用離子液體增強生物材料的核酸擴增效率和靈敏度的方法
【專利摘要】本發(fā)明是用離子液體增強生物材料的核酸擴增效率和靈敏度的方法。用于核酸擴增的方法和裝置、遏制核酸擴增抑制物的組合物和試劑盒，以及核酸擴增抑制物的遏制劑?？墒褂盟鼈儊砀哽`敏度地檢測目標微生物、細胞或基因，和用于精確的分子診斷。
【專利說明】用離子液體增強生物材料的核酸擴增效率和靈敏度的方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年7月26日向韓國知識產(chǎn)權(quán)局提交的韓國專利申請.10-2012-0081967號的權(quán)益，該申請通過引用而全文并入作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本申請涉及用于核酸擴增的方法、遏制核酸擴增抑制物的組合物和試劑盒，以及核酸擴增抑制物的遏制劑。
【背景技術(shù)】
[0004]核酸擴增用于快速、準確地診斷生物材料的傳染性疾病，并因此其重要性日益增大。然而，診斷性核酸擴增方法受以下因素影響:細胞裂解活動的干擾，復(fù)雜生物材料中各種核酸擴增抑制物對聚合酶和DNA穩(wěn)定性的影響。因此，對于核酸擴增的分子診斷方法而言，期望有除去各種復(fù)雜生物材料中存在的核酸擴增抑制物的方法，以助于更準確和精確的診斷。
[0005]對于分子診斷而言，可使用多種生物物質(zhì)，如粘液、血液、糞便和肉。在糞便的情況中，難以實施精確的分子診斷，因為不但樣本差異很大，而且還存在血紅素、膽紅素、膽鹽及多種復(fù)雜多糖。已進行了除去糞便樣本中存在的多種核酸擴增抑制物的研究。
[0006]根據(jù)處理的順序，可將除去核酸擴增抑制物的方法分為兩條路線。一條路線是在樣品制備的預(yù)處理期間除去核酸擴增抑制物。然而，該方法是有瑕疵的，因為其不但復(fù)雜，而且也受到反應(yīng)、結(jié)合及洗脫緩沖液的嚴重影響，且其不能防止在大多數(shù)核酸擴增抑制物的預(yù)處理步驟中出現(xiàn)靶細胞的損失。另一種除去核酸擴增抑制物的路線是(樣品制備的)后處理法；例如，將除去核酸擴增抑制物的物質(zhì)加入到聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)主混合物中。在預(yù)處理步驟中觀測到的靶細胞或DNA的損失未明顯弱化是有優(yōu)勢的。然而，盡管已對除去核酸擴增抑制物的物質(zhì)進行了研究，且已有多個產(chǎn)物實現(xiàn)了商業(yè)化，但它們的效果是不顯著的。已研究了多種化學物質(zhì)(乙酰胺、甜菜堿、葡聚糖、二甲基亞砜、甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10等)、表面活性劑(吐溫、SDS等)和生物分子(gp32單鏈結(jié)合蛋白、蛋白酶抑制因子等)，但它們的效果是不明顯的。只有當加入BSA時，證實了輕微的除去核酸擴增抑制物的效果。然而，在該情況中，盡管材料之間的差異足夠大以至于能施加BSA對核酸擴增抑制物的除去效應(yīng)，但在少數(shù)樣品中的效果是不明顯的。
[0007]因此，仍然需要快速、準確的核酸擴增方法來檢測來自于生物物質(zhì)包括糞便樣品中的痕量目標物質(zhì)。
[0008]發(fā)明簡述
[0009]本發(fā)明提供了使用離子液體的核酸擴增方法。
[0010]本發(fā)明提供了包含離子液體的核酸擴增特異性組合物。
[0011]本發(fā)明提供了包含離子液體的核酸擴增特異性試劑盒。
[0012]本發(fā)明提供了核酸擴增抑制物的遏制劑，其含有離子液體。[0013]本發(fā)明提供了核酸擴增方法，包括制備生物材料和核酸擴增混合物，并向所述生物材料和所述核酸擴增混合物的至少一個中加入離子液體；將所述生物材料與所述核酸擴增混合物混合，制備核酸擴增反應(yīng)混合物；并擴增核酸，其中所述離子液體遏制了核酸擴增抑制物。
[0014]術(shù)語“反應(yīng)效率”表示，在給定條件下，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)每一循環(huán)中目標核酸的擴增反應(yīng)平均數(shù)(平均倍增/循環(huán)數(shù))。PCR反應(yīng)的效率受材料純度、目標物質(zhì)的量、反應(yīng)條件、反應(yīng)遏制劑的存在等的影響。PCR通過重復(fù)足夠多的循環(huán)數(shù)來檢測產(chǎn)物，所述循環(huán)通常如下組成:變性(其將DNA模板分離成單鏈)、結(jié)合引物與模板退火，以及聚合酶酶促延伸。擴增效率越高，擴增達到可檢測水平所耗費的時間越少。例如，可將核酸擴增效率理解成重復(fù)整個循環(huán)所花的時間，或為了將目標核酸擴增至可檢測水平以完成反應(yīng)所必需的循環(huán)所花費的時間。
