專利名稱：松赤枯病病原菌分子檢測的檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病害的分子檢測，涉及松赤枯病的早期快速分子檢測方法，尤其涉及的是一種松赤枯病病原菌分子檢測的引物及其檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
松赤枯病是松樹中、幼林葉部的主要病害，廣泛分布于我國，且有逐漸蔓延擴大之勢。其除為害馬尾松外(Pinus massoniana Lamb),還侵染其它松樹，如云南松(Pinus yunnanensis)、黑松(P. thunbergii)、華山松(Pinus armandii Franch)、黃山松(P. huangshanensis)、濕地松(P. elliottii)、火炬松(P. taeda)、海岸松(P. pinaster) >油松(P. tabulaeformis)、加勒比松(P. caribaea)、島松(P. insular is)、南亞松(P. Iatteri)、落葉松(Larix sp.)、金錢松(Pseudolarix amabilis)。各種寄主中，以馬
尾松、云南松、濕地松、火炬松以及黃山松受害最重，本病常與赤落葉病或落針病同時混生。松赤枯病病原菌是屬半知菌類、黑盤孢目多毛孢屬的枯斑擬盤多毛孢菌(Pestalotiapsisfunerea Desm)。凡松林分布地區(qū)，多有此病為害。被害嚴(yán)重的林分似火燒,提早落葉,嚴(yán)重影響生長，目前在四川的達(dá)縣、宜賓、綿陽、內(nèi)江、南充等地林區(qū)均有松赤枯病的發(fā)現(xiàn)。以往檢測植物真菌病害病原菌主要有形態(tài)學(xué)觀察法。真菌形態(tài)鑒定方法是指通過觀察真菌菌落特征，利用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡等儀器觀察真菌的菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，并比對相關(guān)資料來確定真菌的分類地位。采用常規(guī)直接或培養(yǎng)后鏡檢的形態(tài)學(xué)鑒定方法來發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)病原菌，其操作繁瑣、費時、并且需要高度的專業(yè)知識。尤其對于那些生長條件特殊、形態(tài)相似的菌株要通過傳統(tǒng)的表型特征鑒定方法來加以鑒別顯得非常困難，許多時候只能鑒定到屬這一級別。酶聯(lián)免疫法在國外已經(jīng)形成商品化生產(chǎn)，但是每種病原菌都需要特異的酶標(biāo)記抗體，標(biāo)記過程比較復(fù)雜，價格比較昂貴，且存在假陰性和假陽性問題。基因芯片技術(shù)雖然能夠同時進(jìn)行多種真菌的鑒定，但只局限于已知的常見病原真菌，對非常見菌、突變菌或者新菌種則無能為力，且成本過高。質(zhì)譜技術(shù)在微生物鑒定中具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點，但由于質(zhì)譜鑒定必須是純化培養(yǎng)的單克隆菌落，操作復(fù)雜且所需的專業(yè)技術(shù)要求較高，設(shè)備購置和維護(hù)費高昂。隨著分子生物學(xué)手段的發(fā)展與應(yīng)用，利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)段既具保守性又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴增、測序及序列分析后再設(shè)計特異性引物來檢測真核生物的方法已越來越被廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)作為一種遺傳標(biāo)記(遺傳標(biāo)記是指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性，具有可遺傳性和可識別性。生物中任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物菌種分類與鑒定?，F(xiàn)有方法利用ITS序列對病原真菌進(jìn)行鑒定前，須先經(jīng)過純菌株的分離純化，真菌DNA的提取，PCR擴增以及亞克隆等一系列繁瑣的過程。這種方法存在如下缺點(I)至少需要3-7天時間，費時費力；(2)對目前無法培養(yǎng)或難培養(yǎng)的真菌很難進(jìn)一步鑒定和分析；(3)分離和培養(yǎng)單胞存在較高的技術(shù)難度；(4)繁瑣的真菌DNA提取步驟；(5) PCR擴增片段。這些缺點極大地限制了病原菌的快速鑒定，貽誤了病情。嚴(yán)重影響了林木的正常生長發(fā)育，對林業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種松赤枯病病原分子檢測引物及其檢測試劑盒，以實現(xiàn)對松赤枯病早期的快速檢測。針對目前松赤枯病病原菌在生物學(xué)檢測上所需周期長的問題，通過提取云南松針葉總DNA，針對松赤枯病的ITS堿基特異序列設(shè)計篩選出了一對具有高特異性的引物，用于植物組織的靈敏、快速的病原菌分子試劑盒。該試劑盒可用于松針遭受枯斑擬盤多毛孢菌侵染但在松針上未出現(xiàn)該病的癥狀(病癥、病狀)時快速、靈敏地檢測出是否有該菌存在，從而對松赤枯病引起病害顯癥之前的早期檢測具有十分重要的意義。該松赤枯病病原菌分子檢測的檢測試劑盒，包括以下組分超純水d. d. H2O16μ L ;上游引物 F(5 ' -3' )2μ L :GTCAACCAGCGGAGGGAT ;下游引物 R(5 ' -3' )2μ L CGCCGTTGTATTTCAGGAG ；25μ L Premix。
