纖維素單胞菌菌株及其水解綠藻的方法以及其制備保健食品的方法及所制得的保健食品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種纖維素單胞菌菌株及其水解綠藻的方法以及其制備保健食品的方法及所制得的保健食品。特別地，本發(fā)明提供一種纖維素單胞菌菌株(Cellulomonas?sp.YJ5)，該纖維素單胞菌菌株具有可水解綠藻的能力；本發(fā)明另提供一種纖維素單胞菌菌株水解綠藻的方法，其包含培養(yǎng)前述的纖維素單胞菌菌株，并與一綠藻懸浮液混合，以水解綠藻；本發(fā)明再提供一種利用纖維素單胞菌菌株水解綠藻以制備保健食品的方法，其中該纖維素單胞菌菌株可促進(jìn)綠藻釋放可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素、勝肽及還原糖，并可提升亞鐵螯合能力、Trolox當(dāng)量抗氧化能力以及還原糖能力。
【專利說明】纖維素單胞菌菌株及其水解綠藻的方法以及其制備保健食品的方法及所制得的保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種纖維素單胞菌菌株，尤指一種具有可水解綠藻能力的纖維素單胞菌菌株，以及利用該菌株水解綠藻的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維酶于有效生物性水解作用(effective biological hydrolysis)中扮演重要的角色，并通過內(nèi)-β -1，4-聚葡萄糖酶(endo- β -1, 4-glucanase) (EC3.2.1.4, EG)、纖維水解酶(cellobiohydrolase) (EC3.2.1.91，CBH)以及 β-D-葡萄糖苷酶(β -D-glucosidase) (EC3.2.1.21)的協(xié)同作用(synergistic action)使纖維素分解成單糖?，F(xiàn)有技術(shù)中，纖維酶被用于許多工業(yè)上應(yīng)用諸如動物飼料(animal feed)、紡織(textile)、廢水(waste water)、釀造(brewing)及造酒(wine-making),該等纖維酶是由獨(dú)立折迭(independently folding)、各具結(jié)構(gòu)及功能而被稱為定義域(domain)或模組(module)的不連續(xù)單位所組成，其構(gòu)成纖維酶的單元。纖維酶對于聚合物的作用形式(action mode)不是外切除(exo-cleavage)即為內(nèi)切除(endo-cleavage),以及所有纖維酶皆目標(biāo)(target)于β-1, 4-醣苷鍵(β _1，4-glycosidic bonds)的特殊切除點(specific cleavage)。因此,纖維水解酶[外切-聚葡萄糖酶(exo-glucanases)]基于于β-1，4-醣苷鍵的切除點而被分類成外切(exo-acting);另一方面，內(nèi)聚葡萄糖酶(endoglucanases)僅于β-1，4_醣苷鍵內(nèi)部(internally)的切除點而被分類成內(nèi)切酶(endo-acting cellulases)。
[0003]盡管如此,現(xiàn)有技術(shù)有些纖維酶是皆含有內(nèi)作用形式(endo-action mode)及外作用形式(exo-action mode),因此，當(dāng)內(nèi)聚葡萄糖酶于纖維酶晶體(cellulose crystal)的較可溶非結(jié)晶區(qū)(amorphous region),纖維水解酶被認(rèn)為作用于結(jié)晶區(qū)(crystallineregion)，并于纖維酶晶體的有效水解作用可觀察到較高的纖維水解酶與內(nèi)聚葡萄糖的協(xié)同作用。
[0004]醣類結(jié)合區(qū)域(carbohydrate binding domain)是纖維酶最常見的接受模組(accessory module),醣類結(jié)合區(qū)域的主要功能是用于供給(deliver)及帶出(bring)催化區(qū)域(catalytic domain),使得纖維酶的晶型可以靠近接觸而達(dá)到有效水解作用。通過醣類結(jié)合區(qū)域靠近纖維酶而與纖維酶結(jié)合是非常穩(wěn)定的，但仍可讓酶從受質(zhì)(substrates)表面由側(cè)邊擴(kuò)散通過，此外，有些醣類結(jié)合區(qū)域亦可選定與非晶型纖維酶(noncrystallinecellulose)結(jié)合。
