴(yán) 謹(jǐn)?shù)臈l件下可W獲得目的模板的部分拷貝。本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系中Tm值優(yōu)選55-65°C， 最佳為60°C。
[0017] 引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在〇.巧化.5咖。較高的引物濃度 會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度，通過(guò)在260nm(0D260)測(cè)量光密度值，然后使 用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)(nmol/OD)，通過(guò)Beers法則計(jì)算引物濃度。與大分子雙 鏈DNA可W使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。運(yùn)是因 為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可W計(jì)算出引物的的消光系數(shù)(OD/wnol) 和消光系數(shù)的倒數(shù)(皿ol/OD)。本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系中引物濃度在0.巧IjO. 5咖，最佳為 0.2如1。
[0018] 反應(yīng)條件方面，參考相關(guān)方法的試劑濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間，進(jìn)行多次調(diào)整，確定 合適的反應(yīng)條件。并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)重復(fù)性、靈敏性、特異性進(jìn)行了摸索和驗(yàn)證。
[0019] 本發(fā)明同時(shí)提供一種上述引物對(duì)和巧光探針在制備n型豬嗜淋己瘤疹病毒的檢 測(cè)試劑盒或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0020] 具體的，上述應(yīng)用將DEPC水12.祉L，10XPCR反應(yīng)緩沖液2.化L，50mM儀離子(一 般用MgCL2) 1.0化，lOmM dNTPs(包括等比例的（141?3、(1刊？3、(161?3、(1機(jī)？3)混合溶液 0.扣L，10yM PLHV-2 D F1 0.扣L，10yM PLHV-2 D R1 0.扣L，10yM PLHV-2 DPI 0.5化，5 U /化的Taq酶0.化L，待測(cè)樣品DM模板2.0化構(gòu)成20化的檢測(cè)反應(yīng)體系。
[0021] 具體的，上述應(yīng)用中試劑盒工作條件為95°C，3min ;95°C，10s ;60°C，15s;72°C， 40s，共做40個(gè)循環(huán)，然后終止。
[0022] 本發(fā)明的第=個(gè)目的通過(guò)一下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種n型豬嗜淋己瘤疹病毒的診 斷試劑，其含有上述的引物及巧光探針。
[0023] 本發(fā)明還提供一種n型豬嗜淋己瘤疹病毒的檢測(cè)試劑盒，其上述的引物及巧光探 針。
[0024] 進(jìn)一步的，所述檢測(cè)試劑盒其20化反應(yīng)體系的具體配置 為DEPC水12.祉L，10XPCR反應(yīng)緩沖液2.0化，50mM儀離子(一般用Mg化2) l.OiiLaOmM dNTPs(包括等比例的（141?3、(1刊？3、(161?3、(1巧^3)混合溶液0.5化，1化1化^-2 0尸1 0.扣L，10yM PLHV-2 D R1 0.扣L，10yM 化HV-2 DPI 0.5化，5 U /化的 hq 酶 0.化L，待 測(cè)樣品DNA模板2.化L。
[0025] 具體的，其工作條件為95°C，3min ;95°C，10s ;6〇1：，153;72°(：，4〇3，共做40個(gè)循 環(huán)，然后終止。
[0026] 本發(fā)明中，可使用的通用的化qMan探針，在PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外 加入一個(gè)特異性的巧光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。 探針的5'端標(biāo)記有巧光報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R)，如FAM、肥乂、抓6、￥1(：、肥0，3'端標(biāo)記有巧 光澤滅基團(tuán)（如encher, Q)，如MGB、B冊(cè)-1、B冊(cè)-2、TAMRA。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5'端報(bào)告基團(tuán) 經(jīng)儀器光源激發(fā)的巧光正好被近距離的3'端巧光基團(tuán)澤滅，儀器檢測(cè)不到5'端報(bào)告基團(tuán)所 激發(fā)的巧光信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5'-3' 外切酶活性就會(huì)將切割探針，釋放5'端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3'端巧光澤滅基 團(tuán)的屏蔽，5'端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的巧光信號(hào)就可W被探頭檢測(cè)到。也就是說(shuō)每擴(kuò)增 一條DNA鏈，就有一個(gè)巧光分子形成，實(shí)現(xiàn)了巧光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告 信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)，巧光信號(hào)隨著目的片段的 延伸有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，在每個(gè)循環(huán)接收采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)判 定結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)n型豬嗜淋己瘤疹病毒的檢測(cè)和定量。
[0027] 此外還可W利用上述引物對(duì)對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，通過(guò) 電泳結(jié)果條帶所處的位置，進(jìn)一步佐證檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
