專利名稱：eIF3a突變基因及其檢測(cè)引物、試劑盒、檢測(cè)方法、pcβa-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及eIF3a突變基因及其擴(kuò)增引物、試劑盒、擴(kuò)增方法、pc β a-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒和該質(zhì)粒的制備方法。
背景技術(shù)：
真核生物翻譯調(diào)控主要發(fā)生在起始階段，也是翻譯的限速階段。這一過(guò)程有10個(gè)以上的翻譯起始因子(eukaryotic initiation factors, eIFs)參與。eIF3是翻譯起始因子中最大，最復(fù)雜的一個(gè)，它由13個(gè)亞基組成，分別命名為eIF3a到eIF3m，它參與翻譯起始的所有步驟。首先，參與80S核糖體解離，eIF3可以與40S核糖體亞基結(jié)合并形成復(fù)合物，從而使其保持解離狀態(tài)不與60S亞基聚合。第二，eIF3參與了 43S翻譯起始前復(fù)合物的形成，它與40S亞基結(jié)合后，協(xié)助招募GTP-eIF2-tRNA-methionine三聚復(fù)合物。第三，eIF3幫助mRNA與43S翻譯起始前復(fù)合物結(jié)合。此外,它也參與了翻譯起始復(fù)合物對(duì)起始密碼子的識(shí)別和通過(guò)與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site, IRES)結(jié)合參與帽狀結(jié)構(gòu)非依 賴性翻譯起始過(guò)程。eIF3a是eIF3最大的亞基，我們前期的研究表明它可以調(diào)控一些蛋白的合成，包括a-tubulin、核苷酸還原酶M2 (Ribonucleotide ReductaseM2, RRM2)和p27等。我們已有的研究證明了 eIF3a可以調(diào)控一些NER途徑的蛋白翻譯。我們前期的研究中測(cè)序篩查到新的SNPs:eIF3a 1458C>T,它位于10號(hào)外顯子(Arg438Cys)，導(dǎo)致了有功能意義的突變。我們?cè)谇捌诘难芯勘砻?，eIF3a可以調(diào)控某些細(xì)胞周期和增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)。我們?cè)噲D探討eIF3a 1458C>T基因突變后是否能通過(guò)調(diào)控eIF3a的表達(dá)而影響其下游基因的表達(dá)。因此需要構(gòu)建eIF3a 1458C>T突變型eIF3a真核表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供eIF3a突變基因及其擴(kuò)增引物、試劑盒、擴(kuò)增方法、pc β a-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒和該質(zhì)粒的制備方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種eIF3突變基因,其序列如SEQ ID N0.1所示?！N擴(kuò)增上述突變基因的試劑盒，所述試劑盒包括如下引物:前引物:5’-CTGTACCATGATATTGCCCAGCAAG-3’ (SEQ ID N0.2)；后引物:5，-TCTTTACGCTGCCTTTTCCGT-3，(SEQID N0.3)。試劑盒中其他試劑為常規(guī)PCR擴(kuò)增試劑，測(cè)序試劑。一種擴(kuò)增上述突變基因的方法:從質(zhì)粒pci3a_eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出突變基因并測(cè)序，pc β a_eIF3a基因序列如SEQ ID N0.7所示；擴(kuò)增體系為:5XPrimer starBuffer 20 μ L，dNTP mix 8 μ L，前引物 2 μ L，后引物 2 μ L，cDNA 2 μ L, Primer STAR I μ L,加ddH20 65 μ L至終體積100 μ L ;擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min，98°C 10s，58。。退火15s，72°C 2min共30個(gè)循環(huán)，72°C總延伸IOmin ;所述前引物和后引物分別如SEQ ID N0.2和SEQID N0.3 所示。一種pC0 a-eIF3a_Arg438Cys突變型質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包括eIF3突變基因，所述質(zhì)粒的核酸序列如SEQ ID N0.4所示。一種制備pc β a-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒的方法,包括如下步驟:(I)從質(zhì)粒pc β a-eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段Arg438Cys, pc β a_eIF3a基因序列如SEQ ID N0.7所示；擴(kuò)增引物為:前引物:5’-CTGTACCATGATATTGCCCAGCAAG-3’ (SEQ ID N0.2)；后引物:5，-TCTTTACGCTGCCTTTTCCGT-3，(SEQID N0.3)；擴(kuò)增體系為:5XPrimerstar Buffer 20 μ L, dNTP mix 8 μ L，前弓丨物 2 μ L，后弓I物 2 μ L，CDNA2 μ L, Primer STARl μ L,加 ddH20 65 μ L 至終體積 100 μ L ;擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min，98°C 10s，58°C退火 