專利名稱：草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶及編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽及編碼序列，具體是涉及到從土壤宏基因組中分離克隆的一個草甘膦耐受型EPSPS編碼序列和蛋白產(chǎn)物，本發(fā)明還涉及此EPSPS的制備和用途，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
莽草酸途徑是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途徑。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5_enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase (EPSPS) (EC2. 5. I. 19)〕是莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草劑草甘膦是PEP的結(jié)構(gòu)類似物，能與PEP競爭性抑制EPSPS的活性，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，最終導(dǎo)致植物死亡。有些微生物來源的 EPSPS不受草甘膦抑制，具有草甘膦抗性，這一途徑是生物產(chǎn)生草甘膦抗性的被動方式。草甘膦作為一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，自1974年在美國注冊登記以來，至今已在世界100多個國家注冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種(任不凡等，1998)。對大多數(shù)植物具有滅生性等其它除草劑不可比擬的優(yōu)點。草甘膦作為一種滅生性除草劑，對農(nóng)作物同樣具有滅殺作用，這就限制了其使用范圍和使用時間。如果能選育出抗草甘膦或降解草甘膦的農(nóng)作物新品種，則既能顯著節(jié)省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)費用，又能極大地促進草甘膦工業(yè)的發(fā)展。目前，我國尚無進入商品化階段的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物，培育我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物具有迫切性。土壤微生物中蘊藏著極其豐富的基因資源，但由于在絕大多數(shù)人為創(chuàng)造的環(huán)境中，可培養(yǎng)的細菌數(shù)量非常有限，通常低于I %。因此，人們對土壤基因資源寶庫的了解和利用還十分有限。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和微生物學(xué)研究手段的進步，宏基因組學(xué)為我們研究環(huán)境微生物(特別是目前尚不可培養(yǎng)的微生物)提供了手段。通過直接從環(huán)境中提取和克隆基因組DNA，理論上可以獲得任何功能的基因序列。直接克隆基因組為我們獲得操縱子或由復(fù)雜分子直接合成物質(zhì)(例如抗生素)提供了機會，本發(fā)明提供的編碼EPSPS的基因就是從土壤宏基因組中分離克隆得到的。目前，國際上使用的抗草甘膦基因主要是美國Monsanto公司從農(nóng)桿菌CP4中分離的cp4-EPSPS基因。Monsanto公司擁有cp4_EPSPS基因的多項專利，其專利覆蓋了抗草甘膦基因CP4-EPSPS的重要變異位點。本專利公開的抗草甘膦基因不存在Monsanto公司EPSPS基因?qū)＠?專利號US 5804425,200480009843. 2)覆蓋的氨基酸的變異位點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(以下簡稱為EPSPS)多肽及其編碼序列，其編碼的蛋白具有較強的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的活性，并具有良好的草甘膦抗性。本發(fā)明公開的一種5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽，其特征在于
具有如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在SEQ ID No. I限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一個或多個氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽。本發(fā)明公開的一種編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽的編碼序列，其特征在于
