專利名稱：一種基于位點(diǎn)特異性重組的rna干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別涉及一種基于位點(diǎn)特異性重組的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。在動(dòng)物中，RNAi可以通過U6啟動(dòng)表達(dá)shRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前的U6載體可以通過2種方式表達(dá)在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)瞬時(shí)表達(dá)以及穩(wěn)定表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)主要是通過插入基因組中實(shí)現(xiàn)的。目前主要通過Gateway技術(shù)或者是載體隨機(jī)插入宿主細(xì)胞基因組來(lái)完成。這些技術(shù)的缺陷是無(wú)法進(jìn)行插入位置的直接準(zhǔn)確定位，并且隨機(jī)插入可能影響目的基因的表達(dá)。

為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中插入基因組位置的準(zhǔn)確定位以及不影響相關(guān)基因的表達(dá)，本發(fā)明通過U6啟動(dòng)子與同源打靶技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)豬源細(xì)胞的精確打靶，并為篩選提供了方便，同時(shí)可預(yù)期插入片段后對(duì)基因表達(dá)的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是結(jié)合位點(diǎn)特異性同源重組與RNA干擾(RNAi)技術(shù)所發(fā)明的特異性插入豬β 3內(nèi)含子區(qū)域的新型RNAi載體。此處，U6啟動(dòng)子結(jié)合同源打靶技術(shù)，使得基因組定位更加方便快捷，并且可以確保所篩選工程細(xì)胞的目的基因表達(dá)不受影響。為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段本發(fā)明的一種基于位點(diǎn)特異性重組的RNA干擾載體，其特征在于從5’端開始，包括以下依次相連的各部分與豬的整合素受體β 3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域上游進(jìn)行同源重組的同源重組臂1、人U6啟動(dòng)子序列、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列、含有PCMV啟動(dòng)子的新霉素抗性基因、與豬的整合素受體β 3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域下游進(jìn)行同源重組的同源重組臂2、復(fù)制起始位點(diǎn)基因、氨芐青霉素抗性篩選基因以及用于載體線性化的酶切位點(diǎn)，所述的豬的整合素受體β 3基因的GeneBank登錄號(hào)為NC_010454. 3。其中同源重組臂1、2用于與豬的整合素受體β 3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行同源重組；人 啟動(dòng)子用于表達(dá)目的shRNA，用于穩(wěn)定RNAi ；PCMV-NEO:用于抗G418抗性細(xì)胞的篩選；復(fù)制起始位點(diǎn)(Origin)提供載體在大腸桿菌中的復(fù)制信息；Amp promoter-Amp用于篩選陽(yáng)性克隆或者是菌體的大量增殖；位于人U6啟動(dòng)子序列以及人U6終止子序列之間的多克隆酶切位點(diǎn)用于酶切暴露U6啟動(dòng)子與終止信號(hào)之間的粘性末端，便于插入目的
ds oligoo
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的與豬的整合素受體￠3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域上游進(jìn)行同源重組的同源重組臂I是以提取自豬肝組織的DNA為模板，通過使用以下引物擴(kuò)增得到的引物F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3 ’引物R : 5，-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；所述的與豬的整合素受體P 3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域下游進(jìn)行同源重組的同源重組臂2是以提取自豬肝組織的DNA為模板，通過使用以下引物擴(kuò)增得到的引物F : 5 ’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3 ’引物R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建以上任一項(xiàng)所述的RNA干擾載體的方法，其特征在于包括以下步驟(I)同源臂的構(gòu)建以提取自豬肝組織的DNA為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別用來(lái)擴(kuò)增同源重組所使用的同源重組臂I以及同源重組臂2 擴(kuò)增同源重組臂I所用的引物為F: 5，-AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3’R:5， -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；同源重組臂2所用的引物為F:5， -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，?？