頭孢菌素類抗生素原料物質(zhì)（7-aca）生產(chǎn)用變異酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及頭孢菌素類抗生素（cephalosporin?antibiotics）原料物質(zhì)7-ACA生產(chǎn)用變異酶，尤其涉及一種通過(guò)點(diǎn)突變（Point?mutation）制造頭孢菌素（Cephalosporin）C活性增加的變異頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶（acylase）及利用此制造7-ACA的制造方法。本發(fā)明的變異CPC酰基轉(zhuǎn)移酶（acylase）與野生型CPC?；D(zhuǎn)移酶（acylase）相比，對(duì)CPC基質(zhì)的活性增加5倍至26倍，只通過(guò)1個(gè)階段以CPC直接制造7-ACA的效果尤為顯著。
【專利說(shuō)明】頭孢菌素類抗生素原料物質(zhì)(7-ACA)生產(chǎn)用變異酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及頭孢菌素類抗生素(cephalosporin antibiotics)原料物質(zhì)7-ACA生產(chǎn)用變異酶，尤其涉及一種通過(guò)點(diǎn)突變(Point mutation)制造頭孢菌素(Cephalosporin)C活性增加的變異頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶(acylase)及利用此制造7-ACA的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]頭孢菌素C (Cephalosporin C,下面簡(jiǎn)稱為 “CPC”)是 β -內(nèi)酰胺(β-lactam)類抗生物質(zhì)，由絲狀菌(Filamentous fungus)霉菌(mold)產(chǎn)黃頭抱霉(Acremoniumchrysogenum)等一些微生物生產(chǎn)，對(duì)革蘭氏陰性(Gram negative)細(xì)菌通過(guò)阻礙細(xì)胞壁合成表現(xiàn)出抗生活性，但其程度非常微弱。因此其主要應(yīng)用于制造半合成頭孢菌素類抗生素(sem1-synthetic cephalosporin antibiotics)的原料物質(zhì)。特別是，從CPC去除氨基己二酰側(cè)鏈(D—amino adipoyl side chain)而得到的7_氨基頭孢燒酸(7-aminocephalosporanic acid,下面簡(jiǎn)稱為“7-ACA”)正作為占全球抗生素市場(chǎng)40%以上的大部分頭孢菌素類抗生素(cephalosporin antibiotics)的原料物質(zhì)使用。
[0003]利用CPC制造7-ACA的現(xiàn)有工藝有化學(xué)工藝和酶工藝?；瘜W(xué)工藝的反應(yīng)條件復(fù)雜、環(huán)境處理費(fèi)用高，因此現(xiàn)在大部分企業(yè)都以環(huán)保形酶工藝生產(chǎn)7ACA。
[0004]目前，企業(yè)以商用層面使用的酶工藝通常由兩個(gè)階段構(gòu)成。第I階段中利用D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,下面簡(jiǎn)稱為“DA0”)的酶反應(yīng)，把CPC轉(zhuǎn)化成戍二酸-7-氨基頭抱燒酸(Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid,下面簡(jiǎn)稱為“G1-7-ACA”)，第2階段中通過(guò)G1-7-ACA酰基轉(zhuǎn)移酶(acylase)的酶反應(yīng)，把G1-7ACA轉(zhuǎn)化成7ACA (參考圖1)。
[0005]但第2階段酶工藝的生產(chǎn)收率低。其原因在于第I階段的酶反應(yīng)所生成的過(guò)氧化氫對(duì)基質(zhì)(CPC)、反應(yīng)生成物(G1-7-ACA)及DAO進(jìn)行攻擊。從而有必要開發(fā)一種酶工藝，在第I階段，通過(guò)頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶(Cephalosporin C acylase,下面簡(jiǎn)稱為‘CPC酰基轉(zhuǎn)移酶(acylase)’)，從CPC直接制造7ACA。
[0006]由于CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)不存在于自然界，因此同歸改良存在于自然界的各種G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶(也稱作戊二酰酰胺酶(Glutaryl amidase:GA))制造CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)。G1_7_ACA酰基轉(zhuǎn)移酶(acylase)對(duì)CPC的活性非常弱，需要提高其活性。
