高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，經(jīng)過菌株的處理與富集，菌株的初步篩選和菌株的復篩得到高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌。該方法對高產(chǎn)蛋白酶菌株選擇性強；篩選過程采用混合篩選，效率高；方法科學、時間周期短。
【專利說明】高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種菌株篩選方法。
[0003]
【背景技術】
[0004]蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的總稱，包括酸性(pH 2.5~3)、中性(pH 7左右)和堿性(pH 8左右)3種。規(guī)?；B(yǎng)殖畜禽水產(chǎn)動物，尤其是養(yǎng)殖幼年動物，因其消化器官分泌的酶系和酶量(內源酶)不足，對飼料蛋白質消化能力較差，極易引起消化不良、腹瀉與消瘦等疾病。因此，在飼料中添加酸性和中性蛋白酶，以提高動物對蛋白質的水解效率，促進動物對飼料蛋白質的吸收效率。但目前，國產(chǎn)飼用酸性蛋白酶比較少，主要是由于菌種酶活力低，生產(chǎn)成本高，因而其飼料營養(yǎng)研究有待于進一步深入展開。
[0005]枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，這些活性物質對致病菌或內源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用；枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機酸類，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長；刺激動物免疫器官的生長發(fā)育，激活T、B淋巴細胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強細胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力；枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內的消化酶類一同發(fā)揮作用；能合成維生素Β1、Β2、Β6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內干擾素和巨噬細胞的活性。
[0006]現(xiàn)有技術篩選蛋白酶枯草芽孢桿菌的方法普遍存在對菌株選擇性低，篩選方法不科學，時間周期長，效率低的問題。
[0007]

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于，提供一種高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，選擇性強，效率高，所得菌株具備作為工業(yè)菌株的能力。
[0009]本發(fā)明提供的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟:
一、菌株的處理與富集，取海水、污水適量接種至富集培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)基于35°C，170r/min振搖24h，制得富集菌液；
二、菌株的初步篩選，分別取適量所述富集菌液接種于脫脂奶粉平板培養(yǎng)基上，分別于35°C培養(yǎng)48h后觀察；
三、菌株的復篩，取初篩后的菌株接種種子培養(yǎng)基，170r/min，35°C振蕩培養(yǎng)24h，再將菌種液以體積分數(shù)1 %接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，170r/min，35°C振蕩培養(yǎng)48h，12000r/min離心20min,收集上清液,采用改良Lowry法檢測蛋白酶活力。[0010]所述步驟一中的富集培養(yǎng)基由蛋白胨5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，磷酸高鐵0.lg/L，瓊脂20g/L，及海水配制而成，pH值為7.6 ;所述步驟二中脫脂奶粉平板培養(yǎng)基是在TS(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH8.0)中加入1%瓊脂糖和1%脫脂奶粉,0.06 MPa高壓滅菌lOmin，待溫后傾注平板；所述步驟三中種子培養(yǎng)基由蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，酪素3g/L，氯化鈉5g/L配制而成，pH為7.5 ;所述步驟三中發(fā)酵培養(yǎng)基由蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L配制而成，pH為7.5。
[0011]本發(fā)明提供的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，其有益效果在于，對高產(chǎn)蛋白酶菌株選擇性強；篩選過程采用混合篩選，效率高；方法科學、時間周期短。
[0012]
【具體實施方式】
[0013]下面結合一個實施例，對本發(fā)明提供的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法進行詳細的說明。
[0014]實施例
[0015]本實施例的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括以下步驟:
一、菌株的處理與富集，取海水、污水適量接種至富集培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)基于35°C，170r/min振搖24h，制得富集菌液；
二、菌株的初步篩選，分別取適量所述富集菌液接種于脫脂奶粉平板培養(yǎng)基上，分別于35°C培養(yǎng)48h后觀察；
三、菌株的復篩，取初篩后的菌株接種種子培養(yǎng)基，170r/min，35°C振蕩培養(yǎng)24h，再將菌種液以體積分數(shù)I %接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，170r/min，35°C振蕩培養(yǎng)48h，12000r/min離心20min,收集上清液,采用改良Lowry法檢測蛋白酶活力。
[0016]所述步驟一中的富集培養(yǎng)基由蛋白胨5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，磷酸高鐵0.lg/L，瓊脂20g/L，及海水配制而成，pH值為7.6 ;所述步驟二中脫脂奶粉平板培養(yǎng)基是在TS(50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH8.0)中加入1%瓊脂糖和1%脫脂奶粉,0.06 MPa高壓滅菌lOmin，待溫后傾注平板；所述步驟三中種子培養(yǎng)基由蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，酪素3g/L，氯化鈉5g/L配制而成，pH為7.5 ;所述步驟三中發(fā)酵培養(yǎng)基由蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L配制而成，pH為7.5。
【權利要求】
1.一種高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于:包括以下步驟: 一、菌株的處理與富集，取海水、污水適量接種至富集培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)基于35°c，170r/min振搖24h，制得富集菌液； 二、菌株的初步篩選，分別取適量所述富集菌液接種于脫脂奶粉平板培養(yǎng)基上，分別于35°C培養(yǎng)48h后觀察； 三、菌株的復篩，取初篩后的菌株接種種子培養(yǎng)基，170r/min，35°C振蕩培養(yǎng)24h，再將菌種液以體積分數(shù)I %接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，170r/min，35°C振蕩培養(yǎng)48h，12000r/min離心20min,收集上清液,采用改良Lowry法檢測蛋白酶活力。
2.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于:所述步驟一中的富集培養(yǎng)基由蛋白胨5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，磷酸高鐵0.lg/L，瓊脂20g/L，及海水配制而成，pH值為7.6。
3.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于:所述步驟二中脫脂奶粉平板培養(yǎng)基是在TS (50 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl，pH8.0)中加Λ 1%瓊脂糖和1%脫脂奶粉，0.06 MPa高壓滅菌lOmin，待溫后傾注平板。
4.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于:所述步驟三中種子培養(yǎng)基由蛋白胨15g/L，酵母膏5g/L，酪素3g/L，氯化鈉5g/L配制而成，pH為7.5。
5.根據(jù)權利要求1所述的高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于:所述步驟三中發(fā)酵培養(yǎng)基由蛋白胨1 0g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L配制而成，pH為7.5。
【文檔編號】C12R1/125GK103881940SQ201210560999
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權日:2012年12月21日
【發(fā)明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權汗, 李之詳, 許團輝 申請人:青島中仁藥業(yè)有限公司