寺〉玫降钠畏謩e連接到PMD20-T載體上，得到分別連有同源重組臂I和同源重組臂2的重組載體PMD20-T-HA1及PMD20-T-HA2 ；(2)人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列的構(gòu)建以含人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列的載體為模板，PCR擴(kuò)增得到含有人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子的片段，將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，構(gòu)建得到PMD20-T-U6 ；(3)正篩選基因的構(gòu)建新霉素抗性基因NEO以及PCMV啟動(dòng)子在載體PGT-Vl上克隆，NEO的擴(kuò)增引物為F: 5，-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3，R:5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’ ；

PCMV啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物為F: 5 ’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3，R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ；(4)骨架載體的構(gòu)建合成多克隆位點(diǎn)，并將其亞克隆到pUC57載體上，構(gòu)建骨架載體TOC57-MCS，多克隆位點(diǎn)序列如SEQ ID NO. 2或圖13所示；(5)元件組裝①利用PMD20-T-HA2載體上的spel與BamHI位點(diǎn)酶切后，將同源重組臂2連接到骨架載體PUC57-MCS上，構(gòu)建成為載體pUC57-2 ；②PCMV與NEO基因的組裝將克隆到的PCMV與NEO基因膠回收后，利用基因上的XmaI酶切位點(diǎn)將兩個(gè)基因拼接成為PCMV-NE0，將PCMV-NEO克隆到載體pUC57_2上，構(gòu)建成為載體pUC57-N2 ；③利用PMD20-T-U6 上的 AgeI 與 SalI 以及 PMD20-T-HA1 上的 XmaI 與 SalI 位點(diǎn)，將 HAl 克隆到 PMD20-T-U6 上，構(gòu)建成 PMD20-T-HA1-U6 ;利用 PMD20-T-HA1-U6 上的 SalI 與ClaI位點(diǎn)將目的片段HA1-U6克隆到pUC57-N2上，構(gòu)建成為目的載體PSN-U6。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中構(gòu)建得到的含有人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子的片段的序列如SEQ ID NO. 3所示。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了以上任一項(xiàng)所述的RNA干擾載體在構(gòu)建豬源細(xì)胞RNAi表達(dá)載體中的應(yīng)用。在使用本發(fā)明的載體構(gòu)建豬源細(xì)胞RNAi表達(dá)載體時(shí)，包括以下步驟1、根據(jù)需要選擇多克隆位的酶切位點(diǎn)，雙酶切載體，暴露PSN-U6上的U6啟動(dòng)子與終止信號(hào)之間的粘性末端。2、合成轉(zhuǎn)錄shRNA所需的DNA序列，例如步驟I如當(dāng)選用Clal、SfiI作為酶切位點(diǎn)時(shí)，符合本載體的ds-oligo (DNA)如圖11所示3、將合成的片段與酶切后的PSN-U6連接，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序引物為5’ -G GACTATCATA TGCTTACCG-3’。

4、大量獲得陽(yáng)性菌液，大提質(zhì)粒。5、使用載體上自帶的合適的平末端酶切位點(diǎn)，酶切載體，使之線性化。6、電擊轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆。通過southern雜交驗(yàn)證目的片段摻入基因組的拷貝數(shù)，利用PCR引物驗(yàn)證是否同源插入基因組的特異性位置。


圖1為重組載體PMD20-T-HA1的載體圖譜；圖2為重組載體PMD20-T-HA2的載體圖譜；圖3為重組載體PMD20-T-U6的載體圖譜；圖4為PCMV與NEO的連接片段；圖5為重組載體PUC57-MCS的載體圖譜；圖6為重組載體pUC57-2的載體圖譜；圖7為重組載體pUC57-N2的載體圖譜；圖8為重組載體PMD20-T-HA1-U6的載體圖譜；圖9為重組載體PSN-U6的載體圖譜；圖10為構(gòu)建具有同源重組能力的RNA干擾載體PSN-U6的簡(jiǎn)要流程圖；圖11為符合本載體的ds-oligo (DNA)示意圖；圖12為本發(fā)明實(shí)施例中合成轉(zhuǎn)錄shRNA所需的DNA序列；圖13為合成的多克隆位點(diǎn)序列示意圖14為鑒定出陽(yáng)性克隆的PCR膠塊圖；圖15為southern實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖16為工程細(xì)胞及正常參考細(xì)胞中α