多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的多肽由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列構(gòu)成。本發(fā)明的多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒在干燥綜合征的診斷中是有用的。
【專利說(shuō)明】多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件和檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及多肽、包含該多肽的檢測(cè)器件及檢測(cè)試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]干燥綜合征(Sjogren Syndrome, SS)是一種以侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺體為主的慢性自身免疫性疾病，又稱為自身免疫性外分泌腺體病。主要表現(xiàn)為干燥性角膜結(jié)膜炎、口腔干燥癥或伴發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其它風(fēng)濕性疾病，它可累及其他系統(tǒng)如呼吸系、消化系、泌尿系、血液系、神經(jīng)系以及肌肉、關(guān)節(jié)等造成多系統(tǒng)、多器官受損。
[0003]干燥綜合征是一個(gè)全球性疾病，90 %以上為女性，發(fā)病年齡大多為40—60歲的中老年，小兒較少。由于至今缺少統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所以該病的患病率很不準(zhǔn)確。一般估計(jì)為
0.1 %-0.7 %。在美國(guó)，干燥綜合征的發(fā)病率僅次于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。在我國(guó)的患病率也不低于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎0.3 %~0.4 %的發(fā)病率。
[0004]干燥綜合征診斷主要依賴于臨床癥狀體征表現(xiàn)(口干澀癥，干燥性角膜炎等)來(lái)進(jìn)行診斷。但僅通過(guò)癥狀判斷還難以與如結(jié)締組織疾病等其他的自身免疫性疾病相區(qū)分，因此還需要借助檢測(cè)血清中特定的自身抗體檢測(cè)來(lái)輔助診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)干燥綜合征的診斷有用的多肽、編碼該多肽的核酸、包含該核酸的表達(dá)載體、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、抗該多肽的抗體、包含該多肽的檢測(cè)器件、包含該多肽或該檢測(cè)器件的檢測(cè)試劑盒、以及該多肽在檢測(cè)干燥綜合征中的用途、該多肽在制備用于檢測(cè) 干燥綜合征的試劑盒或檢測(cè)器件中的用途。
[0006]此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的多肽對(duì)于干燥綜合征的診斷也是有用的。因此，本發(fā)明還提供用于檢測(cè)干燥綜合征的多肽、編碼該多肽的核酸、包含該核酸的表達(dá)載體、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞、抗該多肽的抗體、包含該多肽的檢測(cè)器件、包含該多肽或該檢測(cè)器件的檢測(cè)試劑盒、以及該多肽在檢測(cè)干燥綜合征中的用途、該多肽在制備用于檢測(cè)干燥綜合征的試劑盒或檢測(cè)器件中的用途。
[0007]即，本發(fā)明包含下述技術(shù)方案:
1.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0008]2.編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。
[0009]3.包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體。
[0010]4.導(dǎo)入了權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0011]5.一種檢測(cè)器件，其包括:
固體載體，以及
連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。
[0012]6.根據(jù)權(quán)利要求5 所述的檢測(cè)器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0013]7.一種檢測(cè)試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的多肽、或者權(quán)利要求5或6所述的檢測(cè)器件。
[0014]8.抗權(quán)利要求1所述的多肽的抗體。
[0015]9.權(quán)利要求1所述的多肽在制備用于檢測(cè)干燥綜合征的試劑盒或檢測(cè)器件中的用途。
[0016]將本發(fā)明的多肽應(yīng)用于干燥綜合征的診斷，能夠取得令人滿意的效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1將多肽通過(guò)化學(xué)共價(jià)固定于SJ改性硅膠表面的示意圖。
[0018]圖2對(duì)化學(xué)合成的本發(fā)明的多肽進(jìn)行確認(rèn)的HPLC圖譜。
[0019]圖3是對(duì)化學(xué)合成的本發(fā)明的多肽進(jìn)行確認(rèn)的MS表征圖譜。
[0020]圖4對(duì)SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)的制作過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明的示意圖。
[0021]圖5對(duì)多肽微陣列化學(xué)固定過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明的圖。
[0022]圖6說(shuō)明多肽微陣列點(diǎn)樣模式的示意圖。
[0023]圖7顯示對(duì)健康正常人或非干燥綜合征病人血清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果照片。
[0024]圖8顯示對(duì)干燥綜合征病人血清進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果照片。
[0025]發(fā)明的【具體實(shí)施方式】 本發(fā)明的多肽