[0005]微藻(microalgae)被認(rèn)為是一般通認(rèn)安全(generallyregarded as safe, GRAS)的生物(organisms)，并可用于人體消耗(human consumption)，該微藻可將太陽能(solar energy)轉(zhuǎn)變?yōu)樯|(zhì)能(biomass),且近年來因新的生產(chǎn)技術(shù)(productiontechnology)而越顯重要。由于微藻生長不需昂貴受質(zhì)，因此微藻被認(rèn)為是具有經(jīng)濟(jì)效益及有效生物催化劑(effective biocatalyst),并可獲得高附加價值的化合物(highvalue-added compound),且藻類于生產(chǎn)過程中的生物能可做為食物來源諸如蛋白質(zhì)。這些單細(xì)胞綠微藻(unicellular green microalgae)[綠藻門(Chlorophyta),綠藻綱(Chlorophyceae)]是優(yōu)良蛋白質(zhì)、有機(jī)礦物質(zhì)(organic minerals)、維他命(vitamins)、多糖(polysaccharides)、多兀不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)及其他營養(yǎng)來源，并由于其抗氧化效果(antioxidative effects)或免疫效果(immunologicaleffectiveness),使其綠微藻可做為健康食品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑及醫(yī)藥應(yīng)用。
[0006] 然而,所有綠藻,諸如綠球藻(Chlorella)及柵藻(Scenedesmus)由于堅硬的細(xì)胞壁，使得人體小腸無法消化及吸收，以致于藻類難以被用于人體營養(yǎng)補(bǔ)充及醫(yī)藥應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的綠藻具有堅硬的細(xì)胞壁，使得人體小腸無法消化及吸收綠藻的養(yǎng)分，故本發(fā)明的目的在于提供一種纖維素單胞菌菌株、其水解綠藻的方法、以其制備保健食品的方法及所制得的保健食品，通過該纖維素單胞菌菌株所萃取的纖維酶可水解綠藻的細(xì)胞壁，使人體可有效消化及吸收綠藻的營養(yǎng)。
[0008]為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供一種纖維素單胞菌菌株(Cellulomonas sp.YJ5)，其保藏于中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏號為CCTCC:M2012546，且該纖維素單胞菌菌株具有可水解綠藻的能力。
[0009]本發(fā)明另提供一種纖維素單胞菌菌株水解綠藻的方法，其包含培養(yǎng)前述的纖維素單胞菌菌株，并與一綠藻懸浮液混合，以水解綠藻。
[0010]優(yōu)選的，所述的纖維素單胞菌菌株是培養(yǎng)于任何一適合纖維素單胞菌菌株生長的培養(yǎng)基，諸如Nutrient Agar培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基是以總重量為基礎(chǔ)，包含一特定的組成:1% 綠藻粉末(chlorella powder)、0.5% 蛋白腺(peptone)、0.3% 牛肉萃取物(beefextract);并以下列培養(yǎng)條件培養(yǎng)3天至4天:震蕩培養(yǎng)是每分鐘50轉(zhuǎn)(rpm)至150rpm、溫度是介于30°C至50°C之間、通氣量是介于80%至100%之間。
[0011]優(yōu)選的，所述的綠藻懸浮液是以總重量(w/w)為基礎(chǔ)，是10%及20%的綠藻懸浮液(suspensions),且該綠藻懸浮液是經(jīng)由水回溶噴霧干燥(spray-dried)的綠藻所制得的懸浮液。