V的mRNA水平比較；圖17為mRNA擴(kuò)增曲線圖；圖18為mRNA溶解曲線圖；圖19為mRNA相對(duì)表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍 內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1 一種基于位點(diǎn)特異性重組的RNA干擾載體的構(gòu)建方法1、實(shí)驗(yàn)材料豬肝臟組織購(gòu)于甘肅某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)基地i a v-pENTR/U6載體由本實(shí)驗(yàn)室保存PGT-Vl 由西北農(nóng)林科技大學(xué)王華巖老師贊助使用多克隆酶切位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中用到相關(guān)引物由上海生物工程有限公司合成試驗(yàn)中用到的各種試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，另XmaI與AgeI購(gòu)自NEB公司。2、方法2.1載體的構(gòu)成載體的構(gòu)成如PSN-U6結(jié)構(gòu)圖譜圖9所示，其功能介紹如下HAU ΗΑ2 :用于與豬基因組β 3基因某單一內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行同源重組hU6 (人U6啟動(dòng)子)用于表達(dá)目的shRNA，用于穩(wěn)定RNAiPCMV-NEO:用于篩選抗G418抗性細(xì)胞篩選Origin :載體在大腸桿菌中的復(fù)制信息Amp promoter-amp :用于篩選陽(yáng)性克隆或者是菌體的大量增殖Nru1、Srf1:用于轉(zhuǎn)染前，線性化載體ClaI, Sfi1:用于酶切暴露U6啟動(dòng)子與終止信號(hào)之間的粘性末端，便于插入目的
ds OligO03.1載體基因原件的克隆3.1.1同源臂的構(gòu)建在NCBI中篩選豬基因組中符合要求的內(nèi)含子區(qū)域，最后確定使用豬的整合素受體β3基因(GeneBank登錄號(hào)為NC_010454. 3)的某一特定的內(nèi)含子區(qū)域。針對(duì)單一內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別用來(lái)擴(kuò)增同源重組所使用的長(zhǎng)臂以及短臂。擴(kuò)增長(zhǎng)臂(HAl)所用的引物為F: 5，-AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3’R:5， -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，；
擴(kuò)增短臂(HA2)所用的引物為F:5， -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R : 5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。長(zhǎng)臂與短臂的長(zhǎng)度分別為7036bp、2424bp。長(zhǎng)臂的擴(kuò)增程序?yàn)?4 °C lmin、58°C 50s,72°C 8min(30cycles)；72°C 8min(over)。短臂的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C lmin、59°C 50s、72°C 3min (30cycles) ；72°C 3min (over)。擴(kuò)增所使用的目的基因組來(lái)源為豬肝臟組織。并將克隆得到的片段分別連接到PMD20-T載體上，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，最終得到分別連有長(zhǎng)臂和短臂的重組載體PMD20-T-HA1及PMD20-T-HA2，其載體圖譜如圖1、圖2所示。3.1. 2人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列的構(gòu)建以實(shí)驗(yàn)室以前構(gòu)建的含有a V干擾片段的U6載體為模板擴(kuò)增含有人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列的片段，所使用的擴(kuò)增引物為F: 5 ’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3，R : 5 ’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，。擴(kuò)增長(zhǎng)度為289bp，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C lmin,55 °C 50s,72 °C 3min (30cycles)；72°C 3min (over).將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，克隆得到的含有人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子的片段序列如SEQ IDN0. 3所示，其中所含有的多克隆酶切位點(diǎn)為Clal、Sfil，構(gòu)建得到PMD20-T-U6，其載體圖譜如圖3所示。3.1. 3正篩選基因的構(gòu)建正篩選基因(新 霉素抗性基因NE0)以及PCMV啟動(dòng)子在載體PGT-Vl上克隆。