本發(fā)明的多肽是20肽。本發(fā)明的20肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成，SP:VETQKSRIHAEFVQQKNFLV。如實(shí)施例所示，其對(duì)干燥綜合征病人的血清呈陽(yáng)性反應(yīng)，而對(duì)健康正常人或非干燥綜合征病人血清呈陰性反應(yīng)。因此，該20肽作為干燥綜合征的診斷工具是有用的
本發(fā)明的多肽在有市售的情況下，可以使用市售品，此外，還可以適宜采用(I)化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來(lái)獲得，其中化學(xué)合成更為簡(jiǎn)便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過(guò)使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來(lái)進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的。
[0026]此外，在通過(guò)酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國(guó)際公開(kāi)小冊(cè)子W02004/011653號(hào)所述的方法:將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出:具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來(lái)源的肽合成酶。
[0027]而且，除了上述的酶方法、化學(xué)合成方法以外，有些情況下，本發(fā)明的多肽還可能是天然存在(但未被分離出來(lái))的。在天然存在的情況下，還可以將其分離出來(lái)。
[0028]
本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體宿主細(xì)胞，以及抗本發(fā)明的多肽的抗體本發(fā)明還涉及編碼該多肽的核酸(本發(fā)明的核酸)、包含該核酸的表達(dá)載體(本發(fā)明的表達(dá)載體)、導(dǎo)入了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(本發(fā)明的宿主細(xì)胞)，它們優(yōu)選可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)制備。本發(fā)明還涉及抗本發(fā)明的多肽的抗體，其可用于檢測(cè)本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)制備。
[0029]
本發(fā)明的檢測(cè)器件
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)器件(本發(fā)明的檢測(cè)器件)，其包括固體載體、以及連接于該固體載體上的本發(fā)明的多肽。
[0030]在本發(fā)明中，對(duì)固體載體沒(méi)有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過(guò)過(guò)濾、沉淀、磁性分離等從反應(yīng)混合物中分離的材料)的載體即可。[0031]構(gòu)成固體載體的材料包括但不限于:硅膠(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟隆?、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹(shù)脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組合等。[0032]固體載體的形狀包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0033]在本發(fā)明中，磁珠可以具有約25nm~約1mm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，磁珠具有約50nm~約IOym范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來(lái)進(jìn)行選擇。
[0034]在本發(fā)明中，由Sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24 μnm~約165 μ m范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24 μm~約44 μ m范圍的直徑。高交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來(lái)進(jìn)行選擇。
[0035]具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL購(gòu)買(mǎi)的制品等聚苯乙烯膠乳珠。
[0036]二氧化硅(SiO2)-處理或二氧化硅(SiO2)基的固體載體的例子包括可從Polysciences, Warrington, PA購(gòu)買(mǎi)的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA) ο或者，還可以使用可從Dynal Biotech購(gòu)買(mǎi)的M-280等。
[0037]具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細(xì)菌細(xì)胞、核酸以及其它成分。作為該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences, Warrington, PA銷售的珠子(名稱:Biomag(注冊(cè)商標(biāo))羧基)、或者 Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN 的名稱為 MC02N/2928 的珠子?；蛘撸梢允褂肈ynal Biotech銷售的M-270等。
