用于檢測(cè)肽/mhc/tcr結(jié)合的方法
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)肽/MHC/TCR結(jié)合的方法 相關(guān)申請(qǐng)
[0001] 本申請(qǐng)要求2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/800, 891的優(yōu)先權(quán)， 實(shí)際上其內(nèi)容通過(guò)引用完全包含在本申請(qǐng)中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，且涉及免疫系統(tǒng)中的蛋白相互作用。具體而言，本發(fā)明涉 及肽-MHC相互作用以及檢測(cè)其相互作用的方法和組合物。
【背景技術(shù)】
[0003] 免疫學(xué)從根本上關(guān)注宿主和免疫原之間的相互作用，宿主是其免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng) 的生物體，免疫原是該反應(yīng)所針對(duì)的物質(zhì)。這種相互作用的結(jié)果決定了宿主的命運(yùn)：形成致 病性免疫，腫瘤；形成改變自身免疫原，癌癥；形成自身免疫原，自身免疫性；以及形成無(wú)害 的環(huán)境免疫原，過(guò)敏。DNA測(cè)序能力的改進(jìn)為在高分辨率和寬覆蓋范圍探索這些不同免疫結(jié) 果的遺傳基礎(chǔ)提供了工具，可參考宿主和免疫原的基因組（Peng et al.，2009，Curr.0pin. Microbiol. 12:432-438 ；Benichou et al. , 2012, Immunology 135:183-191)〇
[0004] 宿主和免疫原之間最重要的蛋白質(zhì)界面之一是肽：主要組織相容性（p:MHC)復(fù)合 物，其包括與免疫原-衍生肽物理結(jié)合的宿主編碼的跨膜蛋白（MHC)。該復(fù)合物提供了兩個(gè) 平行的抗原傳遞系統(tǒng)：（1)細(xì)胞內(nèi)途徑，其中內(nèi)源蛋白質(zhì)被加工成短肽，例如，大約7-10個(gè) 氨基酸的肽，且由所有的有核細(xì)胞在MHC I類(lèi)復(fù)合體中傳遞；和（2)內(nèi)體途徑，其中被吞噬 的外源蛋白被加工成大約10-25個(gè)氨基酸且通過(guò)專門(mén)的抗原傳遞細(xì)胞在MHC II類(lèi)復(fù)合體 中傳遞（Germain, 1994, Cell 76:287-299)。一旦傳遞給這些途徑之一的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)， 免疫原-衍生肽能觸發(fā)高度抗原特異性應(yīng)答，例如，細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)應(yīng)體液免疫應(yīng)答，或免 疫原反應(yīng)對(duì)應(yīng)致耐受性反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 公開(kāi)了用于檢測(cè)肽/MHC結(jié)合的方法和組合物。本文提供了 MHC結(jié)合肽偶聯(lián)多核 苷酸。在某些實(shí)施例中，多核苷酸可以是DNA, cDNA，RNA，mRNA，rRNA，tRNA，PNA，DNA樣分子 或RNA樣分子。
[0006] 還提供了至少兩個(gè)偶聯(lián)多核苷酸的MHC-結(jié)合肽的文庫(kù)，其中每個(gè)多核苷酸由特 異性結(jié)合所述多核苷酸的探針來(lái)鑒定。在某些實(shí)施例中，多核苷酸和探針可以是DNA，cDNA ，RNA, mRNA, rRNA, tRNA, PNA, DNA 樣分子或 RNA 樣分子。
[0007] 本發(fā)明提供了包含至少兩個(gè)偶聯(lián)多核苷酸的MHC-結(jié)合肽的組合物，所述至少兩 個(gè)MHC-結(jié)合肽是多聚的或寡聚的。一方面，至少兩個(gè)MHC-結(jié)合肽被相同的多核苷酸偶聯(lián)且 因此多聚或寡聚。在其它實(shí)施例中，至少兩個(gè)MHC-結(jié)合肽各自偶聯(lián)一個(gè)單獨(dú)的多核苷酸， 其中多核苷酸介導(dǎo)至少兩個(gè)MHC-結(jié)合肽的多聚化或寡聚化。在一些實(shí)施例中，多聚化或寡 聚化通過(guò)核苷酸序列的互補(bǔ)性來(lái)調(diào)解。
[0008] 在一個(gè)實(shí)施例中，公開(kāi)了用于檢測(cè)肽與MHC分子的結(jié)合的方法。所述方法包括：用 多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物接觸MHC分子，所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物包括所述肽和多聚核苷 酸；用特異結(jié)合所述多聚核苷酸的探針接觸所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物；檢測(cè)所述探針與 所述多聚核苷酸的結(jié)合；以及，使所述探針與所述多聚核苷酸的結(jié)合和所述肽與所述MHC 分子的結(jié)合相互關(guān)聯(lián)。