一種用于鑒定云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的分子標記及專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的分子標記及專用引物。本發(fā)明的用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的引物對，一個引物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，另一個引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。本發(fā)明的方法及專用引物和分子標記可用于云南元江普通野生稻胞質不育系的恢復系的選育，縮短含云南元江普通野生稻優(yōu)質種質資源的三系雜交水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應用，為選育具有云南元江普通野生稻遺傳背景的恢復系提供了一種快捷的選擇方法。
【專利說明】—種用于鑒定云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的分子標記及專用引物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于鑒定云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的分子標記及專用引物。
【背景技術】
[0002]水稻是世界上最主要的糧食作物之一，提高水稻單產是保障世界糧食安全的有力措施之一。在作物長期的進化過程中，由于育種家根據需要選擇目標性狀并對其進行定向培育及親本的重復使用，使得品種遺傳基礎狹窄。目前，約占水稻種植面積的一半以上的雜交水稻，所使用的雜交組合95%以上是由野敗型或與野敗型相類似的細胞質雄性不育系組配而成的，長期使用單一來源細胞質，可能出現(xiàn)遺傳脆弱性的危險。
[0003]野生稻既是研究稻作起源、分類、演化的重要實物依據，又是栽培稻育種的寶貴種質資源。野生稻也是天然的基因庫，保存有栽培稻沒有或已消失了的遺傳基因，并具有特殊優(yōu)良農藝性狀，如雄性不育性、高產、優(yōu)質、抗逆性等。由于所處生態(tài)環(huán)境的復雜性在其漫長的進化過程中，形成了極其豐富的遺傳多樣性。Sun et al (2001)研究發(fā)現(xiàn)在檢測的44個RFLP位點中，栽培稻的等位基因數約為野生稻的60%，并提出:野生稻在演化成栽培稻的過程中，等位基因減少，基因多樣性下降，一些基因已在栽培稻中丟失(Sun C Q, Wang X K，LiZ C,Yoshimura A.Comparison of the genetic diversity of common wild rice(Oryzarufipogon Griff.) and cultivated rice (0.sativaL.) using RFLP markers.Theor ApplGenet，2001，102:157-162)。因此，研究如何從野生稻中挖掘優(yōu)異基因，并把它們應用于栽培稻育種生產，具有十分重要的理論意義和實踐價值。
[0004]植物的胞質雄性不育現(xiàn)象，在生產上作為一種遺傳育種工具，在農作物雜種優(yōu)勢利用過程中省去人工去雄的麻煩，確保了雜交種子的純度，具有巨大的生產價值。在天然的植物中，普遍存在細胞質雄性不育，這是植物系統(tǒng)進化趨勢的必然產物，而且在自然條件下，恢復基因總是與細胞質雄性不育相伴隨，這是不育細胞質在群體中保存和傳遞的前提，這種核質互作的恢保關系具有專一性，這也是細胞質雄性不育分類及發(fā)現(xiàn)新的細胞質雄性不育類型的主要依據。我國雜交稻生產中應用的雄性不育細胞質主要來源于普通野生稻，可以推測野生稻中也必然存在相應的恢復基因(李紹清等，2005)，但用于生產上的恢復基因來源于野生稻的卻很少。本研究利用可育的元江普通野生稻與93-11構建的高代回交群體，發(fā)現(xiàn)元江野生稻的細胞質中存在不育基因，細胞核存在恢復基因，該不育細胞質及其恢復基因的發(fā)現(xiàn)與定位，對豐富三系雜交稻不育細胞質和恢復基因的遺傳多樣性具有重要的理論意義和實用價值。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的方法及其專用分子標記和專用引物。[0006]本發(fā)明所提供的用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的引物對，一個引物的核苷酸序列如序列表中序列I所示，另一個引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0007]本發(fā)明所提供的用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的分子標記，是用上述引物對PCR擴增云南元江普通野生稻得到的PCR產物。
[0008]本發(fā)明所提供的輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的方法，包括如下步驟:分別以云南元江普通野生稻和待測水稻品種的基因組DNA為模板，用上述引物對進行PCR擴增，若所述待測水稻品種的PCR擴增產物大小與所述云南元江普通野生稻的PCR擴增產物大小一致，則所述待測水稻品種候選為云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系。
[0009]上述方法中，所述PCR擴增產物大小可以通過瓊脂糖凝膠電泳檢測確定。
[0010]上述方法中，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測確定的PCR擴增產物大小為lOObp。
[0011]上述引物對、上述分子標記、上述方法中，所述云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系是以栽培稻93-11為遺傳背景、以云南元江普通野生稻為供體、高代回交得到的。
[0012]具體的，上述云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系是指“水稻的一個野栽滲入系的名稱命名為元9A”。
[0013]本發(fā)明的方法及專用引物和分子標記可用于云南元江普通野生稻胞質不育系的恢復系的選育，縮短含云南元江普通野生稻優(yōu)質種質資源的三系雜交水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點，適于推廣應用，為選育具有云南元江普通野生稻遺傳背景的恢復系提供了一種快捷的選擇方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為元江野生稻，滲入系9YJ06，9311和元中9A的基因組DNA為模板，分別在引物489-5ac引導下的PCR擴增產物(分子標記)的帶型(所用Marker為北京拓英坊科技有限公司的 50bp DNA Ladder)ο
[0015]圖2為以20個水稻品種的基因組DNA為模板，在引物489_5ac弓丨導下的PCR擴增產物(所用Marker為北京拓英坊科技有限公司的50bp DNA Ladder)。