[0012]依據(jù)本發(fā)明，“噴霧干燥”于此所指涉者是利用熱風(fēng)連續(xù)干燥裝置使綠藻懸浮液瞬間干燥成粉末，其優(yōu)點為易溶于水，且可延長保存時間。
[0013]優(yōu)選的，所述的纖維素單胞菌菌株與綠藻懸浮液混合后，其濃度是介于每毫升150U (U/mL)至 350U/mL 之間。
[0014]依據(jù)本發(fā)明，“水解”于此所指涉者是由纖維素單胞菌菌株所釋放的細(xì)胞外纖維酶，將綠藻細(xì)胞壁的多醣類分解為單糖的反應(yīng)。
[0015]優(yōu)選的，所述的水解所歷經(jīng)的時間是介于30分鐘至180分鐘。
[0016]本發(fā)明再提供一種利用纖維素單胞菌菌株水解綠藻以制備保健食品的方法，其中該纖維素單胞菌菌株可促進(jìn)綠藻釋放可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素、勝肽及還原糖，并具有較高的亞鐵螯合能力、Trolox當(dāng)量抗氧化能力以及還原糖能力。
[0017]優(yōu)選的,所述的可溶性蛋白質(zhì)的含量是介于2.03mg/mL至20.87mg/mL之間。
[0018]優(yōu)選的,所述的葉綠素含量是介于1.87mg/mL至11.83mg/mL之間。[0019]優(yōu)選的,所述的勝肽含量是介于8.28mg/mL至14.33mg/mL之間。
[0020]本發(fā)明亦提供以上述方法所制得的保健食品。
[0021]通過本發(fā)明纖維單胞菌株，可使綠藻細(xì)胞被水解以釋放較高可溶性蛋白質(zhì)、勝肽、葉綠素以及還原糖，并具有較高的亞鐵螯合能力、Tio1x當(dāng)量抗氧化能力以及還原糖能力，因此可做為營養(yǎng)補(bǔ)充劑及保健食品(functional food);此外，相較于現(xiàn)有技術(shù)的以高壓破碎(crack)綠藻細(xì)胞而容易流失養(yǎng)分，本發(fā)明的纖維酶水解作用較為簡單方便，亦可保留養(yǎng)分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明以20%綠藻懸浮液與150U/mL纖維酶的細(xì)胞外纖維酶所得的綠藻水解液的葉綠素含量變化圖。
[0023]圖2A是本發(fā)明以10%綠藻懸浮液與不同濃度(0U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL及350U/mL)的細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的可溶性蛋白質(zhì)含量變化圖。
[0024]圖2B是本發(fā)明以 10%綠藻懸浮液與不同濃度(OU/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL及350U/mL)的細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的葉綠素含量變化圖。
[0025]圖2C是本發(fā)明以10%綠藻懸浮液與不同濃度(OU/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL及350U/mL)的細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的勝肽含量變化圖。
[0026]圖3A是本發(fā)明以10%或20%綠藻懸浮液與150U/mL或300U/mL的細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的葉綠素含量變化圖。
[0027]圖3B是本發(fā)明以10%或20%綠藻懸浮液與150U/mL或300U/mL的細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的還原糖變化圖。
[0028]圖3C是本發(fā)明以10%或20%綠藻懸浮液與150U/mL或300U/mL的細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的纖維酶活性變化圖。
[0029]圖3D是本發(fā)明以10%或20%綠藻懸浮液與150U/mL或300U/mL的細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的蛋白質(zhì)含量變化圖。