PCR擴增反應(yīng)采用50 μ I體系，其中5 μ L松針基因組DNA原液，25 μ L Premix，引物各 2 μ L (10 μ mol/L)，ddH20 16 μ L0反應(yīng)在iCycler-PCR儀上進(jìn)行，程序為95°C變性4min ;95°C變性30s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸7min，10°C保存。上述松赤枯病病原特異分子檢測試劑盒體的使用方法Al樣品處理對所采貌似健康的針葉樣品，使用75%的酒精進(jìn)行表面消毒處理后，保存于-70°C備用。A2提取松針總DNA:(I)取l-2g松針轉(zhuǎn)移到滅菌的研缽里，加入2-3次液氮進(jìn)行充分研磨，以下步驟使用的植物基因組DNA提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供。(2)將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μ 165°C預(yù)熱緩沖液GPl的離心管中(實驗前在預(yù)熱的GPl中加入巰基乙醇，使其終濃度為O. I % )，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65°C水浴20分鐘，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。(3)加入700μ1氯仿，充分混勻，
12,OOOrpm(-13, 400Xg)離心5min。(4)小心地將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入700 μ I緩沖液GP2，充分混勻。(5)將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12，000rpm(-13，400Xg)離心30sec，棄掉廢液。(6)向吸附柱CB3中加入500 μ I緩沖液GD, 12，OOOrpm(-13, 400 Xg)離心30sec,倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入600μ I漂洗液PW，12，OOOrpm(-13，400Xg)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(8)重復(fù)操作步驟7。(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(-13, 400 Xg)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。(10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μ I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12，OOOrpm (-13, 400 Xg)離心2min，將溶液收集到離心管中。A3PCR 反應(yīng)將提取的松針基因組DNA作為模板，使用篩選出來的特異性引物進(jìn)行PCR擴增。50 μ L反應(yīng)體系包括:5 μ L松針基因組DNA原液，25 μ L Premix，引物各2 μ L (10 μ mol/L)，ddH20 16 μ L。反應(yīng)在 iCycler-PCR 儀上進(jìn)行，程序為95°C變性 4min ;95°C變性 30s, 56°C復(fù)性30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸7min，10°C保存。本發(fā)明用于松赤枯病病菌分子通過Genbank已有該菌的ITS區(qū)序列(AF405299. I)進(jìn)行設(shè)計，最后篩選出了一對具有高特異性的一對PCR引物(AF-F/R)，該引物的序列為上游引物F (5' -3' ) GTCAACCAGCGGAGGGAT 18bp下游引物R(5' -3/ ) CGCCGTTGTATTTCAGGAG 19bp
A4PCR擴增產(chǎn)物分析將5μ LPCR產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴增出的條帶判斷，如果能特異性地擴增出420bp左右產(chǎn)物，即可判斷云南松松針中存在松赤枯病病菌；反之則不存在該病原菌。本發(fā)明根據(jù)rDNA ITS區(qū)具有種內(nèi)保守、種間變異的特點，以ITS序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異性引物對病原菌進(jìn)行分子檢測。篩選出一對特異性引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，擴增ITS序列，凝聚糖電泳檢測顯示420bp左右的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序后的BLAST比對，證實了從松針中提取的病原菌為枯斑擬盤多毛孢。此方法大大提高了病原菌的鑒定效率，對于松赤枯病引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測具有十分重要的意義。具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果
(I)操作簡便快速本實驗方法對樣品進(jìn)行簡單處理、PCR擴增和常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳后即可以判斷結(jié)果，一般整個檢測過程可在7個小時內(nèi)完成。相對于之前通過PCR方法鑒定植物病原菌的方法(至少需要3-7天)而言，省去了菌株的分離純化、菌株的培養(yǎng)、菌絲DNA的提取以及亞克隆等繁瑣過程，減少了技術(shù)難度，省力省時，還能鑒定出不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)的病原菌，大大提高了鑒定的效率和范圍。(2)特異性強本發(fā)明檢測方法是利用松赤枯病的rDNA基因ITS區(qū)具有種內(nèi)保守、種間變異的特點，篩選出特異性強的引物以及優(yōu)化反應(yīng)體系。對枯斑擬盤多毛孢菌引起的松赤枯病具有很強的特異性。為有針對性地開展松赤枯病的防治，及時解決松赤枯病問題提供了強有力的技術(shù)支持。