15s，72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ；(2)將步驟(I)的擴(kuò)增的Arg438Cys用乙醇沉淀,然后在Arg438Cys末端加A尾；(3)采用切膠法回收經(jīng)步驟(2)處理的Arg438Cys ；(4)將Arg438Cys與pGEM_T easy載體連接后轉(zhuǎn)化至BL21高效率感受態(tài)細(xì)胞，于LB/氨芐平板上37°C過(guò)夜培養(yǎng)，再挑單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，然后用ApaI酶切驗(yàn)證連接質(zhì)粒;(5)定點(diǎn)誘變構(gòu)建pGEM-T easy_Arg438Cys突變型載體:PCR 擴(kuò)增體系:10* reaction buffer 5 μ L, pGEMM-T easy-Arg438Cys lug，前引物 5，-AACAACACCATCCTCTGCCTTCTGCAGCAGG-3’ (SEQ ID N0.5) 1.4 μ L，后引物 5，-CCTGCTGCAGAAGGCAGAGGATGGTGTTGTT-3’ (SEQ ID N0.6) 1.3 μ L,dNTP mixlμ L，Quik Solutionreagent 1.5 μ L, ddH20 力口至 50 μ L,最后力口 IyL Quik change Enzyme ；熱循環(huán):95°C2 min，95°C 20s,60°C 10s，68°C 2.5min 共 18 個(gè)循環(huán)，最后 68°C延伸 5min ；將PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn I消化后轉(zhuǎn)化至XLlO-Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/氨芐平板，37°C下培養(yǎng)后挑單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即為pGEM-T easy-Arg438Cys突變型載體；(6)分別將 pGEM-T easy_Arg438Cys 突變型載體和 pc β a_eIF3a 進(jìn)行 MluI和BspDI雙酶切，將pc β a-eIF3a雙酶切后不含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段與pGEM_Teasy-Arg438Cys酶切后含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物用DH5 α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂LB/氨芐平板篩選，挑單克隆LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得pc β a_eIF3a_Arg438Cys 突變型質(zhì)粒。本發(fā)明采用pci3a空載體成功構(gòu)建了 eIF3a 1458C>T突變型eIF3a真核表達(dá)載體。


圖1為含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖，泳道I和2均為PCR擴(kuò)增片段；圖2為pGEM-T easy與Arg438Cys片段連接后ApaI單酶切驗(yàn)證圖；圖3為pGEM-T easy_Arg438Cys定點(diǎn)誘變后測(cè)序結(jié)果與原pGEM_Teasy-Arg438Cys序列比較圖；圖4 為 pGEM-T easy_Arg438Cys 突變型載體和 pc β a_eIF3a 進(jìn)行 MluI 和 BspDI雙酶切電泳圖；圖5為pc β a_eIF3a_Arg438Cys突變載體序列與原pc β a_eIF3a質(zhì)粒序列比對(duì)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1I含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段的擴(kuò)增1.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)從pc β a-eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段。引物序列:前引物:5，-CTGTACCATGATATTGCCCAGCAAG-3’(SEQ ID N0.2)后引物:5，-TCTTTAC GCTGCCTTTTCCGT-3，(SEQID N0.3)擴(kuò)增長(zhǎng)度:1883bpPCR 擴(kuò)增體系:5XPrimer star Buffer (Mg2+ plus) 20 μ L, dNTP mix8yL,前引物(10 μ M) 2 μ L，后引物(10 μ Μ) 2 μ L, cDNA (Ing) 2 μ L, Primer STARl μ L,加 ddH2065 μ L 至終體積100 μ L ；擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性5min，98°C 10s，58°C退火 15s，72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)，72 V總延伸IOmin。瓊脂糖凝膠電泳分析:取擴(kuò)增產(chǎn)物3 μ L，加上樣緩沖液Loading Buffer lyL，混勻后加于1%瓊脂糖凝膠(100V)電泳30-40分鐘，紫外燈下觀察結(jié)果并攝相(見(jiàn)圖1)。1.2.乙醇沉淀在100 μ L PCR產(chǎn)物中加10 μ L醋酸鈉(3Μ pH 5.2)和300 μ L乙醇混合后，_20°C過(guò)夜,13000rpm離心IOmin,以70%乙醇400 μ L清洗，13000rpm離心7min,重復(fù)用70%乙醇清洗兩次(共清洗3次)，風(fēng)干I 2h。加適量滅菌水溶解DNA。