[0038]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠，為蘇州傯聚生物材料有限公司開(kāi)發(fā)的一種硅橡膠材質(zhì)的微陣列固體支撐材料(又名iPDMS薄膜，參見(jiàn)中國(guó)專利CN101265329A)。這種材料是以生物學(xué)研究常用的PDMS為基礎(chǔ)，在其中加入特定的引發(fā)劑成份(使該材料可通過(guò)表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP)實(shí)現(xiàn)表面功能化修飾)，再經(jīng)過(guò)聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol) methacrylate), pOEGMA)表面修飾獲得的。SJ改性硅膠具有優(yōu)秀的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附(Nonspecific proteinadsorption, NPA)能力，可以將復(fù)雜蛋白免疫檢測(cè)中的非特異性蛋白質(zhì)吸附控制到接近“絕對(duì)O”水平(接近或低于儀器的檢測(cè)極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過(guò)使用更強(qiáng)的信號(hào)擴(kuò)增手段來(lái)提高蛋白質(zhì)微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質(zhì)賦予了該材料較強(qiáng)的機(jī)械性能和良好的可操作性。蘇州傯聚已經(jīng)成功地將SJ改性硅膠應(yīng)用于11個(gè)腫瘤標(biāo)志物組成的多指標(biāo)聯(lián)檢微陣列ELISA試劑盒，實(shí)現(xiàn)了高通量和高靈敏的檢測(cè)，證明了這種材料是一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)微陣列固體支撐材料。同時(shí)，這種材料還具有表面性質(zhì)可調(diào)的特性，可以通過(guò)控制修飾反應(yīng)時(shí)間在一定范圍內(nèi)調(diào)整其表面形貌。
[0039]本發(fā)明的多肽與固體載體的連接可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多肽與固體載體的連接方法來(lái)進(jìn)行。例如，對(duì)于蛋白質(zhì)/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過(guò)
1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和N-羥基玻拍酸亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反應(yīng)將改性娃膠表面高分子鏈上的羧基(-C00H)基團(tuán)改為活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-NH2)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)將蛋白/多肽固定于固體載體表面(參見(jiàn)圖1)。
[0040]對(duì)于點(diǎn)樣時(shí)使用的點(diǎn)樣液中本發(fā)明的多肽的濃度沒(méi)有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為 μ g~lOOO μ g/mL,更優(yōu)選10 μ g~500 μ g/mL。此外，對(duì)于本發(fā)明的多肽在固體載體上分布的密度沒(méi)有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1~100 點(diǎn) /10mm2，更優(yōu)選 5~50 點(diǎn) /10_2。
[0041 ] 本發(fā)明的檢測(cè)器件可以用于檢測(cè)干燥綜合征、或者制備用于檢測(cè)干燥綜合征的試劑盒。
[0042]
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)試劑盒(本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒)，其包括本發(fā)明的多肽或檢測(cè)器件。該檢測(cè)試劑盒優(yōu)選用于檢測(cè)干燥綜合征。
[0043]本發(fā)明的檢測(cè)器件或本發(fā)明的多肽是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的要件。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括:
1.配好的血清稀釋液或血清稀釋液組分溶液:血清稀釋液，例如有北京賽馳生物科技有限公司的樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)070021-S2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)bwj010103)等。該血清稀釋液用來(lái)稀釋血清，試劑盒檢測(cè)的血清要稀釋適當(dāng)倍數(shù)，例如2~200倍，優(yōu)選10-100倍。
[0044]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括:
2.濃縮洗液:固體載體表面孵育血清及酶標(biāo)二抗后，需用洗液清洗掉固體載體表面未結(jié)合的抗體和酶標(biāo)二抗。濃縮洗液例如是1%的吐溫20水溶液，使用時(shí)需稀釋2~40倍、優(yōu)選5~20倍。
[0045]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括:
3.酶標(biāo)二抗溶液:干燥綜合征病人血清中的干燥綜合征自身抗體(IgG)可與固體載體(例如SJ改性硅膠)上的本發(fā)明的多肽結(jié)合，二抗可與抗體結(jié)合，而二抗上的標(biāo)記物可與發(fā)光底物反應(yīng)，從而發(fā)出可檢測(cè)的光。酶標(biāo)二抗可以是例如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG0作為酶標(biāo)二抗溶液，可以列舉出北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG(H+L)，產(chǎn)品編號(hào)ZB-2304。對(duì)酶標(biāo)二抗在酶標(biāo)二抗溶液中的濃度沒(méi)有特殊限制，可以是例如lng~1000ng/mL。
[0046]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括:4.發(fā)光液組分溶液:發(fā)光液可與二抗上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)，使得反應(yīng)發(fā)出儀器可檢測(cè)到的化學(xué)光。發(fā)光液由兩種溶液混合而成，分別是A液一過(guò)氧化氫溶液，及B液一發(fā)光氨溶液。發(fā)光氨(魯米諾)只有用氧化劑處理過(guò)才會(huì)發(fā)光。通常使用雙氧水和一種氫氧化物堿的混合水溶液作為激發(fā)劑。在辣根過(guò)氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水:
2 H2O2 — O2 + 2 H2O
魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時(shí)生成了一個(gè)雙負(fù)離子，它可被過(guò)氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個(gè)有機(jī)過(guò)氧化物。該過(guò)氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮?dú)?，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長(zhǎng)位于可見(jiàn)光的藍(lán)光部分。發(fā)光液組分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal? ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate,貨號(hào) 37074。
[0047]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括:
5.一個(gè)或兩個(gè)以上的反應(yīng)腔體(例如中國(guó)專利授權(quán)公告CN202054829U)。
[0048]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括:
6.其他用于檢測(cè)干燥綜合征的檢測(cè)分子(例如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等)。
[0049]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括:
7.使用說(shuō)明書(shū)。
[0050]
實(shí)施例
[0051]以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。通過(guò)本說(shuō)明書(shū)的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾/改變，這些包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0052]_
1.30肽的制備與確認(rèn)
實(shí)施例中使用的20肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，由吉爾生化(上海)有限公司合成，該多肽的表征圖譜見(jiàn)圖2和圖3，可以確認(rèn)合成了所述多肽。
[0053]
2-檢測(cè)器件的制備
檢測(cè)芯片是以SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)為固體支撐材料，在其上通過(guò)點(diǎn)樣固定多肽溶液制備而成。改性硅膠是在傳統(tǒng)的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發(fā)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑，并通過(guò)熱交聯(lián)(硅氫鍵鍵合)固定到聚二甲基硅氧烷的三維結(jié)構(gòu)中，得到一種新的材料即SJ改性硅膠。其制作過(guò)程如圖4所示。
[0054]其中的A和B為聚二甲基硅氧烷的兩個(gè)組分，聚二甲基硅氧烷(Poly (dimethylsiloxane), Sylgard 184)購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)道康寧(DowCorning)公司，包含液態(tài)組分A (成分為金屬鉬催化劑與帶乙烯基的二甲硅氧烷高分子前體混合物)和交聯(lián)劑B (成分為帶有乙烯基和S1-H基團(tuán)的二甲基硅氧烷前體)兩種成分。C為末端帶乙烯基的引發(fā)劑，購(gòu)于杭州東偉公司。最后修飾上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯單體(Oligo (ethylene glycol) methacrylate,以下簡(jiǎn)稱 0EGMA,分子量 Mw = 526)購(gòu)買(mǎi)于Aldrich。將聚二甲基硅氧烷前體A和交聯(lián)劑B與帶乙烯基末端的引發(fā)劑C以A:B:C=10:1:0.5比例充分混合。通過(guò)固化反應(yīng)制成透明的彈性硅橡膠，然后通過(guò)SIP技術(shù)進(jìn)行表面修飾即可得到SJ改性硅膠。實(shí)驗(yàn)表明，SJ改性硅膠的表面有足夠高密度的、通過(guò)共價(jià)鍵固定的引發(fā)劑，其可以通過(guò)表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP)實(shí)現(xiàn)表面高分子修飾。使用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)進(jìn)行反應(yīng)獲得聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)修飾的表面，實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的抗蛋白非特異性吸附的能力。
[0055]制好的SJ改性硅膠薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0056]采用晶芯?PersonalArrayerTM 16個(gè)人點(diǎn)樣儀在改性硅膠上制備多肽微陣列，過(guò)程為:
1)預(yù)處理
將SJ改性硅膠薄片(15 X 15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗3次，用氮?dú)獯蹈?，馬上用于點(diǎn)樣。
[0057]2)點(diǎn)樣
將點(diǎn)樣液稀釋好并轉(zhuǎn)移到384孔板相應(yīng)的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點(diǎn)樣儀基臺(tái)上，同時(shí)將預(yù)處理的改性硅膠薄片置于點(diǎn)樣儀的基臺(tái)上，馬上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境條件為室溫(25°C)，濕度設(shè)定為50%。制成的多肽微陣列上每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)樣量約為0.6nL，樣點(diǎn)半徑為200 μ m。 [0058]3)化學(xué)固定
剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱(26°C，60%濕度)中固定至少6h。化學(xué)固定過(guò)程如圖5所不。