[0030]圖4是本發(fā)明以20%綠藻懸浮液，并以150U/mL細(xì)胞外纖維酶水解歷經(jīng)150分鐘，并以1000倍放大倍率于O分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘以及150分鐘的顯微鏡
觀察圖。
[0031]圖5是本發(fā)明以20%綠藻懸浮液，并以150U/mL細(xì)胞外纖維酶于50°C水解歷經(jīng)180分鐘所得的全部不可溶固形物的變化圖。
[0032]圖6A是本發(fā)明的綠藻懸浮液于50°C水解歷經(jīng)3小時所得的可溶性蛋白質(zhì)的變化圖。
[0033]圖6B是本發(fā)明的綠藻懸浮液于50°C水解歷經(jīng)3小時所得的勝肽含量的變化圖。
[0034]圖6C是本發(fā)明的綠藻懸浮液于50°C水解歷經(jīng)3小時所得的葉綠素的變化圖。
[0035]圖6D是本發(fā)明的綠藻懸浮液于50°C水解歷經(jīng)3小時所得的還原糖的變化圖。
[0036]圖7A是本發(fā)明的綠藻懸浮液于50°C水解歷經(jīng)O小時及3小時所得的亞鐵螯合能力的變化圖。
[0037]圖7B是本發(fā)明的綠藻懸浮液于50°C水解歷經(jīng)O小時及3小時所得的Trolox當(dāng)量抗氧化能力的變化圖。
[0038]圖7C是本發(fā)明的綠藻懸浮液于50°C水解歷經(jīng)O小時及3小時所得的還原糖的變化圖。
【具體實施方式】
[0039]制備例
[0040]材料與方法
[0041]1.纖維酶(celIulase)活性分析
[0042]將100微升(yL)的細(xì)胞外纖維酶置于含有0.1%的900yL羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose, CMC)的20毫莫耳濃度(mM)磷酸緩沖液(pH7.0)混合均勻，并于50°C反應(yīng)30分鐘后,加入I毫升(mL)的二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid, DNS),并于沸水中加熱5分鐘后停止反應(yīng)，待冷卻至室溫后，以吸光值為540奈米(nm)測量，其中一單位的細(xì)胞外纖維酶活性的定義:是多少量的酶可于50°C及30分鐘條件下水解羧甲基纖維素以及釋放 I 微克(U g)葡萄糖(glucose) (Miller, Anal Chem31:426-8，1959)。
[0043]中性蛋白酶(neutralprotease)的活性是依據(jù)(Anson, J GenPhysiol22:77-89, 1938)所述的方法測量:將12mL的粗酵素(crude enzyme)加入48mL且濃度為2%的偶氮酪蛋白溶液(azocasein solution) (pH7.5)中，并于37°C培養(yǎng)60分鐘。之后再加入60mL且濃度為10%的三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)以停止反應(yīng),并將樣本沉積(settle) 20分鐘后，以6000重力加速度(xg)離心10分鐘。再將20mL且當(dāng)量濃度為1.8N的氫氧化鈉(NaOH)加入80mL的上清液(supernatant),并于420nm的吸光值下進(jìn)行量測，其中一單位蛋白酶的活性定義:是通過多少量的酶可于37°C及60分鐘條件下，于420nm的吸光值增加0.1。
[0044]2.分解微型藻(microalgae)的細(xì)胞壁
[0045]為了最佳化水解條件,制備重量百分比為10%及20%的微型藻懸浮液(microalgaesuspensions)，其中用以制得該微型藻懸浮液的微型藻是經(jīng)由噴霧干燥制備者，且該微型藻是耐熱性小球藻(Chlorella sorokiniana)。依據(jù)本發(fā)明，“微型藻懸浮液”于此所指涉者是綠球藻屬，故亦即綠藻懸浮液。