1.3、加 A 尾體系:10X Taq buffer 10 μ L, IOmM dATP 2 μ L，Taq 酶 2 μ L，PCR 產(chǎn)物 86 μ L 共100 μ L，72。C 孵育 20min。1.4、PCR 產(chǎn)物回收(I)瓊脂糖凝膠電泳:將擴(kuò)增產(chǎn)物100 μ L，加上樣緩沖液Loading Buffer20 μ L，混勻后加于1%瓊脂糖凝膠(100V)電泳40分鐘；(2)紫外燈下切出含目的DNA的凝膠，吸干表面液體，稱量膠塊重量；(3)向膠塊中加3倍體積的膠塊融化液Buffer GM融膠，室溫融化膠塊，間斷振蕩混合，使膠充分融化；(4)將溶液移入 spin column 中，以 12000rpm離心 lmin,棄濾液,將 700 μ L BufferWB 加入 spin column 中，12000rpm 離心 30s ；(5)重復(fù)步驟⑷2次；(6)將 spin column 置于新的 1.5mT,FP 管中 12000rpm 離心 lmin,靜置 2min。(7)力口 50 μ LElution buffer (60°C )溶解 DNA, 12000rpm 離心 lmin 收集 DNA 溶液。并測(cè) PCR 產(chǎn)物濃度。2、將1458C>T擴(kuò)增片段與pGEM_T easy載體進(jìn)行連接2.1連接反應(yīng)連接體系:T4 DNA連接酶的2 X快速連接緩沖液5 μ 1，pGEM-T Easy載體(50ng/μ 1)1μ 1，PCR產(chǎn)物2μ 1，Τ4 DNA連接酶1μ 1，去離子水1μ 1，4°C連接16小時(shí)。2.2 轉(zhuǎn)化(I)每個(gè)連接反應(yīng)準(zhǔn)備I個(gè)LB/氨芐平板，涂板前將平板平衡至室溫。(2)將凍存的BL21高效率感受態(tài)細(xì)胞從一 80°C冰箱中取出，放置在冰浴直至融化(大概5分鐘)，輕輕振動(dòng)離心管使之混勻。(3)向步驟2準(zhǔn)備的感受態(tài)細(xì)胞中加入連接反應(yīng)產(chǎn)物。 (4)輕輕振動(dòng)小管混勻，冰浴30分鐘。(5)在精確的42 ° C水浴中熱擊90秒(不要振動(dòng))。(6)迅速將管子移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3分鐘。(7)在連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中加入平衡至室溫的950 μ I LB培養(yǎng)基。(8)在 37°C振蕩培養(yǎng)(220rpm) I 小時(shí)。(9)將細(xì)胞用IOOOOxg離心20秒將上清液倒掉，留200 μ I殘夜重懸細(xì)胞，并涂到
LB/氨節(jié)平板上。(10)將平板于37°C過(guò)夜培養(yǎng)(12 — 16小時(shí))。2.3質(zhì)粒提取(I)在LB/氨節(jié)平板上隨機(jī)挑取單克隆,轉(zhuǎn)入LB/氨節(jié)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)；(2)將菌液在 4° C 中 5450g 離心 IOmin ;棄上清液,加 250 μ L Solution I/RNaseA震蕩重懸；(3)加200yL Solution II,溫和顛倒4 6次至澄清,常溫常壓下孵育5min;(4)加125 μ L預(yù)冷的Buffer N3，混勻顛倒至白色絮狀沉淀，4攝氏度下，12000g離心IOmin.
(5)吸取上清至新的1.5mlEP管中，加0.1體積的ETR Solution至澄清液中，混勻顛倒7 10次,冰浴IOmin,冰浴時(shí)不停顛倒混合。(6) 42°C孵育 5min，室溫 12000g 離心 3min。(7)轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管中，加入0.5倍體積的100%乙醇，混勻后室溫下放置
I 2min ；(8)取 700 μ L 至 HiBind Miniprep Column 柱中，以 IOOOOg 離心 lmin，棄濾液；(9)加 500 μ L Buffer HB,以 IOOOOg 離心 lmin,棄濾液；(10)加700 μ L100%乙醇稀釋的Wash buffer洗吸收柱，以IOOOOg離心lmin,棄濾液；(11)重復(fù)步驟(10)(12) 13000g離心吸收柱2min，確保乙醇已被去除。(13)將吸收柱置于新的 1.5ml 離心管中，加 50 μ LEndotoxin-Free ElutionBufffer, 13000g 離心 lmin。
2.4ApaI酶切驗(yàn)證連接質(zhì)粒酶切體系如表1:表權(quán)利要求
1.一種eIF3突變基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述突變基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物:前引物:5’ -CTGTACCATGATATTGCCCAGCAAG-3’ ； 后引物:5’ -TCTTTACGCTGCCTTTTCCGT-3’。
3.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述突變基因的方法，其特征在于，所述方法為: 從質(zhì)粒ροβ a_eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出突變基因并測(cè)序，pc β a_eIF3a基因序列如 SEQ ID N0.7 所示；擴(kuò)增體系為:5 X Primer star Buffer20 μ L, dNTP mix8yL，前引物2μ L，后引物 2μ L，cDNA2y L，Primer STARl μ L，加 ddH2065 μ L 至終體積 100 μ L ;擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min，98°C 10s，58。。退火 15s，72。。2min 共 30 個(gè)循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ；所述前引物和后引物分別為權(quán)利要求2中所述的前引物和后引物。
