用于檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的nasba擴(kuò)增引物、試劑盒和檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增引物、試劑盒和檢測(cè)方法，其上游引物、下游引物的序列分別為 SEQ ID NO:1～2，試劑盒包括NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液A和NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液B；檢測(cè)方法包括：1）樣品RNA的提取；2）進(jìn)行啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增和3）電泳檢測(cè)。本發(fā)明適用于對(duì)啤酒花矮化類病毒進(jìn)行快速檢測(cè)確證，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境中的疫情監(jiān)控及進(jìn)出口貿(mào)易中該類病毒的監(jiān)測(cè)及檢測(cè)，操作極為簡便，所需樣品量小且對(duì)于模板RNA的質(zhì)量要求較低。
【專利說明】用于檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增引物、試劑盒和檢測(cè)方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增引物，試劑盒和檢測(cè)方法，屬于植物病原的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】:
類病毒是迄今已知的引起植物病害的最小致病因子，為環(huán)狀RNA分子，其全長基因組由246?399個(gè)核苷酸組成，能引起許多經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)生嚴(yán)重病害。根據(jù)其序列和結(jié)構(gòu)的同源性、復(fù)制特性分為2個(gè)組，分別為馬鈴薯紡錘塊莖類病毒組(PSTVd)和鱷梨日斑類病毒組(ASBVd)。啤酒花矮化類病毒(Hop stunt vroid)屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科啤酒花矮化類病毒屬，通常含307個(gè)左右核苷酸。1970年，日本的Yamamoto等人首次在矮化的啤酒花上發(fā)現(xiàn)了啤酒花矮化類病毒。1985年，日本的Sano首次在葡萄上發(fā)現(xiàn)了 HSVd，經(jīng)過15年的研究，認(rèn)為HSVd的初侵染源為葡萄，在進(jìn)化過程中逐漸適應(yīng)了新的寄主。目前國內(nèi)外已報(bào)道的HSVd寄主包括黃瓜、葡萄、桃、李、扁桃、杏等草本及木本植物。中國已經(jīng)在啤酒花、桃、李、杏、葡萄、扁桃等植物上報(bào)道了 HSVd。因此，規(guī)范啤酒花矮化類病毒的檢測(cè)鑒定方法一般操作規(guī)程，對(duì)于提高啤酒花矮化類病毒的檢疫檢驗(yàn)效率、防止啤酒花矮化類病毒的傳入、傳出，保護(hù)我國農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)，促進(jìn)我國農(nóng)產(chǎn)品的順利出口，具有十分重要的意義。植物類病毒由于不顯性侵染比較普遍，癥狀表現(xiàn)受環(huán)境溫度的影響較大，而且?guī)追N鑒別植物對(duì)不同類病毒的反應(yīng)癥狀相似，故難于應(yīng)用生物測(cè)定的方法。由于類病毒不能產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)，所以也不能使用檢測(cè)病毒的電鏡、血清學(xué)方法。因此，選用分子生物學(xué)方法對(duì)啤酒花矮化類病毒進(jìn)行檢測(cè)。
[0003]NASBA (Nuleic and sequence based amplipicain, NASBA)即“核酸序列依賴性擴(kuò)增”檢測(cè)技術(shù)是一種經(jīng)典的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，適用于單鏈核糖核酸RNA —步擴(kuò)增及檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)植物病原的檢測(cè)與診斷。NASBA是由一對(duì)引物引導(dǎo)的，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH,反轉(zhuǎn)錄酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各種反應(yīng)緩沖液所組成的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，通過連續(xù)均一的體外特異性酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)核苷酸序列的等溫?cái)U(kuò)增。
[0004]由于細(xì)胞壁中富含大量的多糖、酚類物質(zhì)，植物病毒RNA的提取存在著穩(wěn)定性差、重復(fù)性低、效率低等問題，加之在提取過程中RNA本身的自降解現(xiàn)象，病毒RNA的含量往往較低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性提出了較高要求。同時(shí)由于多糖等物質(zhì)對(duì)于Taq聚合酶的抑制作用，限制了 RT-PCR技術(shù)在葡萄、草莓、糧谷類等多酚含量較高的植物病毒RNA檢測(cè)中的應(yīng)用。由于NASBA技術(shù)的反轉(zhuǎn)錄過程被直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，因此NASBA具備了適合于病原RNA的擴(kuò)增、檢測(cè)的特點(diǎn)，最適合各種RNA樣品的分析，符合植物病毒檢疫的要求，鑒于啤酒花矮化類病毒危害的嚴(yán)重性，加強(qiáng)環(huán)境中的的監(jiān)控，提高檢測(cè)效率和確證的準(zhǔn)確度，對(duì)有效控制啤酒花矮化類病毒的傳播，在現(xiàn)階段具有重要的實(shí)際意義。