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于同時(shí)檢測(cè)肽庫(kù)與MHC分子的結(jié)合的方法。所述方 法包括：將多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物提供給每個(gè)所述肽，所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物包括所述 肽和多聚核苷酸；用所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物池接觸所述MHC分子；用特異性結(jié)合每條 所述的多聚核苷酸的探針接觸每個(gè)所述的多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物；檢測(cè)所述探針與每條特 異性結(jié)合每個(gè)所述探針的相應(yīng)多聚核苷酸的結(jié)合；以及使所述探針和每條相應(yīng)多聚核苷酸 的結(jié)合與每條相應(yīng)的肽和MHC分子的結(jié)合相互關(guān)聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步 包括對(duì)比結(jié)合，例如，在所述的肽庫(kù)中的肽之間，以每條所述的肽和MHC分子的結(jié)合特異性 和/或結(jié)合親和性的方式進(jìn)行對(duì)比結(jié)合。
[0010] 而在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于在肽庫(kù)中檢測(cè)每條所述的肽與MHC 分子的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的方法，包括：將多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物提供給每條所述的肽，所述多聚 核苷酸-肽偶聯(lián)物包括所述肽和多聚核苷酸；用所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物池接觸所述 MHC分子；用特異性結(jié)合每條所述的多聚核苷酸的探針接觸每個(gè)所述的多聚核苷酸-肽偶 聯(lián)物；檢測(cè)所述探針與每條特異性結(jié)合每個(gè)所述探針的相應(yīng)的多聚核苷酸的結(jié)合；以及使 所述探針和每條相應(yīng)的多聚核苷酸的結(jié)合與每條相應(yīng)的肽和MHC分子的結(jié)合相互關(guān)聯(lián)，其 中所述肽競(jìng)爭(zhēng)地與所述MHC分子結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)比結(jié)合， 例如，在所述的肽庫(kù)中的肽之間，以每條所述的肽和MHC分子的結(jié)合特異性和/或結(jié)合親和 性的方式進(jìn)行對(duì)比結(jié)合。
[0011] 一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)肽與τ細(xì)胞結(jié)合的方法，包括：用MHC分子和 多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物接觸所述T細(xì)胞，所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物包括所述肽和多聚核 苷酸；用特異性結(jié)合所述多聚核苷酸的探針接觸所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物；檢測(cè)所述探 針和所述多聚核苷酸的結(jié)合；以及，使所述探針和所述多聚核苷酸的結(jié)合與所述肽與所述 T細(xì)胞的結(jié)合相互關(guān)聯(lián)。
[0012] 另一方面，提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)肽庫(kù)與T細(xì)胞結(jié)合的方法。該方法包括：將多 聚核苷酸-肽偶聯(lián)物提供給每條所述的肽，所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物包括所述肽和多聚 核苷酸；用所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物池和MHC分子接觸所述T細(xì)胞；用特異性結(jié)合每條所 述的多聚核苷酸的探針接觸每個(gè)所述的多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物；檢測(cè)所述探針與每條特異 性結(jié)合每個(gè)所述探針的相應(yīng)的多聚核苷酸的結(jié)合；以及使所述探針和每條相應(yīng)的多聚核苷 酸的結(jié)合與每條相應(yīng)的肽和所述T細(xì)胞的結(jié)合相互關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所述的 肽與所述T細(xì)胞的TCR結(jié)合。