4.一種pc β a-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒,其特征在于,所述質(zhì)粒包括權(quán)利要求1所述的突變基因，所述質(zhì)粒的核酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.一種制備權(quán)利要求4所述pc β a-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒的方法,包括如下步驟: (1)從質(zhì)粒pcβ a-eIF3a的全長(zhǎng)cDNA上擴(kuò)增出含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段Arg438Cys ；擴(kuò)增引物為:前引物:5’ -CTGTACCATGATATTGCCCAGCAAG-3’ ；后引物:5’ -TCTTTACGCTGCCTTTTCCGT-3’ ； 擴(kuò)增體系為:5 XPrimer star Buffer20 μ L, dNTP mix8 μ L，前引物 2 μ L，后引物 2 μ L，cDNA2 μ L, Primer STARl μ L,加 ddH2065 μ L 至終體積 100 μ L ;擴(kuò)增條件為:95 °C 預(yù)變性5min，98°C 10s，58°C退火 15s，72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)，72°C總延伸 IOmin ； (2)將步驟(I)的擴(kuò)增的Arg438Cys用乙醇沉淀,然后在Arg438Cys末端加A尾； (3)采用切膠法回收經(jīng)步驟(2)處理的Arg438Cys； (4)將Arg438Cys與pGEM_Teasy載體連接后轉(zhuǎn)化至BL21高效率感受態(tài)細(xì)胞，于LB/氨芐平板上37°C過(guò)夜培養(yǎng)，再挑單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，然后用ApaI酶切驗(yàn)證連接質(zhì)粒； (5)定點(diǎn)誘變構(gòu)建pGEM-Teasy-Arg438Cys突變型載體: PCR 擴(kuò)增體系:10*reaction buffer5 μ L, pGP.MR -T easy_Arg438Cysl U g，前引物5’-AACAACACCATCCTCTGCCTTCTGCAGCAGG-3’ 1.4 μ L，后引物 5’-CCTGCTGCAGAAGGCAGAGGATGGTGTTGTT-3，1.3 μ L, dNTP mixl μ L, QuikSolution reagentl.5 μ L，ddH20 加至 50 μ L，最后加 I μ L Quik change Enzyme ；熱循環(huán):95°C 2min,95°C 20s, 60°C 10s，68°C 2.5min 共 18 個(gè)循環(huán)，最后 68°C延伸 5min ；將PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn I消化后轉(zhuǎn)化至XLlO-Gold超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/氨芐平板，37°C下培養(yǎng)后挑單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即為pGEM-T easy-Arg438Cys突變型載體； (6)分別將pGEM-T easy-Arg438Cys 突變型載體和 pc β a_eIF3a 進(jìn)行 MluI 和 BspDI 雙酶切,將ροβ a-eIF3a雙酶切后不含1458CXT位點(diǎn)的DNA片段與pGEM_T easy_Arg438Cys酶切后含1458C>T位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物用DH5 α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂LB/氨芐平板篩選，挑單克隆LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得pc β a-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了eIF3a突變基因及其擴(kuò)增引物、試劑盒、擴(kuò)增方法、pcβa-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒和該質(zhì)粒的制備方法。我們前期的研究中測(cè)序篩查到新的SNPs:eIF3a1458C>T，它位于10號(hào)外顯子(Arg438Cys)，導(dǎo)致了有功能意義的突變。我們?cè)谇捌诘难芯勘砻?，eIF3a可以調(diào)控某些細(xì)胞周期和增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)。我們?cè)噲D探討eIF3a1458C>T基因突變后是否能通過(guò)調(diào)控eIF3a的表達(dá)而影響其下游基因的表達(dá)。本發(fā)明成功構(gòu)建了eIF3a1458C>T突變型eIF3a真核表達(dá)載體pcβa-eIF3a-Arg438Cys，有利于對(duì)eIF3a1458C>T基因功能的研究。
文檔編號(hào)C12N15/12GK103224937SQ201310063810
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者劉昭前, 王瑛, 郭成賢, 尹繼業(yè), 陳娟 申請(qǐng)人:中南大學(xué)