NEO的擴(kuò)增引物為F:5’ -ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3’ R :5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC -3，;其擴(kuò)增程序?yàn)?94°C lmin、59°C 50s,72°C lmin30s (30cycles) ；72°C 8min(over);長(zhǎng)度為 1226bp。PCMV 的擴(kuò)增引物為 F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’ R :5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ；其擴(kuò)增程序?yàn)?94°C lmin、57°C 50s,72°C lmin (30cycles) ；72°C 8min (over);長(zhǎng)度為 615bp, PCMV 與 NEO 的連接片段如圖4所示。3.1. 4骨架載體的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)根據(jù)所得到各個(gè)基因原件的基因序列，設(shè)計(jì)不存在于這些基因上的酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，將多克隆位點(diǎn)送上海生工合成，并將其亞克隆到PUC57載體上，構(gòu)建骨架載體PUC57-MCS，多克隆位點(diǎn)序列如SEQ ID NO. 2或圖13所示，PUC57-MCS載體圖譜如圖5所示。3.1. 5元件組裝通過如附圖10所示的步驟進(jìn)行基因的亞克隆將各基因原件組裝到骨架載體PUC57-MCS 上。(I)利用PMD20-T-HA2載體上的spel與BamHI位點(diǎn)酶切后，將短臂連接到骨架載體PUC57-MCS上，構(gòu)建成為載體PUC57-2，送測(cè)序驗(yàn)證，載體圖譜如圖6所示。⑵PCMV與NEO基因的組裝將克隆到的PCMV與NEO基因膠回收后，利用基因上的XmaI酶切位點(diǎn)將兩個(gè)基因拼接成為PCMV-NE0，利用設(shè)計(jì)引物時(shí)，PCMV-NEO上所包含的BamHI與NheI以及pUC57_2上面的BglII與Spel，將PCMV-NEO克隆到載體pUC57_2上，構(gòu)建成為載體PUC57-N2，送測(cè)序驗(yàn)證，載體圖譜如圖7所示。
(3)利用 PMD20-T-U6 上的 AgeI 與 Sail 以及 PMD20-T-HA1 上的 XmaI 與 SalI 位點(diǎn)，將HAl克隆到PMD20-T-U6上，構(gòu)建成PMD20-T-HA1-U6，送測(cè)序驗(yàn)證，載體圖譜如圖8所示。利用PMD20-T-HA1-U6上的SalI與ClaI位點(diǎn)將目的片段HA1-U6克隆到pUC57_N2上，構(gòu)建成為目的載體PSN-U6，并且進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，載體圖譜如圖9所示，載體的序列如SEQ IDNO.1所示。各個(gè)亞克隆步驟中每個(gè)載體所使用的限制性內(nèi)切酶及反應(yīng)條件如表I所示。表I各個(gè)亞克隆步驟中每個(gè)載體所使用的限制性內(nèi)切酶及反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種基于位點(diǎn)特異性重組的RNA干擾載體，其特征在于所述的干擾載體依次包括以下相連的各部分與豬的整合素受體β 3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域上游進(jìn)行同源重組的同源重組臂1、人U6啟動(dòng)子序列、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列、含有PCMV啟動(dòng)子的新霉素抗性基因、與豬的整合素受體β 3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域下游進(jìn)行同源重組的同源重組臂2、復(fù)制起始位點(diǎn)基因、氨芐青霉素抗性篩選基因以及用于載體線性化的酶切位點(diǎn)，所述的豬的整合素受體β 3基因的GeneBank登錄號(hào)為NC_010454. 3。
2.如權(quán)利要求1所述的RNA干擾載體，其特征在于所述的與豬的整合素受體β3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域上游進(jìn)行同源重組的同源重組臂I是以提取自豬肝組織的DNA為模板，通過使用以下引物擴(kuò)增得到的引物 F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3，引物 R :5，-CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3，； 所述的與豬的整合素受體β3基因上某單一內(nèi)含子區(qū)域下游進(jìn)行同源重組的同源重組臂2是以提取自豬肝組織的DNA為模板，通過使用以下引物擴(kuò)增得到的引物 F :5’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’引物 R :5’ -CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3’。