[0013] 而另一方面，本發(fā)明描述了一種用于檢測(cè)肽庫(kù)中每條所述的肽與T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性結(jié) 合的方法，包括將多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物提供給每條所述的肽，所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物 包括所述肽和多聚核苷酸；用所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物池和MHC分子接觸所述T細(xì)胞；用 特異性結(jié)合每條所述的多聚核苷酸的探針接觸每個(gè)所述的多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物；檢測(cè)所 述探針與每條特異性結(jié)合每個(gè)所述探針的相應(yīng)的多聚核苷酸的結(jié)合；以及使所述探針和每 條相應(yīng)的多聚核苷酸的結(jié)合與每條相應(yīng)的肽和所述T細(xì)胞的結(jié)合相互關(guān)聯(lián)，其中所述肽競(jìng) 爭(zhēng)地與所述MHC分子和所述Τ細(xì)胞結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所述的肽與所述Τ細(xì)胞 的TCR結(jié)合。
[0014] 在任一實(shí)施例或其任一組合中，所述TCR可以是Τ細(xì)胞上的TCR，可溶的TCR，被分 離的TCR，和被固定的TCR。TCR的任何功能性片段或部分也被包含在本發(fā)明中。
[0015] 在任一實(shí)施例或其任一組合中，本發(fā)明所述的方法可以進(jìn)一步包括用對(duì)照與檢測(cè) 到的所述肽與所述MHC分子、所述Τ細(xì)胞、或所述TCR的結(jié)合相比較。在進(jìn)一步的實(shí)施例中， 在任一實(shí)施例或其任一組合中所公開(kāi)的本發(fā)明所述的方法進(jìn)一步包括基于識(shí)別感染、自身 免疫、過(guò)敏、或癌癥中的抗原的目的、或基于設(shè)計(jì)疫苗的目的，通過(guò)對(duì)照選擇檢測(cè)到的所述 肽的結(jié)合。
[0016] 在任一實(shí)施例或其任一組合中，所述多聚核苷酸和所述探針選自由DNA、cDNA、 RNA、mRNA、rRNA、tRNA、PNA、類(lèi)DNA分子或類(lèi)RNA分子組成的組。在任一實(shí)施例或其任一組 合中，所述探針與所述多聚核苷酸的結(jié)合可以通過(guò)凝膠電泳、雜交、PCR、qPCR、或核苷酸測(cè) 序檢測(cè)。
[0017] 在任一實(shí)施例或其任一組合中所公開(kāi)的本發(fā)明的所述方法中，所述MHC分子可以 是被固定的。在另一個(gè)實(shí)施例中，在任一所述實(shí)施例或其任一組合中所公開(kāi)的本發(fā)明的所 述方法中的所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物是多聚化的或寡聚化的。而在另一個(gè)實(shí)施例中，本 發(fā)明的所述方法是以高通量的方式進(jìn)行的。
[0018] 在本發(fā)明公開(kāi)的任一實(shí)施例中，現(xiàn)有公開(kāi)的方法進(jìn)一步包括下述步驟的一步或多 步：使所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物和所述MHC分子之間結(jié)合以達(dá)到平衡；在適宜的條件下 洗滌所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物和所述MHC分子之間形成的復(fù)合物以去除未結(jié)合的或非 特異性結(jié)合的多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物；使所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物和所述MHC分子之間 的復(fù)合物分離，例如，在一個(gè)合適的時(shí)間段內(nèi)；以及檢測(cè)仍然結(jié)合在MHC分子上的多聚核苷 酸-肽偶聯(lián)物。
[0019] 在前述任一實(shí)施例中，可以在一種或多種阻斷劑存在的情況下讓所述多聚核苷 酸-肽偶聯(lián)物和所述MHC分子之間的復(fù)合物分離。一方面，所述一種或多種阻斷劑阻止所 述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物和所述MHC分子結(jié)合或重新組合。在某些實(shí)施例中，所述阻斷劑 與所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至所述MHC分子。一方面，所述阻斷劑與MHC復(fù)合 物之間的結(jié)合并不產(chǎn)生所述多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物與所述MHC分子之間特異性結(jié)合的指示 信號(hào)。