[0028] 本發(fā)明更提供一種采用所述試劑盒檢測(cè)供移植豬組織或器官的方法，包括如下步 驟：a.從待移植的豬組織或器官內(nèi)提取其總DNA ;b.采用權(quán)利要求5所述的試劑盒， W總DNA為模板進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增 曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)判定結(jié)果。
[0029] PLHV-2在活豬的體內(nèi)并不表達(dá)，但移植至人體后，則容易發(fā)病。當(dāng)采用本發(fā)明對(duì)待 移植的豬組織或器官中PLHV-2檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)當(dāng)杜絕采用該受感染的組織或器官 進(jìn)行器官移植手術(shù)。
[0030] 現(xiàn)有技術(shù)中所用的化HV-2定量PCR目前仍存在較多的技術(shù)難點(diǎn)，主要在于：（1)如 何確定PCR正處于線(xiàn)性擴(kuò)增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號(hào)才與初始模板的拷貝數(shù)成 比例）。（2)-旦線(xiàn)性擴(kuò)增范圍確定W后，如何找到一個(gè)合適的方法檢測(cè)結(jié)果。為了保證線(xiàn) 性，研究者要擴(kuò)增一系列梯度稀釋的cDNA或者對(duì)每個(gè)基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整;有 的研究者加一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性模板，有的做限制性的稀釋梯度分析，或者加一個(gè)PCR模擬(mimic) 反應(yīng)，即用相似的引物與目標(biāo)產(chǎn)物共擴(kuò)增，而擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)通常在跑膠W后通過(guò)染料、放 射活性或者探針進(jìn)行檢測(cè)。（3)大多數(shù)是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng) 過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí) 驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量；雖然加入內(nèi)標(biāo) 后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，現(xiàn)有的定量方法也都只能算作 半定量的方法，而且勞動(dòng)強(qiáng)度大、定量不準(zhǔn)確、重復(fù)性差。
[0031] 本發(fā)明針對(duì)PLHV-2的基因中保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性探針和擴(kuò)增引物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室 條件優(yōu)化，建立了針對(duì)PLHV-3的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)體系W及W該體系為基礎(chǔ)構(gòu)建的 靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明主要具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、特異性好，使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，祀序列 由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。
[0032] 2、靈敏度高，巧光PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、巧光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼 顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。
[0033] 3、線(xiàn)性關(guān)系好、線(xiàn)性范圍寬，由于巧光信號(hào)的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成一一對(duì)應(yīng)的 關(guān)系，通過(guò)巧光信號(hào)的檢測(cè)可W直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量;定量范圍可在0-1010拷貝/毫升。
[0034] 4、操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。擴(kuò)增和檢測(cè)可W在同一管內(nèi)檢測(cè)，不需 要開(kāi)蓋，不易污染;同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)一步完成，不需要后期處理，不再需要擔(dān)屯、放射性污染。
[0035] 5、速度快、高通量，可在2 - 3小時(shí)完成96個(gè)樣品的定量分析。
[0036] 6.應(yīng)用范圍廣，本發(fā)明所提供的化HV-2特異性引物及探針，可在現(xiàn)有的設(shè)備下 完成對(duì)樣品的檢測(cè)；同時(shí)本發(fā)明所提供的特異性引物所擴(kuò)增的目的基因亦可采用普通的凝 膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)些都使該技術(shù)在小型研究所、獸醫(yī)站乃至普通養(yǎng)殖戶(hù)有著更廣闊的應(yīng) 用前景。
[0037] 本發(fā)明引物和探針特異性好，制備成試劑盒用于n型豬嗜淋己瘤疹病毒的檢測(cè)靈 敏度、準(zhǔn)確性高和特異性強(qiáng);本發(fā)明檢測(cè)方法可W快速檢測(cè)出樣品是否含有n型豬嗜淋己 瘤疹病毒，并能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中n型豬嗜淋己瘤疹病毒的拷貝數(shù)含量。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為實(shí)施例3中實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)n型豬嗜淋己泡疹病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；陽(yáng) 性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示，實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)豬博卡病毒的2.42拷貝/化~2.42 X 104拷貝/化范 圍內(nèi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999。