[0015]術(shù)語“反應(yīng)靈敏度”或“檢測極限(LOD) ”表示，在給定PCR條件下，能進行可靠的檢測和定量的目標核酸的最低量或最少拷貝。在實時-PCR(RT-PCR)中，檢測極限表示為最大反應(yīng)單元(Max Rn)或循環(huán)閾值(Ct)。此外，Ct值表示循環(huán)數(shù)，是在分析了從PCR每個循環(huán)中發(fā)出的熒光信號后，發(fā)現(xiàn)熒光信號從估計的初步基線點(基礎(chǔ)信號)開始顯著增大的點，繪制每種材料的目標核酸拷貝數(shù)和Ct值之間的圖像。
[0016]所述方法包括制備生物材料和核酸擴增混合物，以及向它們至少一個中加入離子液體。
[0017]術(shù)語“生物材料”表示可從活體生物獲得的任何樣品。所述生物材料可以是，哺乳動物(包括人)或微生物衍生的細胞、體液、或核酸。例如，它們可以是:糞便(feces)、尿、血液、粘液(mucus)、唾液、粘凍物(slime)、汗液、體液、組織、肉(flesh)或核酸中的任何一種，或是被稀釋、洗滌、溶解 或凍干的樣品?？墒褂脧乃h(huán)境(hydrosphere)或肉體(corporal)收集的樣品作為生物材料，因為它們不涉及額外的核酸分離過程。使用未處理過的樣品直接進行核酸擴增是有利的，因為在核酸分離期間可損失大量樣品且需要耗時/費錢，尤其當所述樣品量很少時。
[0018]術(shù)語“用于核酸擴增的混合物”或“用于核酸擴增的組合物”表示，除包括模板外，包括實施核酸擴增必需的所有組分的混合物，其經(jīng)常稱為“主混合物(master mix)”或“預(yù)混合物(pre mix)”。所述組合物可另外包括目標核酸擴增所需要的已知物質(zhì)。例如，所述組合物可另外包括核酸聚合酶、其活化必需的緩沖液、輔因子和/或底物。所述核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或它們的組合。逆轉(zhuǎn)錄酶合成了與RNA序列互補的DNA鏈作為模板。所述核酸聚合酶可具有鏈替換活性。例如，所述核酸聚合酶可以是至少一種來自于逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV，MMLV或AMV的逆轉(zhuǎn)錄酶。所述核酸聚合酶可不具有3’ 一5’核酸外切酶活性。所述混合物可包括逆轉(zhuǎn)錄或PCR擴增所必需的物質(zhì)。例如，用于核酸擴增的混合物可包括用于聚合反應(yīng)的每個約I μ Μ-50 μ M緩沖液的正向引物和反向引物，例如 pH 約 8.0-9.0 的 IOmM Tris HC1、約 40mM KC1、約 L 5mM MgCl2、每個約 250 μ M 的四種dNTP和約0.5-1U的DNA聚合酶。根據(jù)反應(yīng)的量和速度，用于核酸擴增的混合物可以以高密度倍數(shù)(例如X2-X10)來使用。
[0019]術(shù)語“離子液體”表示在室溫盡管與離子鍵合但以液態(tài)存在的物質(zhì)。從化學上來分析其類似于鹽；但與鹽不同的是，其在室溫下以液態(tài)存在且能很好地溶解多種物質(zhì)。其也被評定為對環(huán)境友好的溶劑，因為在室溫其不易氣化從而不釋放出氣化的有毒物質(zhì)，且因
為比有機溶劑更易于獲取而可再生。其可以作為催化劑的電解質(zhì)來用，或用于電池工業(yè)領(lǐng)
域。例如，離子液體的陽離子可以是下面的一種:
[0020]
【權(quán)利要求】
1.擴增核酸的方法，所述方法包含: 制備生物材料和核酸擴增混合物，是通過向它們中的至少一個加入離子液體來制備； 將生物材料和所述核酸擴增混合物混合，制備用于核酸擴增的反應(yīng)混合物；和 擴增核酸， 其中所述離子液體遏制了核酸擴增抑制物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述離子液體的陽離子是選自如下的至少一種:
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物材料是選自如下的至少一種:糞便、尿、血液、粘液、唾液、粘凍物、汗液、體液、組織、肉和核酸，或被稀釋、洗滌、溶解或凍干的樣品。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中用于核酸擴增的所述反應(yīng)混合物中的離子液體濃度在約 0.001%(v/v)-50%(v/v)范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸擴增抑制物是選自如下的至少一種:膽酸、膽鹽、多糖、膽紅素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血紅素、氯高鐵血紅素、膠原、黑色素、真黑素、肌紅蛋白、蛋白酶、鈣離子、脲、血紅蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化鈣、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中用于核酸擴增的所述反應(yīng)混合物還包含選自如下的至少一種:牛血清清蛋白(BSA)、乙酰胺、甜菜堿、葡聚糖、二甲基亞砜(DMS0)、甲酰胺、丙三醇、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-1O、Tween-20、Triton-X、十二烷基硫酸鈉(SDS)、gp32單鏈結(jié)合蛋白、和蛋白酶抑制因子。