圖I為實施例I中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；M DL2000Marker ;1_3 :松針尖部；4-6 :松針中部；7-9 :松針基部圖2為實施例2中擴增幾種樹棲真菌菌絲DNA的電泳圖譜；M DL2000Marker ；1 枯斑擬盤多毛孢菌；2 CK ；3 :星形擬盤多毛孢菌；4 :散沫擬盤多毛孢菌；5 :針葉樹散斑殼菌；6 :松針散斑殼菌；7 :尖孢鐮刀菌圖3本發(fā)明快速鑒定松赤枯病快速檢測的方法流程圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例I :植物組織中松赤枯病的檢測(I)貌似健康的樣品經(jīng)表面消毒處理后，按葉尖、葉中、葉基剪成三份，分別轉(zhuǎn)移到滅菌的研缽里，用液氮研磨法結(jié)合植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，該樣品的總DNA作為下一步PCR的模版；(2)通過Genbank已有該菌的ITS區(qū)序列(AF405299. I)進(jìn)行設(shè)計，最后篩選出了一對具有高特異性的一對PCR引物(AF-F/R)，分別為上游引物F (5' -3' ) GTCAACCAGCGGAGGGAT 18bp下游引物R(5' -3/ ) CGCCGTTGTATTTCAGGAG 19bp(3) PCR反應(yīng)體系50 μ L包括5 μ L松針基因組DNA原液，25 μ L Premix，引物各2 μ L(10 μ mol/L), ddH20 16 μ L0 反應(yīng)在 iCycler-PCR 儀上進(jìn)行，程序為95°C 變性 4min ;95°C變性30s，56。。復(fù)性30s，72。。延伸lmin，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸7min，10°C 保存。(4)PCR反應(yīng)后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，見到一條清晰的分子量為420bP的特異條帶，因而判斷發(fā)病組織感染松赤枯病病菌(如圖I所示)，將產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序，測序樣品共15個，共得到8條理想的序列，將整理好的序列復(fù)制到Genbank庫中并使用BLAST軟件進(jìn)行比對，比對結(jié)果，可以確定枯斑擬盤多毛孢菌侵染了樣本中的松針葉。實施例2 :引物對松赤枯病的特異性擴增PCR反應(yīng)體系50yL包括5yL松針基因組DNA原液，25yL Premix，引物各2 μ L(10 μ mol/L), ddH20 16 μ L0 反應(yīng)在 iCycler-PCR 儀上進(jìn)行，程序為95°C 變性 4min ;95°C變性30s，56。。復(fù)性30s，72。。延伸lmin，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸7min，10°C保存。檢測結(jié)果檢測的特異性使用引物AF-F/R對松赤枯病和實驗室存有的已報道過的樹棲真菌菌絲DNA同時進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)結(jié)果見圖2)，擴增出的420bp左右的條帶，而對星形擬盤多毛孢菌(Pestalotiapsis Iespedezae)、散沫擬盤多毛孢菌(Pestalotiapsis Iawsoniae)、針葉樹散斑殼菌(Lophodermi μ m conigen μ m)、松針散斑殼菌(Lophodermiym pinastri)、尖孢鐮刀菌(Fusariymoxysporym)擴增的結(jié)果條帶較暗或無條帶，可以看出AF引物對枯斑擬盤多毛孢菌具有較強的特異性。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.ー種松赤枯病病原菌分子檢測的檢測試劑盒，其特征在于，包括以下組分超純水 d. d. H20 16 μ L ;上游引物 F (5 ' -3 ' ) 2 μ L: GTCAACCAGCGGAGGGAT ;下游引物R(5' -3/ ) 2 yL: CGCCGTTGTATTTCAGGAG ；25 μ L Premix。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子檢測試劑盒體的使用方法，其特征在于，包括以下步驟 A1樣品處理；A2提取松針總DNA; A3 PCR反應(yīng)；將提取的松針基因組DNA作為模板，使用篩選出來的特異性引物進(jìn)行PCR擴增。50 UL反應(yīng)體系包括5 μ L松針基因組DNA原液，25 μ L Premix，引物各2 yL(10 ymol/L), ddH20 16 μし反應(yīng)在iCycler-PCR儀上進(jìn)行，程序為95で變性4min;95°C變性30 s，56で復(fù)性30 s，72 °C延伸1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72 °C延伸7 min, 10 V保存； A4 PCR擴增產(chǎn)物分析將5 μ L PCR產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化こ錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴增出的條帶判斷，如果能特異性地擴增出420bp左右產(chǎn)物，即可判斷云南松松針中存在松赤枯病病菌；反之則不存在該病原菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種松赤枯病病原菌分子檢測的檢測試劑盒及其使用方法，包括以下組分超純水d.d. H2O 16 μL；上游引物F(5′-3′) 2 μL: GTCAACCAGCGGAGGGAT；下游引物R(5′-3′) 2 μL: CGCCGTTGTATTTCAGGAG；25 μL Premix。本發(fā)明對松赤枯病檢測快速，而且靈敏度高，應(yīng)用于早期病害檢測，為有針對性地開展松赤枯病的防治，及時解決松赤枯病問題提供了有力的技術(shù)支持。
文檔編號C12Q1/68GK102952883SQ20121043114
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者劉應(yīng)高, 潘欣, 張巖, 袁川, 王歡, 僬天敏, 朱天輝 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)