[0039] 圖2為實(shí)施例4中實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)n型豬嗜淋己泡疹病毒的特異性檢測(cè) 結(jié)果； 其中，1為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果;2為樣品中n型豬嗜淋己泡疹病毒的實(shí)時(shí)巧光定量 PCR擴(kuò)增結(jié)果，3為豬偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果，4為豬n型圓環(huán)病毒的 實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果；5為大腸桿菌(Escherichia coin擴(kuò)增結(jié)果;6為豬藍(lán)耳病病 毒（PRRSV)擴(kuò)增結(jié)果；7為A群豬輪狀病毒（ProV A)擴(kuò)增結(jié)果；8為化HV-1擴(kuò)增結(jié)果；9為 PLHV-3擴(kuò)增結(jié)果。
[0040] 圖3為實(shí)施例5中實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)n型豬嗜淋己泡疹病毒的靈敏度檢測(cè) 結(jié)果； 將本實(shí)驗(yàn)室獲得的含有n型豬嗜淋己泡疹病毒DNAP0LY基因的陽(yáng)性質(zhì)粒依次進(jìn)行10倍 系列稀釋?zhuān)瑘D中10~17曲線(xiàn)所示質(zhì)粒濃度依次為2.42拷貝AiL~1.44X107拷貝/化。
[0041 ] 圖4為實(shí)施例6中實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)n型豬嗜淋己泡疹病毒DNAP0LY基因的陽(yáng) 性質(zhì)粒重復(fù)性試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述： 實(shí)施例1引物及探針的設(shè)計(jì)和合成 從GenBank下載n型豬嗜淋己泡疹病毒所有同源基因序列，根據(jù)n型豬嗜淋己泡疹病 毒標(biāo)準(zhǔn)株(GeneBankNo. AY170317)的所有同源基因序列，用DNAStar軟件進(jìn)行同源性比對(duì)， 用primer E邱res巧.0軟件，設(shè)計(jì)出引物及化qMan探針，引物和探針由上海生工公司合成。 擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度234bp。
[0043] 上游引物核巧酸序列如PLHV-2 D F1所示； 下游引物核巧酸序列如PLHV-2 D R1所示； 與上述引物配合使用的探針的核巧酸序列如PLHV-2 D P1所示。該探針5'端標(biāo)記有報(bào) 告FAM巧光染料，另3'端標(biāo)記有澤滅B冊(cè)1巧光染料。
[0044] 實(shí)施例2總DNA的提取步驟如下： 加等量的抗凝血緩沖液或是用抗凝血采血管采集豬血樣3~5M1，混勻，2~8°C保存3 天。將血樣SOOOr/min離屯、5min，去掉上清液，吸取紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞，移入無(wú)污染或無(wú)生 物毒性的離屯、管備用。按北京天根生物科技公司病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(DP315)使 用說(shuō)明提取病毒DNA(本試驗(yàn)提取DNA只是基于DP315試劑盒，其它商品化的病毒DNA提取試 劑盒均適用），直接使用或于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0045] 實(shí)施例3實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增方法的建立 1、實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系 W總DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)，即在20化反應(yīng)體系中含：10 X巧光定 量PCR緩沖液化L，0.扣LdNTPsa0mmol/L)，0.5化引物化HV-2DFla0umol/L)，0.扣L 引物化HV-2 D R1 (10umol/L)，1.0化儀離子（50mmol/L)，0.扣L 巧光探針（lOumol/L)，2 化DM模板，0.2化化q酶(5U)，并用DEPC處理水補(bǔ)充到20化。
[0046] 2、實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)條件 將樣品管放入ABI公司7500巧光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行:95°C，3min ;95°C， 10s ;60°C，15s;72°C，40s共做40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò) 增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)判定結(jié)果。
[0047] 3.實(shí)時(shí)巧光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立將n型豬嗜淋己泡疹病毒234bp基因片段 克隆到pUCM-T載體中構(gòu)建成陽(yáng)性質(zhì)粒，質(zhì)粒小提并測(cè)定含量約為2.42 X 1〇8拷貝/化。然 后W10倍系列稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為定量陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板，建立n型豬嗜淋己泡疹病毒的實(shí)時(shí) 巧光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示在2.42~2.42X 104拷貝范圍內(nèi)n型豬嗜淋己泡疹病毒檢測(cè) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)有很好的線(xiàn)性關(guān)系（圖1)。