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增引物，同時(shí)提供一種檢測(cè)的試劑盒和檢測(cè)方法。其主要原理是利用一對(duì)引物引導(dǎo)，在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH,反轉(zhuǎn)錄酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各種反應(yīng)緩沖液所組成的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，通過連續(xù)均一的體外特異性酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)核苷酸序列的等溫?cái)U(kuò)增NASBA，經(jīng)過循環(huán)反復(fù)，使RNA不斷擴(kuò)增，對(duì)樣品中的啤酒花矮化類病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)，首先依據(jù)啤酒花矮化類病毒全基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，再提取待測(cè)樣品的核糖核酸(RNA)，然后分別以特異性引物進(jìn)行NASBA擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)NASBA擴(kuò)增結(jié)果來判定樣品中是否含有啤酒花矮化類病毒。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明用于檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA引物，其引物序列分別為SEQ ID NO:1?2。
[0008]SEQ ID NO:1:NA_P1:5，-aattctaatacgactcactatagggagGAATCCAGCGAGAGGCGTG-3，。
[0009]SEQ ID NO:2:NA_P2:5， -aattctaatacgactcactatagggagAGTACCTCCCTGCCTTGTTTT-3，。
[0010]檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增試劑盒，包括如下組分:
(I)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液A的制備:
每25 μ L包括 10XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L, 10 mmol /L dNTPs
1.5 μ L, 10 μ mo I /L 引物 ΝΑ-Ρ1、ΝΑ-Ρ2 各 0.5 μ L,.雙蒸水 9 μ L。
[0011]其中緩沖液為含40mmol /L PH8.5 Tris-HCL, 70 mmol /LKCL, 12 mmol /L MgCL2,5 mmol /L DTT 緩沖液。
[0012](2) NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液B的制備:
0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫蘇糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制劑，
(3)NASBA擴(kuò)增程序:
將待檢樣品RNA 3 μ L加入14 μ L反應(yīng)液Α，在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min,立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min,迅速加入4 μ L反應(yīng)液B, 41 °C溫育2 h,4 °C終止反應(yīng)；
(4)NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定
反應(yīng)產(chǎn)物用5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并進(jìn)行判定。
[0013]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種采用SEQ NO: 1、SEQ NQ:2特異性擴(kuò)增引物檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA的方法，包括下列步驟:
I)樣品RNA的提取
A、取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。
[0014]B、取上清，15°C~30°C，放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩，勿渦旋振蕩，15s。15°C ~3(TC，放置 2min~3min ;2°C ~8°C，12000 g，離心 15min。
[0015]C、小心吸取為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C ~30°C，放置 lOmin。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。
[0016]D、去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；2°C ~8°C,7500 g，離心5min。
[0017]E、去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30 μ L -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0018]2)進(jìn)行啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增
A.在裝有14μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min,；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h;
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
3)電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。如果擴(kuò)增片段為262 bp，說明待檢病毒是啤酒花矮化類病毒，如果沒有出現(xiàn)262 bp擴(kuò)增片段，則說明待檢病毒不是啤酒花矮化類病毒。