[0020] 在本文公開(kāi)的任一實(shí)施例中，在一個(gè)或多個(gè)分子伴侶存在的情況下可能發(fā)生所述 多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物與所述MHC分子的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，所述分子伴侶選自由伴 侶蛋白、化學(xué)伴侶、HLA-DM及其類(lèi)似物、具有與HLA-DM相同或相似伴侶功能的小分子、對(duì)氯 苯酚（PCP)及其類(lèi)似物、以及二甲亞砜（DMS0)和其類(lèi)似物組成的組。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1 (上半部分）表示多元肽-MHC結(jié)合分析。在匯集的結(jié)合區(qū)域針對(duì)一組用計(jì)算 機(jī)編程的肽-cDNA偶聯(lián)物測(cè)試MHC分子。結(jié)合上的肽通過(guò)高通量DNA測(cè)序鑒定，其具有的 動(dòng)力學(xué)范圍能顯示出差異競(jìng)爭(zhēng)性的MHC結(jié)合劑的范圍（此處說(shuō)明：按順序三角形>圓形> 方形）。
[0022] 圖1(下半部分）表示用于T細(xì)胞特異性檢測(cè)的多元分析。將MHC分子與多價(jià) 肽-cDNA偶聯(lián)物以及包含T細(xì)胞的生物樣品孵育。然后將結(jié)合了肽cDNA:MHC復(fù)合物的T 細(xì)胞分離并用高通量測(cè)序檢測(cè)。
[0023] 圖2表示采用匯集的"特征肽（eigenpeptides) "來(lái)報(bào)告?zhèn)€體的HLA信息的多元 肽-MHC結(jié)合分析的使用。將HLA分子從具有不同HLA基因型的捐獻(xiàn)者的血液中分離出來(lái)， 并針對(duì)肽-cDNA偶聯(lián)物的復(fù)合物池將其進(jìn)行測(cè)試。借助于IEDB，用肽上的結(jié)合HLA分子的 重點(diǎn)區(qū)域盡可能獨(dú)特地（"特征肽（eigenp印tides)"）設(shè)計(jì)該復(fù)合物池以覆蓋所有列出的 人類(lèi)單倍體型。結(jié)合上的肽-cDNA偶聯(lián)物的下一代測(cè)序提供關(guān)于存在的HLA分子的信息。 在這一實(shí)施例中，兩個(gè)被描述的個(gè)體共享他們2種HLA單倍體型中的一種。
[0024] 圖3a表示一種制備肽-cDNA池的典型方法。在計(jì)算機(jī)中設(shè)計(jì)出革E1標(biāo)的寡核苷 酸序列，在微陣列中通過(guò)平行合成低成本地將所述序列制備出來(lái)并釋放，然后將其轉(zhuǎn)化至 肽-cDNA偶聯(lián)物中。
[0025] 圖3b表示蛋白酶分析。將肽-cDNA偶聯(lián)物池固定在磁珠上，用蛋白酶處理，并通 過(guò)對(duì)釋放的cDNA測(cè)序來(lái)檢測(cè)被蛋白酶切除后剩余的部分。
[0026] 圖4表示肽-cDNA偶聯(lián)物與MHC分子的序列特異性結(jié)合。將肽-cDNA偶聯(lián)物與 序列 YKTIAFDEEARR( "YK"）（SEQ ID N0:1)或 YPKYVKQNTLKLAT( "YP"）（SEQ ID N0:2)孵 育或單獨(dú)放置（"空白"），或者在生物素化的HLA-DR1( "DR1"）或HLA-DR3( "DR3"）MHC 分子存在的情況下進(jìn)行上述孵育。孵育之后，結(jié)合復(fù)合物在鏈霉親和素磁珠上被捕獲、沖 洗、并洗脫。被洗脫的DNA通過(guò)凝膠電泳（a)顯影，并用qPCR(b)進(jìn)行定量。已知肽序列 YKTIAFDEEARR(SEQ ID N0:1)和 YPKYVKQNTLKLAT(SEQ ID N0:2)分別與 DR3 和 DR1 分子結(jié) 合。
[0027] 圖5表示肽-cDNA偶聯(lián)物與MHC分子的多重結(jié)合。通過(guò)來(lái)自DNA模 板的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯制備出具有序列YPKYVKQNTLKLAT( "YP(WT) "）（SEQ ID NO:3)，YPKYVKQNTLKLAA( "YP(T14A)"）（SEQ ID NO:4)和 YPKAVKQNTLKLAT( "YP(Y4A)"） (SEQ ID NO: 5)的肽-cDNA偶聯(lián)物。然后將上述三種肽-cDNA偶聯(lián)物與生物素標(biāo)記的 HLA-DR1( "DR1")MHC分子分別孵育（"1-叢"）（"Ι-plex"）或等比例混合孵育（"3-叢"） ("3-plex"）。孵育后，在鏈霉親和素磁珠上捕獲結(jié)合復(fù)合物，并將其洗滌并洗脫。洗脫后 的 DNA 用 qPCR 定量。肽 YPKYVKQNTLKLAT(SEQ ID N0:3)，YPKYVKQNTLKLAA(SEQ ID N0:4) 和YPKAVKQNTLKLAT(SEQ ID N0:5)與DR1分子的結(jié)合分別顯示出高、高和低親和性。
[0028] 圖6表示根據(jù)本發(fā)明特定實(shí)施例記載的用于檢測(cè)特異性肽：MHC結(jié)合的分析條件。
[0029] 圖7表示根據(jù)本發(fā)明特定實(shí)施例記載的在多聚核苷酸-肽偶聯(lián)物池中檢測(cè)特異性 肽：MHC結(jié)合。
[0030] 圖8表示根據(jù)本發(fā)明特定實(shí)施例記載的利用延伸實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特異性肽：MHC結(jié)合。