[0059]首先通過(guò)點(diǎn)樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點(diǎn)在改性硅膠薄膜上，接著緩沖液開(kāi)始蒸發(fā)，捕獲多肽分子與SJ改性硅膠表面親密接觸并相互作用，通過(guò)化學(xué)結(jié)合，改性硅膠表面的ploy (OEGMA)高分子的末端-C00H與多肽分子的-一NH2形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，進(jìn)而將有化學(xué)活性的多肽分子固定在SJ改性硅膠表面。
[0060]5)裝配
固定6h的多肽微陣列必須在兩天內(nèi)裝配好。首先通過(guò)背膠將SJ改性硅膠薄片貼在專門(mén)的反應(yīng)柱上，蓋上反應(yīng)腔體。一個(gè)反應(yīng)器由兩個(gè)反應(yīng)柱和一個(gè)反應(yīng)腔體組成。
[0061]6)保存
裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，備用。
[0062]
3-用檢測(cè)器件進(jìn)行檢測(cè) 檢驗(yàn)步驟
1、開(kāi)始檢測(cè)前，將濃縮清洗液按1:10的比例加入純化水或蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋完成后直接使用。使用移液槍將2mL清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分鐘，保證芯片表面被完全浸潤(rùn)。
[0063]2、將待測(cè)血清樣本用樣本稀釋液按照1:40稀釋混勻。
[0064]3、棄去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全濕潤(rùn)的狀態(tài)下，每個(gè)血清樣本吸取200 μ L稀釋后的血清加入到芯片反應(yīng)器內(nèi)。
[0065]4、將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開(kāi)啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。[0066]5、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的血清樣本，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。
[0067]6、清洗完成后，每個(gè)芯片反應(yīng)器分別加入200 μ L酶標(biāo)抗體溶液，將芯片反應(yīng)器放入芯片固定座，放到搖床上，開(kāi)啟搖床，頻率150轉(zhuǎn)/分鐘，室溫孵育30分鐘。
[0068]7、棄去芯片反應(yīng)器內(nèi)的酶標(biāo)抗體溶液，用15mL洗液清洗反應(yīng)腔體和芯片表面3次。
[0069]8、清洗完成后，取下反應(yīng)腔體，每個(gè)芯片表面分別加入15 μ L發(fā)光底物液，使發(fā)光液能均勻的鋪于芯片表面。
[0070]9、將加入了發(fā)光液的芯片置于凝膠成像儀中化學(xué)發(fā)光成像，并判讀結(jié)果。
[0071]干燥綜合征病人血清來(lái)源于沈陽(yáng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，均為臨床確診了的干燥綜合征病病人血清。血清由相關(guān)人員用冰塊/干冰等包裹運(yùn)送或快遞至實(shí)驗(yàn)室。
[0072]陰性對(duì)照有PBS緩沖液(即在第3步中不用待測(cè)血清孵育,而用PBS溶液孵育,其余步驟相同)的對(duì)照，血清稀釋液的對(duì)照，及陰性病人(指健康人血清及非干燥綜合征病人)血清的對(duì)照。
[0073]多肽微陣列的點(diǎn)樣模式如圖6所示。其中，三角形的20個(gè)點(diǎn)的樣本為人IgG，作為實(shí)驗(yàn)的定位點(diǎn)；正方形的4個(gè)點(diǎn)的樣本為PB點(diǎn)樣液，作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照；圓形點(diǎn)的的樣本是其他的干燥綜合征自身抗原蛋白多肽，作為實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo)(這些多肽有響應(yīng)說(shuō)明檢測(cè)血清中有干燥綜合征自身抗體)；星形點(diǎn)的樣本多肽即為本發(fā)明的多肽SEQ ID N0:1，它是干燥綜合征自身抗原蛋白多肽，會(huì)對(duì)干燥綜合征患者血清產(chǎn)生響應(yīng)。
[0074]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7和圖8所示。其中，圖7顯示了陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果，只有三角形所示的點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。圖8顯示了干燥綜合征病人血清的檢測(cè)結(jié)果，三角形、圓形和星形點(diǎn)的樣本有響應(yīng)。需要說(shuō)明的是 ，儀器測(cè)得信號(hào)值由低到高，相應(yīng)的信號(hào)點(diǎn)顏色由黑一紅一白漸變。
【權(quán)利要求】
1.由SEQID NO:1所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
2.編碼權(quán)利要求1所述的多肽的核酸。
3.包含權(quán)利要求2所述的核酸的表達(dá)載體。
4.導(dǎo)入了權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
5.一種檢測(cè)器件，其包括: 固體載體，以及 連接于該固體載體上的權(quán)利要求1所述的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
7.—種檢測(cè)試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的多肽、或者權(quán)利要求5或6所述的檢測(cè)器件。
8.抗權(quán)利要求1所述的多肽的抗體。
9.權(quán)利要求1所述 的 多肽在制備用于檢測(cè)干燥綜合征的試劑盒或檢測(cè)器件中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103880927SQ201210560382
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】劉星, 馬雄明, 章為江 申請(qǐng)人:蘇州偲聚生物材料有限公司