[0019]本發(fā)明根據(jù)啤酒花矮化類病毒的序列高度保守區(qū)的設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性內(nèi)引物，該保守基因序列為具有啤酒花矮化類病毒的不同株系所共有，以保證從株系的水平上檢測(cè)不同來源的啤酒花矮化類病毒的可靠性。本發(fā)明適用于對(duì)啤酒花矮化類病毒進(jìn)行快速檢測(cè)確證，可廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和環(huán)境中的病害監(jiān)控、進(jìn)出口貿(mào)易中該病毒的確證。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括:
第一，便捷性。該發(fā)明在進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增時(shí)，不需要昂貴的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，整個(gè)過程始終在42 °C進(jìn)行，無需熱循環(huán)儀，僅I個(gè)普通的恒溫水浴鍋就可完成。
[0021]第二，精確度高。該發(fā)明酶循環(huán)反應(yīng)的循環(huán)數(shù)少，不需高溫變性步驟，相對(duì)于RT-PCR錯(cuò)配率較低，更適于檢測(cè)和定量特異RNA。
[0022]第三，靈敏度高。該發(fā)明比起PCR技術(shù)，能用較少的循環(huán)便擴(kuò)增出大量的目的基因，保證了檢測(cè)的高敏感性。
[0023]第四，縮短周期。由于反轉(zhuǎn)錄過程被直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)中，PCR大約需要20輪循環(huán)才能擴(kuò)增16倍，而NASBA只需循環(huán)4~5輪即可達(dá)到10 6倍。
[0024]第五，降低了對(duì)植物RNA模板的質(zhì)量要求。由于細(xì)胞壁中富含大量的多糖、酚類物質(zhì)，植物病毒RNA的提取存在著穩(wěn)定性差、重復(fù)性低、效率低等問題，加之在提取過程中RNA本身的自降解現(xiàn)象，病毒RNA的含量往往較低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性提出了較高要求。由于該發(fā)明針對(duì)的模板是RNA，反應(yīng)的產(chǎn)物也是RNA，反應(yīng)的結(jié)果不受環(huán)境中DNA的影響。即使存在外來的雙鏈DNA污染，但由于其不具備T7啟動(dòng)子序列，不可能被擴(kuò)增，其次，該反應(yīng)只在42 1:恒溫條件下進(jìn)行，不需高溫變性步驟，所以NASBA反應(yīng)流程不會(huì)受到外來雙鏈DNA的污染，因此對(duì)于模板純度和質(zhì)量要求較低。
[0025]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明對(duì)病株樣品中NASBA擴(kuò)增圖譜:其中M:ssRNA Ladder marker ；1:健康葡萄；2:啤酒花矮化類病毒感病材料。
[0026]圖2為本發(fā)明特異性結(jié)果圖:其中M:ssRNA Ladder marker ；1:啤酒花矮化類病毒；2:蘋果銹果類病毒；3:梨泡狀潰瘍類病毒；4:桃潛隱花葉病毒；5:蘋果莖痘病毒；6:葡萄黃斑類病毒-2。
[0027]圖3為本發(fā)明敏感性結(jié)果圖:其中M: ssRNA Ladder marker ； 1-7: 1X10'
IX 10' I X 10' I X 10' I X 10' I X 1-6、I X I。-7 ng/ μ L，啤酒花矮化類病毒感病材料總 RNA。
[0028]圖4為本發(fā)明的樣品檢測(cè)結(jié)果圖。其中M: ssRNA Ladder marker ;1~24:其中1-6:進(jìn)境法國葡萄苗(S1~S6) ；7~12:南水梨(S7~S12) ； 13-18:意大利葡萄苗(S13~S18)；19-24:豐水梨(S19~S24)。
[0029]【具體實(shí)施方式】:
為了更充分地解釋本發(fā)明的實(shí)施方法，提供了用于檢測(cè)啤酒花矮化類病毒NASBA試劑盒的實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋，而不是限制本發(fā)明的范圍。其中反轉(zhuǎn)錄聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP 均購于 NEWENGLAND B1LAB公司；PCR擴(kuò)增試劑、DNA marker及等均購于北京天根公司。
[0030]實(shí)施例1:1材料
1.1病毒
啤酒花矮化類病毒為進(jìn)境法國葡萄砧木苗分離物、意大利進(jìn)境葡萄苗分離物、新疆葡萄苗和啤酒花分離物,蘋果銹果類病毒(Apple scar skid viroid, ASSVd)、梨泡狀潰瘍類病毒(/fear Blister Canker Viroid, PBCVd)、桃潛隱嵌紋類病毒{Peach latent mosaicriroit/, PLMVd)、蘋果莖痘病毒stem pittingASPV)、葡萄黃斑類病毒-2
(Grapevine yellow speckle viroid, GYSVd-2)由 申請(qǐng)人:的實(shí)驗(yàn)室保存。
[0031]1.2 試劑
反轉(zhuǎn)錄聚合酶 AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker>rNTP均購于NEW ENGLAND B1LAB公司；PCR擴(kuò)增試劑、DNA marker及等均購于北京天根公司；
1.3引物
根據(jù)NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中啤酒花矮化類病毒的基因全長序列(登錄號(hào)HM357802.1)，在保證擴(kuò)增的兼并性和通用性的前提下通過比較分析啤酒花矮化類病毒高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)5’端帶有T7啟動(dòng)子序列NASBA反應(yīng)引物(ΝΑ-P1、NA-P2)，設(shè)計(jì)完成后將引物在數(shù)據(jù)庫的Primer-Blast模塊下進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。
