豬附紅細胞體分離純化的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬附紅細胞體分離純化的方法，包括病原的分離純化，37℃溶血，蔗糖層析的步驟，最后在收集的提純物中加入PBS緩沖液，4℃10000r/min離心2h去蔗糖，棄上清，沉淀用2ml的PBS緩沖液懸浮，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明在無菌采集到血樣后，首先用PBS緩沖液進行了沖洗，初步分離純化了血樣，排除了干擾物質，為后續(xù)的分離純化奠定基礎；采用了56℃水浴加熱使附紅細胞體脫離于紅細胞的物理學方法，既不影響附紅細胞體的活性，同時也可以多次分離，從而可以獲得更多的抗原量；在附紅細胞體脫離紅細胞后，又采用了蔗糖層析的方法進一步純化附紅細胞體，使獲得的抗原的純度增加。
【專利說明】豬附紅細胞體分離純化的方法
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【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種通過物理方法使附紅細胞體從紅細胞上分離純化出來的方法。
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【背景技術】
[0004]附紅細胞體病(Eperythrozoonsis)是由附紅細胞體(Eperythmzoon, EH)寄生于人、動物紅細胞表面、血漿及骨髓內，引起的一種以貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要臨床癥狀的人畜共患病。
[0005]目前對該病的生物學研究中對附紅細胞體的分離純化大多采用化學試劑或藥物解離法，但化學試劑解離法后附紅細胞體的活動性大大減弱，且提純的附紅細胞體個體量也較少，藥物解離法則因為藥物劑量的不同對紅細胞產生不同的影響，甚至引起紅細胞溶血，致使抗原純度降低，從而影響試驗結果。
[0006]

【發(fā)明內容】

[0007]為了克服現(xiàn)有【技術領域】存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于，提供一種豬附紅細胞體分離純化的方法，解決現(xiàn)有技術采用化學試劑法附紅細胞體的活動性大大減弱，且提純的附紅細胞體個體量也較少，藥 物解離法則因為藥物劑量的不同對紅細胞產生不同的影響，甚至引起紅細胞溶血，致使抗原純度降低，從而影響試驗結果的問題。
[0008]本發(fā)明提供的豬附紅細胞體分離純化的方法，包括以下步驟:
一、病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣1ml，4°C或冷凍保存，于采集的臨床血樣中加入3倍0.01mol/L、pH為7.4的PBS清洗，2000r/min離心10min,去上清液，于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56°C水浴3min,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存?zhèn)溆茫?br> 二、對經56°C水浴分離的富含附紅細胞體的沉淀中按1:2比例加入滅菌蒸餾水，置于37°C 溶血 IOmin ；
三、將滅菌的蔗糖用PBS緩沖液配制成2個梯度，在離心管中從下到上依次加入55%和20%的蔗糖溶液，將經過超離的粗提液3ml小心加入在20%的蔗糖液上面，4°C 12000r/min離心2h，最后用滅菌注射器小心吸取55%和20%的蔗糖段之間的附紅細胞體帶；
四、在收集的提純物中加入PBS緩沖液，4°C10000r/min離心2h去蔗糖，棄上清，沉淀用2ml的PBS緩沖液懸浮，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0009]本發(fā)明提供的豬附紅細胞體分離純化的方法，其有益效果在于，本發(fā)明在無菌采集到血樣后，首先用PBS緩沖液進行了沖洗，初步分離純化了血樣，排除了干擾物質，為后續(xù)的分離純化奠定基礎；采用了 56°C水浴加熱使附紅細胞體脫離于紅細胞的物理學方法，既不影響附紅細胞體的活性，同時也可以多次分離，從而可以獲得更多的抗原量；在附紅細胞體脫離紅細胞后，又采用了蔗糖層析的方法進一步純化附紅細胞體，使獲得的抗原的純度增加。
[0010]
【具體實施方式】
[0011]下面結合一個實施例，對本發(fā)明提供的豬附紅細胞體分離純化的方法進行詳細的說明。
[0012]
實施例
[0013]本實施例的豬附紅細胞體分離純化的方法，包括以下步驟:
一、病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣1ml，4°C或冷凍保存，于采集的臨床血樣中加入3倍0.01mol/L、pH為7.4的PBS清洗，2000r/min離心10min,去上清液，于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56°C水浴3min,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存?zhèn)溆茫?br> 二、對經56°C水浴分離的富含附紅細胞體的沉淀中按1:2比例加入滅菌蒸餾水，置于37°C 溶血 IOmin ；
三、將滅菌的蔗糖用PBS緩沖液配制成2個梯度，在離心管中從下到上依次加入55%和20%的蔗糖溶液，將經過超離的粗提液3ml小心加入在20%的蔗糖液上面，4°C 12000r/min離心2h，最后用滅菌注射器小心吸取55%和20%的蔗糖段之間的附紅細胞體帶；
四、在收集的提純物中加入PBS緩沖液，4°C10000r/min離心2h去蔗糖，棄上清，沉淀用2ml的PBS緩沖液懸浮，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【權利要求】
1.一種豬附紅細胞體分離純化的方法，其特征在于:包括以下步驟: 一、病原的分離純化，嚴格無菌采集10份可疑病豬的血樣1ml，4°C或冷凍保存，于采集的臨床血樣中加入3倍0.01mol/L、pH為7.4的PBS清洗，2000r/min離心10min,去上清液，于沉淀中加入I倍的PBS稀釋,56°C水浴3min,立即2000r/min離心10min,棄沉淀,取上清于另一離心管中，15000r/min離心2h，去上清，于沉淀中加入1ml生理鹽水稀釋，4°C或一20°C保存?zhèn)溆茫? 二、對經56°C水浴分離的富含附紅細胞體的沉淀中按1:2比例加入滅菌蒸餾水，置于37°C 溶血 IOmin ； 三、將滅菌的蔗糖用PBS緩沖液配制成2個梯度，在離心管中從下到上依次加入55%和20%的蔗糖溶液，將經過超離的粗提液3ml小心加入在20%的蔗糖液上面，4°C 12000r/min離心2h，最后用滅菌注射器小心吸取55%和20%的蔗糖段之間的附紅細胞體帶； 四、在收集的提純物中加入PBS緩沖液，4°C10000r/min離心2h去蔗糖，棄上清，沉淀用2ml的PBS緩沖液 懸浮，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12N1/20GK103881941SQ201210561049
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權日:2012年12月21日
【發(fā)明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權汗, 李之詳, 許團輝 申請人:青島中仁藥業(yè)有限公司