具有如SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列，具有編碼如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的多核苷酸序列中取代、缺失、添加一個或多個堿基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的編碼序列。本發(fā)明公開一種載體，其特征在于，它含有如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸。本發(fā)明公開一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸的載體。本發(fā)明公開一種具有EPSPS活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含 Ca)在適合的表達條件下，培養(yǎng)含有如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸載體的宿主細胞； (b)從培養(yǎng)物里分離出具有EPSPS活性的多肽。本發(fā)明公開一種改變植物草甘膦抗性的方法，其特征在于包括以下步驟
(O攜帶如SEQ ID No. 2所述的多核苷酸的載體的農(nóng)桿菌；
(2)利用步驟(I)所述的農(nóng)桿菌侵染植物的細胞，組織或者器官；
(3)檢測步驟(2)中植物的細胞、組織或者器官，將在其基因組中含有如SEQID No. 2所述的多核苷酸的細胞、組織或者器官再生成植株。本發(fā)明的EPSPS編碼序列是從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春院區(qū)周邊采集的土樣中分離土壤宏基因組DNA獲得的。通過土壤DNA的分離、提取、重組等遺傳工程技術(shù)構(gòu)建了土壤宏基因組文庫，并在含有草甘膦抗性的M9極限培養(yǎng)基上篩選、分離、鑒定了該基因在大腸桿菌中對草甘膦的抗性。進一步的草甘膦抗性實驗發(fā)現(xiàn)，攜帶該基因的大腸桿菌能夠耐受1200mg/L以上的草甘膦濃度。將該基因按照植物密碼子偏好性進行優(yōu)化后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入受體植株煙草中，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株最高能夠耐受600mg/L的草甘膦除草齊U，是大田使用濃度的3-6倍。因為密碼子存在兼并性，同時不同物種間存在著密碼子偏好性的差異。因此，在確保其編碼蛋白如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列不變的前提下，可以通過密碼子偏好性優(yōu)化軟件對SEQ ID No. 2中所示的核苷酸序列進行優(yōu)化與修改而不影響該基因的作用。同時，由于修改SEQ ID No. I所示的氨基酸序列中的若干氨基酸序列，包括添加細胞定位引導(dǎo)肽等，也不會影響該基因的活性。因此，本發(fā)明還包含對具有如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一個或多個氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶；具有如SEQ ID No. 2所示的堿基序列，具有編碼如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一個或多個堿基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的編碼基因。具有如SEQID No. 3所示的堿基序列或具有編碼如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或者對依據(jù)SEQID No. I所示的氨基酸序列及其衍生物采用其它密碼子優(yōu)化原則對編碼堿基序列進行修飾的核酸序列。本發(fā)明的積極效果還在于
提供所述的克隆載體或表達載體，以及其轉(zhuǎn)化的宿主細胞。其宿主細胞可以為原·核細胞、植物細胞、植物組織等，其中大腸桿菌的宿主細胞可因攜帶該基因而耐受濃度為1200mg/L的草甘膦。攜帶該酶編碼序列的煙草宿主細胞可耐受濃度為600mg/L的草甘膦。本發(fā)明提供的基因和表達載體可用于農(nóng)作物的遺傳修飾，達到使植物耐受草甘膦除草劑的目的。


圖I為實施例I中提取 土壤總DNA的電泳結(jié)果；
圖2為實施例2中SoilA的PCR擴增結(jié)果；
圖3為含實施例2中SoilA片段的載體pSYTH-SoilA的machl的細胞耐受草甘膦實驗
結(jié)果;
圖4為實施例2中攜帶載體pSYTH-SoilA和載體pSYTH的大腸桿菌細胞在不同草甘膦濃度的M9培養(yǎng)基中的生長狀況；
圖5為實施例3中載體pCAMBIA330E的PCR檢測結(jié)果，其中I :Marker 200bp ladder,
2pCAMBIA330E 的 PCR 產(chǎn)物；
圖6為實施例3煙草轉(zhuǎn)基因再生植株的PCR檢測結(jié)果；
圖7為實施例3煙草野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株噴灑草甘膦前；
圖8為實施例3煙草野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株噴灑草甘膦后。
具體實施例方式以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例I
編碼草甘膦抗性EPSPS多核苷酸序列的獲得
