一管式共用引物法檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明基于LAMP（環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)）技術(shù)的一管式檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型的方法或理論，該方法可以在同一個(gè)核酸檢測(cè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)突變位點(diǎn)的不同突變堿基。LAMP設(shè)計(jì)需要4-6個(gè)引物，通過(guò)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒探針設(shè)計(jì)，對(duì)于同一突變點(diǎn)的不同突變類(lèi)型，只改變覆蓋突變點(diǎn)處的引物，覆蓋其它位點(diǎn)的引物不變?yōu)楣灿靡铮尤肓恳膊蛔儯?，這樣保證了，覆蓋突變點(diǎn)的引物與共用引物之間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只需要驗(yàn)證覆蓋同一突變點(diǎn)不同突變類(lèi)型處的引物之間是否發(fā)生交叉反應(yīng)即可，那么覆蓋此處引物只有一到兩個(gè)堿基不同，也不會(huì)發(fā)生反應(yīng)，這就是本檢測(cè)方式的理論基礎(chǔ)。此方法不僅可以降低成本、提高效率，更重要的是可以極大的提高對(duì)多突變類(lèi)型同時(shí)存在的檢測(cè)靈敏度。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一管式共用引物法檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]一管式共用引物法檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型，此發(fā)明可以應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，結(jié)核桿菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒、腫瘤耐藥等檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermal amplification , LAMP)是2000年開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63 °C左右)保溫30 - 60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程。LAMP是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。
[0004]目前在行業(yè)應(yīng)用最廣范的耐藥檢測(cè)是藥敏實(shí)驗(yàn)和基因芯片技術(shù)，藥敏實(shí)驗(yàn)耗時(shí)太長(zhǎng)，基因芯片雖然能實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)但是制備成本及檢測(cè)費(fèi)用均較昂貴，靈敏度低，不宜大面積推廣。因此急需一種檢測(cè)成本低、靈敏度高切實(shí)可行的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是:提供一種同時(shí)一管式檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:該方法可以在同一個(gè)核酸檢測(cè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)突變位點(diǎn)的不同突變堿基。LAMP設(shè)計(jì)需要4-6個(gè)引物，通過(guò)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒探針設(shè)計(jì)，對(duì)于同一突變點(diǎn)的不同突變類(lèi)型，只改變覆蓋突變點(diǎn)處的引物，覆蓋其它位點(diǎn)的引物不變(加入數(shù)量也不變)，這樣保證了，突變點(diǎn)的引物與其它點(diǎn)位的引物之間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只需要驗(yàn)證覆蓋同一突變點(diǎn)不同突變類(lèi)型處的引物之間是否發(fā)生交叉反應(yīng)即可，那么覆蓋此處這引物只有一到兩個(gè)堿基不同，也不會(huì)發(fā)生反應(yīng)，這就是本檢測(cè)方式的理論基礎(chǔ)。
[0007]實(shí)施例1:
結(jié)核分支桿菌耐 利福平(RFP)藥物核苷酸526點(diǎn)突變有如下幾種情況:
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明基于LAMP(環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè))技術(shù)的一管式檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型的方法或理論，其特征在于:通過(guò)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒探針設(shè)計(jì)，對(duì)于同一突變點(diǎn)的不同突變類(lèi)型，只改變覆蓋突變點(diǎn)處的引物，覆蓋其它位點(diǎn)的引物不變(加入數(shù)量也不變)，這樣保證了，突變點(diǎn)的引物與其它點(diǎn)位的引物之間不發(fā)生交叉反應(yīng)，只需要驗(yàn)證覆蓋同一突變點(diǎn)不同突變類(lèi)型處的引物之間是否發(fā)生交叉反應(yīng)即可，那么覆蓋此處這引物只有一到兩個(gè)堿基不同，也不會(huì)發(fā)生反應(yīng)，這就是本檢測(cè)方式的理論基礎(chǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利I要求我們保護(hù)的是LAMP技術(shù)一管式檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型，是我們首次提出基于LAMP技術(shù)對(duì)不同基因類(lèi)型的檢測(cè)，只要是一管式檢測(cè)不同基因突變類(lèi)型都在我們的保護(hù)范圍。
3.我們同時(shí)保護(hù)也是LAMP技術(shù)一管式檢測(cè)同一突變位點(diǎn)不同突變類(lèi)型的理論和方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述本技術(shù)也可以向檢測(cè)不同突變位點(diǎn)延伸，本技術(shù)是同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)，多個(gè)位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)除覆蓋突變位點(diǎn)的其它引物盡量設(shè)計(jì)共用引物，避免交叉反應(yīng)。
5.此方法主要應(yīng)用于各種突變耐藥基因(如肺結(jié)核、乙肝、艾滋病等)的檢測(cè)，同時(shí)也可用于同一位點(diǎn)是否存在不同有 效基因形式的檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103725769SQ201210390906
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月16日
【發(fā)明者】王德國(guó), 曲海濤, 張文超 申請(qǐng)人:哈爾濱德歌生物科技有限公司