[0046]纖維酶(cellulase)是由纖維單胞菌(Cellulomonas sp.YJ5)于30°C培養(yǎng)3天后，利用超過濾濃縮法(ultrafiltration)(購自美國Amicon公司)濃縮后，加入上述的微型藻懸浮液并混合，使最終濃度分別為150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL及350U/mL。分解的最佳溫度是50°C,且對于在水中的纖維酶具有最高熱穩(wěn)定性(highest thermalstability) (Yin, J Agric food Chem58:9833-7，2010)，并搖動纖維酶 180 分鐘后，于 30 分鐘間隔(interval)時,將水解液(hydrolysates)移除并加熱至90°C歷經(jīng)10分鐘以停止反應(yīng)，并將所得的各水解液進(jìn)行試驗。
[0047]3.分解綠微藻(green microalgae)的分析
[0048]細(xì)胞壁分解程度可由可溶性蛋白質(zhì)(soluble protein)的釋放、葉綠素(chlorophyll)、還原糖(reducing sugar)、勝肽(peptides)、游離胺基酸(free aminoacids)、顯微鏡觀察以及殘余不溶性固形物(residual insoluble solid)所測量。
[0049] (I)可溶性蛋白質(zhì)[0050]依據(jù)[Lowry,J Biol Cheml93 (I): 265-75，1951],通過牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)以及標(biāo)準(zhǔn)曲線可測量可溶性蛋白質(zhì)的含量。
[0051](2)葉綠素釋放
[0052]各水解液經(jīng)水解30分鐘后，將各水解液分別歷經(jīng)1000Oxg離心30分鐘，并通過分光光度計(spectrophotometer)(型號是U-2001,購自日本Hitachi公司)于吸光值(absorbance) 400nm至7OOnm測量由微藻水解而得的葉綠素的差異。本制備例中，最高吸光值是675nm,并以葉綠素作為標(biāo)準(zhǔn)校正,其中是以每毫升水解液含有多少毫克(mg/mL)的葉綠素作為葉綠素含量。
[0053](3)還原糖釋放
[0054]還原糖的含量是通過二硝基水楊酸方法測量而得，并以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)曲線而測得還原糖的含量。
[0055](4)顯微鏡觀察
[0056]各樣本經(jīng)水解30分鐘后，將各樣本歷經(jīng)1000Oxg離心30分鐘，細(xì)胞壁分解的型態(tài)可通過顯微鏡觀察(型號是BH-2,購自日本Olympus公司)。
[0057](5)勝肽含量
[0058]勝肽含量是通過鄰苯二甲醒(ο -phthalaldehyde)的方法[J DairySci66 (6):1219-27, 1983]測量而得。取2mg/mL蛋白質(zhì)并以白胺酸_甘胺酸(leucine-glycine, Leu-Gly)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線而測得勝肽的含量。
[0059](6)游離胺基酸(free amino acids)
[0060]游離胺基酸經(jīng)由(Bull Jap Soc Sci Fish40:909-15，1974)所述的方法進(jìn)行前處理(pretreat)后,游離胺基酸的含量可通過胺基酸分析儀(amino acid analyzer)(購自日本Hitachi公司)測得。
[0061](7)不可溶固形物(insoluble solids)
[0062]將水解液以事先秤重(preweighed)的Gelman玻璃過濾器(glass filter)(購自美國Gelman公司)過濾,其經(jīng)去離子水(deionized water)沖洗兩次后受干燥。不可溶固形物記載為每ImL原始樣本中的固形物毫克數(shù)。
[0063]4.測量抗氧化能力
[0064](I)亞鐵離子螯合能力
[0065]亞鐵離子螯合能力是依據(jù)[Din,Arch Biochem Biophys315 (I): 161-9，1994]的方法測量而得。取ImL水解液，并與3.7mL的甲醇(methanol)及濃度為2mM的0.1mL氯化鐵(FeCl2)混合,再加入濃度為5mM的0.2mL菲洛嗪(ferrozine)以形成一混合物,再將該混合物激烈攪拌并置于室溫10分鐘以達(dá)到平衡。并于吸光值562nm測量菲洛嗪-亞鐵(ferrozine-Fe2+)含量,其中亞鐵離子螯合能力是通過下列公式計算而得:
[0066]亞鐵離子螯合能力(%)= [1-(A562nm; sample/A562nm; control) ] xlOO
[0067]并以乙烯二胺四醋酸二鈉(disodiumethylenediaminetetracetate, Na2EDTA)作為標(biāo)準(zhǔn)。
[0068](2)還原力
[0069]還原力是依據(jù)[Oyaizu,Jpn J Nutr44(6):307-15, 1986]的方法測量而得。將 ImL水解液加入濃度為200mM的ImL磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer) (pH6.6)及濃度為1% 的 ImL 赤血鐵[potassium ferricyanide, K3Fe (CN)6],并于 50°C歷經(jīng) 20 分鐘后，加入濃度為10%的ImL三氯乙酸以停止反應(yīng)；再于1000Oxg離心10分鐘后，取上清液0.5mL與
0.5mL蒸懼水(distilled water)均勻混合，并加入濃度為0.1%的0.1mL三氯化鐵(ferricchloride)，于室溫放置10分鐘后，以吸光值700nm測量。
[0070](3)Trolox 當(dāng)量抗氧化能力(trolox equivalent antioxidationcapacity, TEAC)
[0071]Trolox 當(dāng)量抗氧化能力是依據(jù)[Miller, Clin Sci84(4):407-12，1993]的方法測量而得。以含有0.818%氯化鈉、0.0015%氯化鉀的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制2mM的2, 2’ -次偶氮基雙(3-乙基苯噻唑啉-6-石黃酸)[2，2’ -azono-bis (3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid), ABTS],并于使用前16小時加入濃度為70mM的0.1mL過硫酸鉀(potassium persulfate,K2S2O8)以形成 ABTS.+溶液，再以磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.4)將 ABTS.+溶液稀釋20倍。取10 μ L水解液與已稀釋的0.99mL ABTS‘+溶液均勻混合并于避光條件下靜置6分鐘，再以吸光值734nm進(jìn)行測量。Trolox [6-羥基-2，5，7，8-四甲基口克皖-2-羧酸](6-hydroxy-2, 5, 7, 8tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid)是維生素 E 的水溶性相似物，可做為標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果即為Trolox當(dāng)量抗氧化能力并以mM表示。
[0072]5.統(tǒng)計分 析
[0073]利用統(tǒng)計分析系統(tǒng)(SAS/STAT，版本8.0，購自美國Cary公司)進(jìn)行單因子變異分析(one way analysis of variance, AN0VA),并通過鄧氏多變域檢定(Duncan，s MultipleRange Test)以找出各組的顯著差異，且實驗是以三次重復(fù)的方式進(jìn)行并計算平均值(meanvalue)，其中顯著差異是P〈0.05。
[0074]實施例1水解綠藻細(xì)胞(耐熱性小球藻)所得的葉綠素變化
[0075]本實施例是如前述“分解微型藻的細(xì)胞壁”的方法所得的20%綠藻懸浮液與150U/mL纖維酶的細(xì)胞外纖維酶，于吸光值675nm至430nm進(jìn)行測量。依據(jù)(RaychaudhuriB, APPL Phys B91:545-50，2008)，所有葉綠素可于藍(lán)光(402nm 至 441nm)以及紅光 ^40nm至680nm)形成兩條明顯吸光帶，如圖1所示，于吸光值750nm時，通過粗酵素150U/mL水解60分鐘，葉綠素由0.46增加至0.86。
[0076]實施例2纖維酶水解綠藻細(xì)胞(耐熱性小球藻)的影響