I、土壤總DNA的分離純化稱取2. 5g吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春院區(qū)周邊的土壤樣品，放入50mL離心管中，加入6750 μ L DNA提取液(DNA提取液IOOmmol / Tris-HCl,IOOmmol / L EDTA, IOOmmol / L Na3P04,1. 5mol / L NaCl, 1% CTAB, ρΗ8·0)，混勻(或在渦旋震蕩器上震蕩幾秒)，然后加入5(^1^蛋白酶1((101^ / mL)，37°C水浴30min，每隔3 5 min上下顛倒混勻。加入750 μ L 20% SDS，65°C水浴2h，每隔15 20 min輕輕顛倒重懸；-70°C冷凍，然后65°C水浴融化，反復(fù)3次；室溫6000g離心lOmin，收集上清于一新的50mL離心管中。土壤沉淀中加入2250 μ L DNA提取液和25 μ L的20% SDS，渦旋10s，65°C水浴IOmin,室溫6000g離心10 min,合并上清液；向上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇(24 1)并混勻；12000g離心10 11^11，上層液轉(zhuǎn)移至一新501^離心管中，然后加入0.6倍(V / V)異丙醇，室溫沉淀lh;16000g離心20 min，棄上清收集沉淀。用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀兩次，沉淀干燥后溶于50 μ L TE溶液或無菌去離子水中。通過瓊脂糖凝膠電泳去除DNA中的腐植酸，用膠回收試劑盒回收DNA。提取的土壤總DNA跑1%瓊脂糖凝膠的效果見圖I，其中I為Marker 200bp ladder, 2為土壤總DNA。2、土壤總DNA與質(zhì)粒pEAZY-Blunt Simple (簡稱pEAZYBS)的酶切與連接土壤總DNA用Not I進行部分酶切，Not I酶按I :300稀釋，37°C，酶切時間30 min,乙醇沉淀回收。質(zhì)粒載體pEAZYBS用Not I完全酶切后用SAP堿性磷酸脂酶進行末端去磷酸化，以減少載體自連。上述回收后的土壤DNA(200ng)和末端去磷酸化的質(zhì)粒載體pEAZYBS用2U的T4 DNA連接酶在16°C下連接16h。3、抗草甘膦基因EPSPS的篩選上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用CaCl2方法制備的machl TlPhage-Resistant Chemically Competent E. Coli (簡稱 Machl)感受態(tài)細胞,然后涂布含有200mg/L草甘膦的M9培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)48h。挑取單菌落并利用載體上的測序引物M13F和M13R對插入DNA片段進行測序分析。4、序列分析使用生物學(xué)軟件vector NT I對測序后的序列進行分析。利用NCBI中的blast功能進行比對分析，發(fā)現(xiàn)一個新的編碼EPSPS合成酶基因的開放閱讀框，長度為1347bp，編碼448個氨基酸。其氨基酸序列與大豆cp4_EPSPS有79%的同源性，與已經(jīng)公布的專利(US 5627061, US 5804425 ,US 5633435)序列同源性最高為79%。將新的編碼EPSPS合成酶編碼序列命名為SoilA，并將上述重組載體命名為pEAZYBS-SoilA。
實施例2
草甘膦抗性EPSPS編碼序列SoilA在大腸桿菌中的功能驗證 設(shè)計引物
Pl (5，ATGTCTCATGGATCGGGCCCG 3，)、
P2 (5，TCACGCGATCCTCGCGCCGAG 3，)，
以pEAZYBS- SoilA為模板，用高保真酶通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增，獲得1356bp的SoilA片段，見圖2 :其中I為Marker 200bp ladder，2為SoilA片段；該片段和用A^II酶切的PSYTH質(zhì)粒大片段相連接。pSYTH質(zhì)粒的構(gòu)建過程為frra-CAGCTG-TiTz^^片段(SP用人工合成的多核苷酸片段5’ -3’端依次為煙草葉綠體16^ rRNA操縱子的啟動子、Pvull酶切位點、煙草葉綠體基因的終止子)通過平末端方式連接到pEAZYBS載體上。含SoilA片段的連接產(chǎn)物用CaCl2方法制備的Machl感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，然后涂布含有200mg/L草甘膦的M9培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)48h。提取生長菌落質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確后命名為pSYTH-SoilA，并用于重新轉(zhuǎn)化Machl，培養(yǎng)帶有質(zhì)粒pSYTH-SoilA的Machl菌液，用槍頭蘸取少量菌液在200mg/L草甘膦的M9培養(yǎng)基平板上做標(biāo)記“EPSPS”，同時用含有質(zhì)粒載體pSYTH的Machl作對照標(biāo)記“CK”，37°C培養(yǎng)48h。結(jié)果見圖3，其中“EPSPS”為攜帶載體pSYTH-SoilA的大腸桿菌細胞，“CK”為攜帶載體pSYTH的大腸桿菌細胞；發(fā)現(xiàn)含有pSYTH-SoilA的Machl能夠正常生長，而含有pSYTH的Machl的載體不能正常生長。將含有pSYTH-SoilA的Machl和含有pSYTH的Machl的菌液按照1:200的比例分別接種于草甘膦濃度為0，200，400，800，1200，1600, 2000mg/L的M9液體培養(yǎng)基中，在37°C下以200rpm/min培養(yǎng)48h,檢測菌液OD值。由圖4可知(橫坐標(biāo)為草甘膦的濃度(mg/L),縱坐標(biāo)為大腸桿菌菌液的OD值)，當(dāng)草甘膦濃度低于1200mg/L時，含有pSYTH-SoilA的Machl大腸桿菌生長沒有受到明顯抑制，而含有pSYTH的Machl大腸桿菌在含有200mg/L的草甘膦的M9培養(yǎng)基上生長已經(jīng)受到嚴(yán)重限制。實施例3