3.如權(quán)利要求1或2所述的RNA干擾載體，其特征在于所述的載體的核苷酸序列如SEQID NO.1 所示。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的RNA干擾載體的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)同源臂的構(gòu)建 以提取自豬肝組織的DNA為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別用來(lái)擴(kuò)增同源重組所使用的同源重組臂I以及同源重組臂2 擴(kuò)增同源重組臂I所用的引物為 F: 5 ’ -AAGTCCGGCAGGTGGAGGATTACC-3，R:5’ -CCCAGTGCTGGTTATCACATGGC-3’ ； 同源重組臂2所用的引物為 F :5’ -GGCCATGTGATAACCAGCACTGGGA-3’R :5，-CCCCCTTGTAGTGGACACAGGAGA-3，。
克隆得到的片段分別連接到PMD20-T載體上，得到分別連有同源重組臂I和同源重組臂 2 的重組載體 PMD20-T-HA1 及 PMD20-T-HA2 ； (2)人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列的構(gòu)建 以含人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列的載體為模板，PCR擴(kuò)增得到含有人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列的片段，將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，構(gòu)建得到PMD20-T-U6 ； (3)正篩選基因的構(gòu)建 新霉素抗性基因NEO以及PCMV啟動(dòng)子以載體PGT-Vl為模板進(jìn)行克隆，NEO的擴(kuò)增引物為F: 5 ’ -ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3， R:5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’ ；PCMV啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物為F: 5 ’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3，R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ； (4)骨架載體的構(gòu)建 合成多克隆位點(diǎn)，并將其亞克隆到PUC57載體上，構(gòu)建骨架載體PUC57-MCS，多克隆位點(diǎn)序列如SEQ ID NO. 2所示； (5 )元件組裝 ①利用PMD20-T-HA2載體上的SpeI與BamHI位點(diǎn)酶切后，將同源重組臂2連接到骨架載體pUC57-MCS上，構(gòu)建成為載體pUC57-2 ； ②PCMV與NEO基因的組裝將克隆到的PCMV與NEO基因膠回收后，利用基因上的XmaI酶切位點(diǎn)將兩個(gè)基因拼接成為PCMV-NE0，將PCMV-NEO克隆到載體pUC57_2上，構(gòu)建成為載體 pUC57-N2 ； ③利用PMD20-T-U6上的AgeI與SalI以及PMD20-T-HA1上的XmaI與SalI位點(diǎn)，將HAl克隆到 PMD20-T-U6 上，構(gòu)建成 PMD20-T-HA1-U6 ;利用 PMD20-T-HA1-U6 上的 SalI 與 ClaI 位點(diǎn)將目的片段HA1-U6克隆到pUC57-N2上，構(gòu)建成為目的載體PSN-U6。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(2)中構(gòu)建得到的含有人U6啟動(dòng)子、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子的片段的序列如SEQ ID NO. 3所示。
6.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的RNA干擾載體在構(gòu)建豬源細(xì)胞RNAi表達(dá)載體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于位點(diǎn)特異性重組的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的干擾載體依次包括以下相連的各部分與豬的整合素受體β3基因的某單一內(nèi)含子區(qū)域上游進(jìn)行同源重組的同源重組臂1、人U6啟動(dòng)子序列、多克隆酶切位點(diǎn)、人U6終止子序列、含有PCMV啟動(dòng)子的新霉素抗性基因、與豬的整合素受體β3基因的某單一內(nèi)含子區(qū)域下游進(jìn)行同源重組的同源重組臂2、復(fù)制起始位點(diǎn)基因、氨芐青霉素抗性篩選基因以及用于載體線性化的酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的干擾載體實(shí)現(xiàn)了對(duì)豬源細(xì)胞基因組的精確打靶，并為篩選提供了方便，同時(shí)還可預(yù)期插入片段后對(duì)基因表達(dá)的影響，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了方便。
文檔編號(hào)C12N15/85GK103060374SQ20121042478
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月30日
發(fā)明者?；菔|, 馬延濱, 叢國(guó)正, 高閃電, 獨(dú)軍政, 邵軍軍, 林彤, 郝春霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所