[0077]本實施例是通過制備例所述的“分解微型藻的細(xì)胞壁”所得的10%微型藻懸浮液，并以不同濃度(0U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL、300U/mL 及 350U/mL)的纖維酶，于 50°C歷經(jīng)水解180分鐘進(jìn)行前述“可溶性蛋白質(zhì)”、“葉綠素釋放”及“勝肽含量”所述的方法，以評估纖維素水解綠藻細(xì)胞的影響。
[0078]如圖2A所示，于水解30分鐘后，蛋白質(zhì)含量由2.03mg/mL增加至范圍為15.39mg/mL至20.87mg/mL之間，且水解180分鐘后，蛋白質(zhì)含量增加至25.37mg/mL至27.25mg/mL之間；如圖2B所示，于水解30分鐘時，葉綠素含量由1.87mg/mL增加至范圍為9.05mg/mL至
9.63mg/mL之間，且于水解180分鐘時，葉綠素含量增加至范圍為11.54mg/mL至11.83mg/mL之間；如圖2C所示，于水解30分鐘時，勝肽含量由8.28mg/mL增加至范圍為10.34mg/mL至12.37mg/mL之間，且于水解180分鐘時，勝肽含量增加至范圍為13.72mg/mL至14.33mg/mL之間；且于圖2A至圖2C中，各水解液之間并無顯著差異(P>0.05)。依據(jù)以上結(jié)果，濃度為150U/mL的纖維酶足以水解綠藻細(xì)胞。[0079]為評估綠藻濃度對于水解作用的影響，以150U/mL及300U/mL細(xì)胞外纖維酶(extracellular cellulases)于 50 °C 水解 10% 及 20% 綠藻溶液(Chlorella solutions)。如圖3A所示， 于水解30分鐘及60分鐘分別已有些微上升(slight increase)及顯著上升(significant increase),且葉綠素含量隨水解時間增加而增加更多；如圖3B所示，與控制組相比較，于50°C水解歷經(jīng)180分鐘過程中，還原糖隨著細(xì)胞外纖維酶增加而具有顯著差異(P〈0.05);如圖3C所示，纖維酶活性于初期120分鐘維持平坦(plateau)，但隨水解時間延長而急遽下降；如圖3D所示，可溶性蛋白質(zhì)于水解30分鐘后，有明顯地增加(P〈0.05)，并隨水解時間延長可增加更多。依據(jù)以上結(jié)果，以150U/mL細(xì)胞外纖維酶于50°C水解20%綠藻溶液具有較佳分解綠藻細(xì)胞的效果以及進(jìn)一步用于分析水解液特性。并由圖2A至圖3D所示，于50°C水解歷經(jīng)180分鐘過程中，因綠藻水解作用使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(intracellular substances)諸如可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素及還原糖連續(xù)性增加。
[0080]實施例3綠藻細(xì)胞于分解時特征改變(characteristic change during lysis ofChlorella cells)
[0081]本實施例是通過制備例所述的“分解微型藻的細(xì)胞壁”所獲得20%微型藻懸浮液，并以150U/mL細(xì)胞外纖維酶水解歷經(jīng)150分鐘，以“顯微鏡觀察”所述的方法，以放大1000倍觀察纖維素水解綠藻細(xì)胞的型態(tài)。
[0082]如圖2B及圖3A所示，于180分鐘水解過程中，葉綠素逐漸被釋放；如圖4所示，由被水解的綠藻可觀察到細(xì)胞壁破裂(rupture)。由纖維酶活性于120分鐘水解過程可維持高活性(圖3C)，可支持通過光學(xué)顯微鏡觀察到:于水解30分鐘后，綠藻細(xì)胞有稍微降低(degrade)，且于120分鐘后明顯降低(圖4);此外，如圖5所示，于水解作用過程中，由于細(xì)胞外酶溶液(extracellular enzyme solution)有纖維素酶及少數(shù)中性蛋白酶,使得全部不可溶固形物(total insoluble solids)明顯減少,而蛋白質(zhì)、葉綠素及勝肽含量增加(圖2及圖3)，因此于180分鐘水解作用過程中，可觀察到綠藻水解液的勝肽逐漸增加(圖2C)。這些現(xiàn)象顯示，由纖維單胞菌所得的高纖維酶及蛋白酶導(dǎo)致綠藻分解，且與纖維單胞菌于培養(yǎng)72小時后含有高纖維酶活性相呼應(yīng)。
[0083]實施例4評估綠藻水解液的生物功能特性(biofunctional properties)