草甘膦抗性EPSPS編碼基因SoilA在煙草中的功能驗證 設(shè)計引物
P3 (5，agtccatggatATGTCTCATGGATCGGGCCCG 3’)、
P4 (5，atcggtgaccTCACGCGATCCTCGCGCCGAG 3’)，以pEAZYBS-SoilA為模板，用高保真酶通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增，獲得1347bp的SoilA片段；用Nco I和訪II酶切該片段，和pCAMBIA3301質(zhì)粒相同酶切釋放的大片段相連接。驗證后的重組載體命名為PCAMBIA330E，圖5為pCAMBIA330E的PCR檢測結(jié)果，其中I為Marker 200bp ladder，2為pCAMBIA330E的PCR產(chǎn)物；凍融法將載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105，通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，如圖6經(jīng)PCR篩選鑒定后(煙草轉(zhuǎn)基因再生植株的PCR檢測結(jié)果，其中I Marker 200bp ladder, 2 :質(zhì)粒pCAMBIA330E，3 :非轉(zhuǎn)基因煙草植株，4_15 部分再生植株)獲得107株轉(zhuǎn)基因植株，移栽后噴灑草甘膦，與非轉(zhuǎn)基因煙草植株相比，均具有不同程度的草甘膦耐受性。圖7所示的植株經(jīng)濃度為600mg/L的草甘膦連續(xù)3次、每次間隔7天的噴灑后，其生長情況如圖8所示，其中ck為非轉(zhuǎn)基因植株，1-3 :轉(zhuǎn)化載體PCAMBIA330E的植株，代號為CK的非轉(zhuǎn)基因植株無法生長，已完全枯萎死亡，而3株轉(zhuǎn)基因植株(代號分別為1，2，3)能夠耐受草甘膦，均可正常生長。
權(quán)利要求
1.一種5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽，其特征在于具有如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在SEQ ID No. I限定的氨基酸序列中取代、缺失、添加一個或多個氨基酸而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽。
2.一種編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽的編碼序列，其特征在于具有如 SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列，具有編碼如SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或是在限定的多核苷酸序列中取代、缺失、添加一個或多個堿基而衍生的草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的編碼序列。
3.—種載體,其特征在于它含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
4.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述的載體。
5.一種具有EPSPS活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含Ca)在適合的表達條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物里分離出具有EPSPS活性的多肽。
6.一種改變植物草甘膦抗性的方法，其特征在于包括以下步驟(O攜帶有權(quán)利要求3所述的載體的農(nóng)桿菌；(2)利用權(quán)利要求6步驟(I)所述的農(nóng)桿菌侵染植物的細胞，組織或者器官；(3)檢測權(quán)利要求6步驟(2)中植物的細胞，組織或者器官，將在其基因組中含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸的再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開一種草甘膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽及編碼序列，其宿主細胞可以為原核細胞、植物細胞、植物組織等，其中大腸桿菌的宿主細胞可因攜帶該基因而耐受濃度為1200mg/L的草甘膦。攜帶該酶編碼序列的煙草宿主細胞可耐受濃度為600mg/L的草甘膦。本發(fā)明提供的基因和表達載體可用于農(nóng)作物的遺傳修飾，達到使植物耐受草甘膦除草劑的目的。
文檔編號C12N9/10GK102925417SQ20121043174
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者邢少辰, 王云鵬, 林春晶, 韋正乙, 馬建, 蔡玉紅, 劉艷芝, 孫卉 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院