[0032]2 方法
2.1病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；21:~81:，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0033]2.2 NASBA 擴(kuò)增體系 A.在裝有14μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min,；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h;
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
2.3電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。預(yù)期產(chǎn)物大小為262 bp。見圖1。
[0034]實(shí)施例2:特異性實(shí)驗(yàn)
1、提取啤酒花矮化類病毒、蘋果銹果類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋果莖痘病毒、葡萄黃斑類病毒-2的RNA，使用NASBA方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0035]2、病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；21:~81:，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0036]3、擴(kuò)增反應(yīng)
Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min,；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h;
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
4、NASBA產(chǎn)物電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。電泳結(jié)果顯示，使用NASBA方法進(jìn)行檢測(cè)啤酒花矮化類病毒、蘋果銹果類病毒、梨泡狀潰瘍類病毒、桃潛隱花葉病毒、蘋果莖痘病毒、葡萄黃斑類病毒-2的RNA，只有啤酒花矮化類病毒得到預(yù)期262 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖2)。
[0037]實(shí)施例3敏感性實(shí)驗(yàn)
1、用DEPC水將啤酒花矮化類病毒病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀釋，依次為1X10°、ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ—^ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ—'ΙΧΙΟ—6、1Χ10_7、1Χ10_8 μ g/μ L,各取2 μ L為模板分別進(jìn)行NASBA擴(kuò)增反應(yīng)。
[0038]2、病毒RNA的提取取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；2V ~8°C, 12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；21:~81:，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0039]3、擴(kuò)增反應(yīng)
Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min,；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h;
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
4、NASBA產(chǎn)物電泳檢測(cè)
取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。NASBA產(chǎn)物鑒定:電泳結(jié)果顯示，啤酒花矮化類病毒使用NASBA方法能夠得到10_7稀釋倍數(shù)的模板(見圖3)。
[0040]實(shí)施例4實(shí)際樣品檢測(cè)及對(duì)比實(shí)驗(yàn)
將從山東、新疆等地田間采集(2012至2014)的具有典型HSVd類癥狀的病樣及實(shí)驗(yàn)室留樣(進(jìn)境法國(2013、2014)、意大利葡萄苗(2014)等)，分別采用NASBA、RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的效果，以進(jìn)一步評(píng)估LAMP方法的可靠性。
[0041 ] 1、實(shí)際樣品NASBA檢測(cè)I)病毒RNA的提取
取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g,離心 lOmin。取上清，15 °C ~30 °C,放置5min ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C ~30°C，放置2min~3min ；
2V ~8°C, 12000 g，離心15min。小心吸取約為600 μ?的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加 500 “1^異丙醇混合上清液，151:~301:，放置101^11。2°C ~8°C, 12000 g，離心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入I mL 75%乙醇，洗滌；21:~81:，7500 g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 UL -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0042]2)擴(kuò)增反應(yīng)
Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA，