[0084]本實施例是如前述“分解綠微藻的分析”、“測量抗氧化能力”所述的方法進(jìn)行評估測量。
[0085]1.可溶性蛋白質(zhì)、勝肽以及胺基酸含量
[0086]由圖6A及圖6B所示，可于50°C水解歷經(jīng)3小時過程中，獲得可溶性蛋白質(zhì)及勝肽，其中150U/mL及300U/mL的纖維酶水解的效果并無顯著差異(P>0.05)。這現(xiàn)象顯示150U/mL的纖維酶已足以水解綠藻，并與圖2A及圖2C的結(jié)果相呼應(yīng)。將水解作用歷經(jīng)3小時的可溶性蛋白質(zhì)(約18mg/mL)與勝肽含量(約16mg/mL)相比較,幾乎90%可溶性蛋白質(zhì)被水解。依據(jù)(Sheih, Bioresour Technol100:3419_25，2009)的研究，由普通小球藻(C.vulgaris)所純化的勝肽具有明顯保護(hù)DNA及避免氫氧基(hydroxyl radicals)導(dǎo)致細(xì)胞破壞(cellular damage)的特性，因此,普通小球藻的蛋白質(zhì)廢棄物的勝肽具有做為良好膳食補(bǔ)充劑(dietary supplement)的潛力，并可用于避免氧化壓力相關(guān)疾病(oxidativestress-related diseases)諸如動脈硬化(atherosclerosis)、冠狀動脈心臟病(coronaryheart disease)及癌癥(cancer)。[0087]表1.綠藻于50°C水解3小時的胺基酸含量
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種纖維素單胞菌菌株(Cellulomonas sp.YJ5)，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC:M2012546，且該纖維素單胞菌菌株具有可水解綠藻的能力。
2.—種纖維素單胞菌菌株水解綠藻的方法，其包含培養(yǎng)如權(quán)利要求1所述的纖維素單胞菌菌株，并與一綠藻懸浮液混合，以水解綠藻；其中該綠藻懸浮液以總重量為基礎(chǔ)，是10%及20%的綠藻懸浮液，且該綠藻懸浮液是以經(jīng)由噴霧干燥的綠藻所制得。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該纖維素單胞菌菌株與綠藻懸浮液混合后，其濃度是介于150U/mL至350U/mL之間。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其水解所歷經(jīng)的時間是介于30分鐘至180分鐘。
5.一種利用纖維素單胞菌菌株水解綠藻以制備保健食品的方法，包括有: 齊備一如權(quán)利要求1所述的具有可水解綠藻能力的纖維素單胞菌、可被如權(quán)利要求1所述的纖維素單胞菌水解的綠藻以及該綠藻因其細(xì)胞壁受纖維素單胞菌水解而釋出的營養(yǎng)成分與抗氧化成分的水解液； 基于前述水解液齊備一包括有前述營養(yǎng)成分與抗氧化成分的保健食品。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其中該營養(yǎng)成分與抗氧化成分包括有選自于由可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素、勝肽、還原糖及葉黃素所構(gòu)成的群組。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中該可溶性蛋白質(zhì)的含量介于2.03mg/mL至20.87mg/mL之間。
8.如權(quán)利要求6所述的方法,其中該葉綠素含量介于1.87mg/mL至11.83mg/mL之間。
9.如權(quán)利要求6所述的方法,其中該勝肽含量介于8.28mg/mL至14.33mg/mL之間。
10.一種綠藻因細(xì)胞壁受纖維素單胞菌水解而釋出的營養(yǎng)成分與抗氧化成分的保健食品，其由權(quán)利要求5至9中任一項所述的方法所制得。
【文檔編號】C12R1/01GK103981113SQ201310049442
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月7日
【發(fā)明者】殷儷容, 江善宗 申請人:金衣生命科學(xué)股份有限公司