7.用于生物材料的核酸擴增的組合物，其包含遏制核酸擴增抑制物的離子液體。
8.權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述離子液體的陽離子是選自如下的至少一種:
9.權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述生物材料選自糞便、尿、血液、粘液、唾液、粘凍物、汗液、體液、組織、肉和核酸，或被稀釋、洗滌、溶解或凍干的樣品。
10.權(quán)利要求7所述的組合物，其中在用于核酸擴增的所述組合物中的離子液體濃度在 0.001% (v/v) -50% (v/v)范圍內(nèi)。
11.權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述核酸擴增抑制物是選自如下的至少一種:膽酸、膽鹽、多糖、膽紅素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血紅素、氯高鐵血紅素、膠原、黑色素、真黑素、肌紅蛋白、蛋白酶、鈣離子、脲、血紅蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化鈣、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
12.權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述組合物還包含選自如下的至少一種:BSA、乙酰胺、甜菜堿、葡聚糖、DMSO,甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10, Tween-20, Triton-X、SDS, gp32 單鏈結(jié)合蛋白、和蛋白酶抑制因子。
13.用于生物材料的核酸擴增的試劑盒，其包含遏制核酸擴增抑制物的離子液體。
14.權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述離子液體的陽離子是選自如下的至少一種:
15.權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述生物材料選自糞便、尿、血液、粘液、唾液、粘凍物、汗液、體液、組織、肉和核酸，或被稀釋、洗滌、溶解或凍干的樣品。
16.權(quán)利要求13的所述試劑盒，其中所述核酸擴增抑制物是選自如下的至少一種:膽酸、膽鹽、多糖、膽紅素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血紅素、氯高鐵血紅素、膠原、黑色素、真黑素、肌紅蛋白、蛋白酶、鈣離子、脲、血紅蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化鈣、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
17.權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含選自如下的至少一種:BSA、乙酰胺、甜菜堿、葡聚糖、DMSO,甲酰胺、丙三醇、PEG、PVP-10, Tween-20, Triton-X, SDS, gp32單鏈結(jié)合蛋白和蛋白酶抑制因子。
18.核酸擴增抑制物的遏制劑，包含離子液體。
19.權(quán)利要求18所述的遏制劑，其中所述離子液體的陽離子是選自如下的至少一種:
20.權(quán)利要求18所述的遏制劑，其中所述核酸擴增抑制物是存在于生物材料中的遏制劑。
21.權(quán)利要求18所述的遏制劑，其中所述核酸擴增抑制物是選自如下的至少一種:膽酸、膽鹽、多糖、膽紅素、肝素、蛋白水解酶、酚化合物、核酸酶、多胺、血紅素、氯高鐵血紅素、膠原、黑色素、真黑素、肌紅蛋白、蛋白酶、鈣離子、脲、血紅蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白G、腐殖酸、手套粉末、氯化鈣、乙二胺四乙酸(EDTA)和FeCl3。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571823SQ201310050007
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月26日
【發(fā)明者】權(quán)圣弘, 池圣敏, 黃奎淵, 金俊鎬, 鄭善玉, 鄭盛旭, 鄭元淙 申請人:三星電子株式會社