【具體實施方式】
[0016]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0017]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]云南兀江普通野生稻(Yuanjiangcommon wild rice)在文獻(Tan LB, Li XR, LiuFX, Sun XY, Li CG, Zhu ZF, FuYC, Cai Hff, Wang XK, Xie DX and Sun CQ.Control of akey transition from prostrate to erect growth in rice domestication.NatureGenetics, 2008，40 (11): 1360-1364)中公開，公眾可以從中國農業(yè)大學獲得。
[0019]栽培稻93-11 (93-11)在文獻(Li XJj Sun LJj Tan LBj Liu FXj Zhu ZFj FuYCj SunXYj Sun XW, Xie DX and Sun CQ.THlj a DUF640domain_like gene controls lemma andpalea development in ric e Plant Mol Biol，2012，78:351 - 359)中公開，公眾可以從中國農業(yè)大學獲得。[0020]實施例1、專用引物及分子標記的發(fā)現(xiàn)
[0021]本研究構建一個以栽培稻93-11為遺傳背景，以云南元江普通野生稻為供體的高代回交群體BC6F1，并從群體中獲得了一個云南元江普通野生稻細胞質的雄性不育系，命名為“元9A”,輪回親本93-11是其保持系。這表明帶有可育細胞質的93-11能保持元9A的育性，而帶有不育細胞質的元江野生稻能恢復元9A的育性。將元9A在北京、海南和合肥三地種植，配套的恢復系、保持系和不育系確定元9A是細胞質雄性不育。
[0022]對元9A的花粉進行I2-KI染色，發(fā)現(xiàn)元9A的花粉以典敗為主，并能被多個恢復系所恢復。將該不育系與生產上常用的恢復系或保持系測交，發(fā)現(xiàn)野敗型的恢復系(如IR24、明恢63等)和紅蓮型的保持系(粵泰B)可以恢復元9A的育性，元9A與恢復系的F2的小穗育性存在分離，而紅蓮型的恢復系(93-11和特青)卻對元9A的育性起保持作用，表明元9A是屬于孢子體不育類型，而不是配子體不育類型。同時，還發(fā)現(xiàn)元9A與野敗恢復系測交的F2群體的小穗育性，可育株和不育株分離比例符合3:1，表明元9A的育性恢復受I對基因控制。
[0023]根據元江野生稻和93-11的BC3F1群體472株的基因型，結合以花粉育性和套袋自交結實率為指標的表型分析結果，采用QTL定位的方法對恢復基因進行定位，在第10染色體RM171附近檢測到I個QTL。利用元9A與中9B轉育出野秈型不育系元中9A，并在元江野生稻C-21與9311的滲入系中找到具有恢復能力的滲入系材料9YJ06，通過元中9A和9YJ06構建F2和F3群體用作定位群體。將恢復基因定位在引物6R23與YN37之間。在此區(qū)間內依據日本晴序列，在日本晴和93-11間篩選存在基因組差異的區(qū)域并設計引物489-5ac，以其為引物，以元江野生稻、元中9A、93-11和9YJ06的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增的反應體系為:水稻基因組DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0 μ 110XPCR緩沖液(IOOmM Tris.Cl ρΗ9.0,500mM KCl, 15mM Mg2+, l%Triton X-100)，100 μ M dNTPs,正向引物0.2 μ M，反向引物0.2 μ M，用DEPC水補充反應體系至20 μ I。PCR反應條件為:先 94°C 5min ;隨后 94°C 30sec，58°C 30sec，72°C lmin，共 35 個循環(huán)；再 72°C IOmin0 通過濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物中是否有目的條帶。圖1中，泳道1、2分別是以元中9A和9311的基因組DNA為模 板，489_5ac為引物進行PCR擴增所得產物，產物大小約150bp ;泳道3、4分別是以滲入系9YJ06和元江野生稻的基因組DNA為模板，489_5ac為引物進行PCR擴增所得產物，產物大小約lOObp。由489-5ac得到的PCR擴增產物(分子標記)位于第10染色體上基因L0C_0sl0g35300至L0C_0sl0g35310的序列范圍內，根據www.tigr.0rg提供的日本晴序列,此擴增產物大小約為IOObp,與元江野生稻和滲入系中9YJ06的PCR產物大小相同，而元中9A中的PCR產物約150bp。檢測結果表明上述引物在元江野生稻和元中9A中均有擴增產物，且在兩個材料中擴增出的目的片段大小存在差異。
[0024]表1.489-5ac引物的序列
[0025]
【權利要求】
1.一種用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的引物對，一個引物的核苷酸序列如序列表中序列I所示，另一個引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.一種用于輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的分子標記，是用權利要求1所述引物對PCR擴增云南元江普通野生稻得到的PCR產物。
3.一種輔助鑒別云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系的方法，包括如下步驟:分別以云南元江普通野生稻和待測水稻品種的基因組DNA為模板，用權利要求1所述引物對進行PCR擴增，若所述待測水稻品種的PCR擴增產物大小與所述云南元江普通野生稻的PCR擴增產物大小一致，則所述待測水稻品種候選為云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系的恢復系。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增產物大小是通過瓊脂糖凝膠電泳檢測確定的。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述PCR擴增產物大小為IOObp。
6.根據權利要求1所述的引物對、權利要求2所述的分子標記、或權利要求3-5所述的方法，其特征在于:所述云南元江普通野生稻細胞質雄性不育系是以栽培稻93-11為遺傳背景、以云南元 江普通野生稻為供體、高代回交得到的。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882096SQ201210560937
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優(yōu)先權日:2012年12月20日
【發(fā)明者】孫傳清, 付強, 霍興, 付永彩, 朱作峰, 譚祿賓, 劉鳳霞, 顧憑, 才宏偉 申請人:中國農業(yè)大學