[0007]用于第2階段酶工藝的G1-7-ACA?；D(zhuǎn)移酶(acylase)多見于各種土壤微生物，索納韋恩(Sonawane)以如下【表1】的方式把G1-7-ACA分為5個(gè)群組(Sonawane, Crit.Rev.Biotech.26:95-120, 2006)。屬于同一群組內(nèi)的，蛋白質(zhì)大小、氨基酸序列、基質(zhì)特征、反應(yīng)特征等非常相似，但 不同群組的差別比較大。
[0008]【表1】
[0009]Gl-T7-ACA?；D(zhuǎn)移酶(acylase)的分類
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種變異CPC酰基轉(zhuǎn)移酶(acylase)，其特征在于:由序列號(hào)3所示氨基酸序列的α亞基(a-subunit)與序列號(hào)4所示氨基酸序列的β亞基構(gòu)成的野生型CPC(CephalosporinC)?；D(zhuǎn)移酶(acylase)序列中，F(xiàn)58氨基酸被纟顏氨酸(Valine)置換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)，其特征在于: 所述變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)追加包括從由Y153T、F177L及Y153T+F177L構(gòu)成的群中選擇的突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)，其特征在于: 所述變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)追加包括145或V382氨基酸被其他氨基酸置換的突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase),其特征在于: 所述突變中，145被蛋氨酸(Methionine)、繳氨酸Valine)、丙氨酸(Alanine)、半胱氨酸(Cysteine)、亮氨酸(Leucine)中的某一種氨基酸置換，V382被亮氨酸(Leucine)或異亮氨酸(Isoleucine)置換。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase),其特征在于: 所述變異CPC?；?轉(zhuǎn)移酶(acylase)由序列號(hào)6所示氨基酸序列的α亞基(a -subunit)與序列號(hào)7所示氨基酸序列的β亞基構(gòu)成。
6.一種基因，其特征在于:對(duì)從權(quán)利要求1至5中選擇的某一項(xiàng)變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)進(jìn)行加密。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因，其特征在于: 所述基因以序列號(hào)5所不喊基序列表不。
8.一種重組表達(dá)載體(expression vector),其特征在于: 包括第6項(xiàng)基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述重組表達(dá)載體(expressionvector),其特征在于: 包括第7項(xiàng)基因。
10.一種宿主細(xì)胞，其特征在于: 通過(guò)第8項(xiàng)的表達(dá)載體(expression vector)被形質(zhì)轉(zhuǎn)換(transformation)。
11.一種微生物,其特征在于: 通過(guò)第8項(xiàng)的表達(dá)載體(expression vector)被形質(zhì)轉(zhuǎn)換(transformation)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微生物，其特征在于: 所述微生物是通過(guò)第9項(xiàng)的重組表達(dá)載體(expression vector)被形質(zhì)轉(zhuǎn)換(transformation)的大腸埃希氏菌(Escherichia coli ) MC1061/pBC-PM2 (登記號(hào):KCTC12344BP)。
13.一種 7-ACA (7-Aminocephalosporanic acid)制造用合成物，其特征在于: 包括從第I項(xiàng)至第5項(xiàng)中選擇的某一項(xiàng)所述變異CPC酰基轉(zhuǎn)移酶(acylase)。
14.一種制造如下化學(xué)式2的方法，其特征在于: 讓從第I項(xiàng)至第5項(xiàng)中選擇的某一項(xiàng)所述變異CPC?；D(zhuǎn)移酶(acylase)與如下化學(xué)式I的化合物或其鹽反應(yīng)，進(jìn)行制造。 化學(xué)式I
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103937764SQ201310049908
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月21日
【發(fā)明者】慎鏞喆, 樸哲, 王垠善, 鄭景化 申請(qǐng)人:愛美科生物株式公司