B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min ；
C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B;
D.于41°C溫育2h;
E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出；
3) NASBA產(chǎn)物鑒定紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄，電泳結(jié)果顯示，在10份樣品中9份樣品為陽性，其他樣品為陰性(見圖4)。
[0043]2、PCR 擴(kuò)增
I)方法:普通RT-PCR反應(yīng)條件為50 °C反轉(zhuǎn)錄30 min ；94 °C預(yù)變性2 min; 94 V 30s，53 °C 30 s，72 °C 30 s，循環(huán)反應(yīng) 35 次；65 °C延伸 10 min。
[0044]2)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果:在10份樣品中，9份為陽性，其余為I份。
[0045]結(jié)論:利用上述NASBA和PCR方法同時(shí)檢測(cè)實(shí)際樣品，兩種方法的符合率100%，但NASBA對(duì)設(shè)備要求更低，便捷性更高。
[0046]目前，啤酒花矮化類病毒是我國較為普遍、危害最為嚴(yán)重的類病毒病，引起的病害往往與其他病毒病易混淆。本發(fā)明的應(yīng)用將有助于在諸多形態(tài)相近的病原癥狀中實(shí)現(xiàn)啤酒花矮化類病毒的快速鑒別。本發(fā)明可應(yīng)用于幼苗的培育過程中，通過對(duì)病毒的快速高效檢測(cè)，可以確保脫毒幼苗的質(zhì)量和增產(chǎn)效果。本發(fā)明可對(duì)啤酒花矮化類病毒進(jìn)行特異性鑒定，可應(yīng)用于梨、桃、李種苗的進(jìn)出口檢疫、國內(nèi)地區(qū)間調(diào)運(yùn)以及病害調(diào)查等過程中。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增引物，其上游引物、下游引物的序列分別為SEQID NO:1 ?2。
2.一種檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA擴(kuò)增試劑盒，包括如下組分: (1)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液A:
每25 μ L包括 1XAMV buffer 2.5 μ 1,6.25mmol /L NTPs 3 μ L, 10 mmol /L dNTPs1.5 μ L, 10 μ mo I /L 引物 ΝΑ-Ρ1、ΝΑ-Ρ2 各 0.5 μ L，雙蒸水 9 Ml; 其中緩沖液為含 40 mmol /L PH8.5 Tris-HCL, 70 mmol /LKCL, 12 mmol /L MgCL2，5mmol /L DTT 緩沖液； (2)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)液B: 0.5 U RNaseH, 32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，2 μ L DMS0，0.1 μ LI mo I/L 二硫蘇糖醇，0.25 μ L 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制劑。
3.一種檢測(cè)啤酒花矮化類病毒的NASBA方法，包括下列步驟: 1)樣品RNA的提取 A、取0.1 g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5 mL離心管中，加入I mLTrizol Reagent,顛倒混勻，2°C ~8°C, 12000 g，離心 1min ； B、取上清，15°C ~ 3 (TC，放置5 m i η ;加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩，不要渦旋振蕩，15s ；15°C ~3(TC，放置 2min~3min ；2°C ~8°C, 12000 g，離心 15min ； C、吸取600PL的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相；加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C ~3(TC，放置 1min ；2°C ~8°C, 12000 g，離心 1min ； D、去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗滌;2V ~8°C, 7500 g，離心5min ； E、去除上清液,沉淀自然干燥后,將其溶于30μ L -50 μ L無RNase的水中，即為待檢模板RNA ； 2)進(jìn)行HSVd的NASBA擴(kuò)增 Α、在裝有14 μ L環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ L待檢模板RNA， B.在DNA擴(kuò)增儀或水浴鍋上65°C溫浴5min，立即轉(zhuǎn)入41°C溫浴5 min ； C.在反應(yīng)管中迅速加入4μ L反應(yīng)液B; D.于41°C溫育2h; E.將金屬浴調(diào)到4°C中止反應(yīng)，3 min后取出； 3)電泳檢測(cè) 取3 g瓊脂糖，于100 mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 mg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3 mL?6 mLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9 V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450973SQ201410832857
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】吳興海, 張成標(biāo), 魏曉棠, 甘琴華, 張京宣, 邵秀玲, 歷艷, 尼秀媚 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心