【發(fā)明內(nèi)容】
A.定義
[0031] 除非另有規(guī)定，本文中使用的所有技術(shù)名詞、符號(hào)和其它技術(shù)與科技術(shù)語(yǔ)或用辭 意為具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。在一些實(shí)例中，具有普遍理 解的含義的術(shù)語(yǔ)出于清楚和/或便覽的目的在本文中被定義，并且本文中這種定義的內(nèi)容 不應(yīng)當(dāng)被必然地解釋為表示出與本領(lǐng)域普遍理解的含義實(shí)質(zhì)的不同。大部分本文記載或涉 及的技術(shù)和工藝能被本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地理解并利用常規(guī)的方法論進(jìn)行常規(guī)使用。
[0032] 出于每份出版物通過(guò)引用被個(gè)別并入的同等的目的，所有與本申請(qǐng)有關(guān)的出版 物，包括專利文件、科技文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，以及參考書(shū)目和附加文件通過(guò)引用的方式將其全部 內(nèi)容并入。如果本文提出的某個(gè)定義與本文通過(guò)引用被并入的專利、申請(qǐng)、公開(kāi)的申請(qǐng)和其 它出版物中列出的定義矛盾或不一致，則以本文提出的定義為準(zhǔn)。
[0033] 盡管與本文記載的相似或相同的方法或材料可以被用于實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明，但適 當(dāng)?shù)姆椒ㄅc材料如下文所示。所述材料、方法和實(shí)例僅僅是說(shuō)明性的，且并不用它們來(lái)限制 本發(fā)明。本發(fā)明的其它特征對(duì)于下面的詳細(xì)說(shuō)明和權(quán)利要求是顯而易見(jiàn)的。在本文提供的 特定實(shí)施例的下述說(shuō)明中，將結(jié)合附圖進(jìn)行說(shuō)明，所述附圖構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，并且在所 述附圖中通過(guò)圖解的方式說(shuō)明，在特定的實(shí)施例中可以實(shí)踐本發(fā)明?？梢岳斫獾氖?，可以使 用其它實(shí)施例并在不脫離本發(fā)明范圍的條件下做一些結(jié)構(gòu)上的改動(dòng)。
[0034] 所提供的實(shí)施例的實(shí)踐將采用屬于本領(lǐng)域技術(shù)的分子生物學(xué)和諸如此類(lèi)的常規(guī) 技術(shù)，除非另有說(shuō)明。下述文獻(xiàn)充分說(shuō)明了此類(lèi)技術(shù)。參見(jiàn)例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989) ；Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al. eds. , 1987and updated) ；Essential Molecular Biology (T. Brown ed. , IRL Press 1991) ；Gene Expression Technology(Goeddel ed., Academic Press 1991) ；Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds. , Bartlett Publ. 1990) ；Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990)； Recombinant DNA Methodology(R. ffu et al. eds. , Academic Press 1989) ；PCR:A Practical Approach(M. McPherson et al. , IRL Press at Oxford University Press 1991) ；Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990) ；Mammalian Cell Biotechnology(M. Butler ed. ,1991) ；Animal Cell Culture(J. Pollard et al. eds. , Humana Press 1990) ；Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al. eds. , Alan R. Liss 1987) ；Flow Cytometry and Sorting(M. Melamed et al. eds.,ffiley-Liss 1990) ； the series Methods in Enzymology (Academic Press,Inc.) ^Techniques in Immunocytochemistry, (G.Bullock&P.Petrusz eds. ，Academic Press 1982， 1983， 1985， 1989) ;Handbook of Experimental Immunology, (D. ffeir&C. Blac