[0048] 實(shí)施例4 n型豬嗜淋己泡疹病毒實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法的特異性確定 W陽(yáng)性質(zhì)粒提取DNA作為陽(yáng)性質(zhì)量控制對(duì)照，分別檢測(cè)n型豬嗜淋己泡疹病毒、豬偽狂 犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬藍(lán)耳病病毒、大腸桿菌、A群豬輪狀病毒陽(yáng)性樣品和本實(shí)驗(yàn)室獲得 的PLHV-1和 PLHV-3。
[0049] 通過(guò)實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)巧光強(qiáng)度變化。結(jié)果顯示，W陽(yáng)性重組質(zhì)粒提取的DM 為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)可觀察到明顯的巧光強(qiáng)度變化和很好的陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié) 果，n型豬嗜淋己泡疹病毒有陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn);而豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒、豬藍(lán)耳病病毒、 大腸桿菌、A群豬輪狀病毒陽(yáng)性樣品和本實(shí)驗(yàn)室獲得的化HV-巧日化HV-3的DNA模板巧光強(qiáng) 度沒(méi)有變化，沒(méi)有擴(kuò)增曲線(xiàn)。提示本發(fā)明所建立的實(shí)時(shí)巧光定量PCR體系對(duì)n型豬嗜淋己 泡疹病毒有很好的特異性（圖2)。
[0050] 實(shí)施例5靈敏度實(shí)驗(yàn) 用DEPC處理水分別稀釋n型豬嗜淋己泡疹病毒陽(yáng)性模板，通過(guò)實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢 測(cè)巧光強(qiáng)度變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)可觀察到明顯的巧光強(qiáng)度變化和 很好的陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，實(shí)時(shí)巧光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)顯示，濃度在2.42拷貝AiLW上的反應(yīng) 體系有明顯的巧光增長(zhǎng)，而低于2.42拷貝AiL和陰性對(duì)照均無(wú)巧光增長(zhǎng)，因此該實(shí)時(shí)巧光定 量PCR檢測(cè)體系的最低檢出限為2.42拷貝AiL，即其靈敏度為2.42拷貝AiL(圖3)。
[0051 ] 實(shí)施例6重復(fù)性試驗(yàn) W相同稀釋度的上述PLHV-2陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，10倍梯度稀釋成4個(gè)不同梯度模板，重 復(fù)反應(yīng)。并取質(zhì)粒和陰性血清稀釋液，提取核酸，重復(fù)多孔同步檢測(cè)，考察重復(fù)性。其結(jié)果如 表1所示。 rnnwi 擊i 巧包化市互a a搞
W上為本發(fā)明的其中具體實(shí)現(xiàn)方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為 對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā) 明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)，運(yùn)些顯而易見(jiàn)的替換形式均屬于本發(fā)明的 保護(hù)犯i圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種特異性檢測(cè)Π 型豬嗜淋巴皰疹病毒檢測(cè)用的引物對(duì)，其特征在于，所述上游引 物PLHV-2 D F1的核苷酸序列如SEQ ID Ν0.1所示，下游引物PLHV-2 D R1的核苷酸序列如 SEQIDN0.2**。2. -種與權(quán)利要求1所述引物對(duì)配合使用的熒光探針，其特征在于，探針PLHV-2 D P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒 光淬滅基團(tuán)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM、HEX、JOE、VIC、 NED中的任一種;所述熒光淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ-1、BHQ-2、TAMRA中的任一種。4. 一種權(quán)利要求1所述引物對(duì)在制備Π 型豬嗜淋巴皰疹病毒的檢測(cè)或診斷試劑盒 中的應(yīng)用。5. -種Π 型豬嗜淋巴皰疹病毒的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要 求1所述引物對(duì)和權(quán)利要求2或3所述的熒光探針。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應(yīng)體系為：20yL反應(yīng) 體系的具體配置為DEPC水12.8μL，10XPCR反應(yīng)緩沖液2.0μL，50mM鎂離子1.0μL，10mM dNTPs混合溶液 0·5μL，10μΜ PLHV-2 D F1 0·5μL，10μΜ PLHV-2 D R1 0·5μL，10μΜ PLHV-2 DPI 0.5yL，5 u 的 Taq 酶 0.2yL，待測(cè)樣品 DNA 模板 2.0yL。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的熒光定量PCR擴(kuò)增條件 為：95°C，3min ;95°C，10s ;60°C，15s;72°C，40s，共做40 個(gè)循環(huán)，然后終止。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK106048084SQ201610372743
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】周宇, 朱事康, 佟鐵鑄, 李春萍, 劉星, 于飛, 呂飛, 鄒冬輝, 陳燕忠, 羅卓軍
【申請(qǐng)人】惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心